摘要： 细胞培养上清（Conditioned Cell Culture Medium，CCM）是MSC-EV、细胞外囊泡及其他细胞来源EV制备中常见的起始样本，但随着培养规模扩大，CCM同时具有体积大、EV颗粒相对稀释、游离蛋白负荷高以及浓缩后黏度升高等特点，使实验室规模纯化方法很难直接平移至中试阶段。IZON Science公开海报展示了一套以qEV TFF切向流过滤和qEV220尺寸排阻色谱SEC联合使用的工作流，通过CCM稀释与澄清、TFF预浓缩和缓冲液置换，再进入qEV220进行蛋白去除和EV富集，并利用qEV Zenco实现自动流速控制、UV监测和馏分收集。海报数据显示，在对应CCM体系中可获得约15倍纯度提升和约96%蛋白去除，同时多轮自动化运行的洗脱曲线保持较高一致性。本文围绕这套SEC-TFF工作流的工艺逻辑、数据变化和规模化意义进行系统解析。
关键词：外泌体、细胞外囊泡、CCM、细胞培养上清、SEC、尺寸排阻色谱、TFF、切向流过滤、qEV220、qEV TFF、qEV Zenco、Exoid、TRPS、外泌体规模化纯化
一、为什么CCM到了中试规模之后会突然变得难处理
细胞培养上清是外泌体和细胞外囊泡研究中非常重要的起始材料，尤其是在MSC-EV、工程化细胞EV和其他细胞来源囊泡的规模化生产中，上游培养规模一旦从实验室培养瓶进入数升甚至数十升体系，下游纯化首先面对的并不是"有没有EV"，而是如何从大量培养液中把相对稀释的EV稳定地富集出来，同时尽可能降低培养基蛋白、细胞分泌蛋白、小分子和其他非目标组分带来的背景。实验室阶段可以依赖小体积离心、沉淀或小规格SEC，但当样本量扩大后，同样的方法会迅速面临处理时间、柱容量、人工操作和批次重复性等限制。
CCM的第一个难点是体积大而EV颗粒浓度相对较低 。如果直接将数升甚至更大体积的CCM连续上样SEC，不仅耗时，而且需要非常大的层析容量，整个工艺效率较低。第二个难点是蛋白负荷高 ，培养基中原有蛋白和细胞分泌蛋白会共同进入条件培养液，这些非EV蛋白会影响后续颗粒纯度、蛋白组学、功能实验和质量分析。第三个难点是浓缩后黏度可能进一步上升，如果直接把高度浓缩样本加入SEC柱，可能导致流速、柱床状态和重复性受到影响。
因此，对于规模化CCM，纯化流程更适合拆成几个具有明确功能的工艺步骤：首先把样本调整到更适合处理的状态，随后用TFF解决大体积和低颗粒浓度的问题，再用SEC解决大量游离蛋白和小分子污染物的问题。IZON相关EV纯化、qEV和颗粒分析技术资料可参考IZON外泌体与纳米颗粒技术资料。
二、这项研究为什么同时使用TFF和SEC
TFF和SEC在EV纯化中的功能并不相同。切向流过滤TFF依靠膜截留实现大体积样本浓缩和缓冲液置换，更适合解决"样本太多、EV太稀"的问题；尺寸排阻色谱SEC则依据颗粒和蛋白分子在多孔填料中的迁移差异进行分离，更适合解决"已经浓缩，但蛋白背景仍然很高"的问题。把两种方法串联起来，本质上就是把"浓缩"和"精纯"拆成两个分别优化的单元操作。
IZON Science公开海报《Translating EV Isolation to Pilot Scale: A Validated SEC-TFF Workflow for High-Purity Processing Across Diverse Biofluids》使用三类理化性质不同的生物基质评估该工作流，包括鲜羊奶、高度浓缩且高黏度的CCM以及冻存血浆。对于CCM，工作流主要包括预处理澄清、qEV TFF浓缩和换液，以及后续qEV220 SEC纯化。颗粒浓度使用Exoid可调电阻脉冲传感技术TRPS进行测定，蛋白浓度通过BCA方法检测，并进一步以颗粒数与蛋白量之间的比值评价纯度变化。
| 阶段 | 操作 | 关键设备/耗材 | 目的 |
|---|---|---|---|
| 预处理 | 5×稀释→澄清→qEV TFF10×浓缩 | qEV TFF（推荐300kDa MWCO膜） | 降低黏度、去除细胞碎片与大颗粒、富集EV、完成缓冲液置换 |
| SEC纯化 | qEV220（35nm或70nm树脂） | qEV220大规格SEC柱+qEV Zenco | 利用尺寸排阻色谱去除游离蛋白与小分子杂质，获得高纯度EV |
| SEC纯化 | UV在线监测+自动馏分收集 | qEV Zenco自动化层析系统 | 稳定流速、自动截取EV富集峰、生成可追溯工艺报告 |
表1：CCM样本SEC-TFF工作流中的主要步骤。
图1：CCM样本的qEV220工作流总览。
三、第一步为什么先进行5×稀释和澄清
对于已经高度浓缩或黏度较高的CCM，研究没有直接进入TFF或者SEC，而是先进行5×稀释。这个步骤看起来似乎与"后面还要浓缩"相矛盾，但从工艺角度其实是在改善样本可操作性。高度黏稠的样本会增加膜过滤和层析过程中的传质阻力，使过滤压力、流速和系统稳定性更难控制，而适度稀释能够降低黏度，为后续澄清和TFF创造更稳定的进料条件。
稀释之后进一步进行澄清，目的是去除细胞碎片、大颗粒聚集物和其他可能堵塞膜或者影响SEC柱床的组分。如果这些大颗粒直接进入TFF或SEC，不仅可能影响膜通量，也可能缩短后续层析柱使用周期。因此，在规模化EV纯化中，"预处理"并不是可有可无的附加步骤，而是帮助后续核心单元稳定运行的重要前提。
四、TFF的任务是把大体积CCM转换成适合SEC处理的体积
澄清后的CCM进一步使用qEV TFF进行约10×浓缩。按照原海报工作流，TFF阶段推荐使用300 kDa MWCO膜，其作用重点是保留相对较大的EV颗粒，同时让部分更小的可透过物质进入滤过液，并通过浓缩和换液降低总体样本体积。
这里最容易产生的误解是把TFF理解成"已经完成EV纯化"。实际上，从本研究的数据可以看到，TFF最显著的结果是颗粒浓度大幅提高，而颗粒/蛋白纯度并没有同步大幅提升。这非常符合TFF的工艺定位：它首先解决的是体积管理和EV富集，而不是承担最终深度蛋白去除任务。
海报数据中，澄清后的颗粒浓度为1.51×10¹2 particles/mL，而Post-TFF阶段达到1.81×10¹3 particles/mL，说明颗粒被显著浓缩；与此同时，蛋白浓度也由14307 µg/mL上升至86619 µg/mL，因此颗粒/蛋白比从1.06×108提升至2.09×108，变化幅度相对有限。换句话说，TFF同时把EV和相当一部分蛋白一起浓缩了，这也解释了为什么后续仍然需要SEC完成精纯。
五、qEV220为什么承担真正的高负荷蛋白去除
完成TFF之后，样本体积已经更适合进入大规格SEC。研究中的CCM采用qEV220 35 nm树脂，原文同时指出实际树脂孔径可根据目标EV尺寸和纯度需求选择35 nm或70 nm配置。SEC的基本原理是尺寸排阻：体积较大的EV难以充分进入树脂内部孔道，因此更快通过柱床并较早洗脱，而更小的游离蛋白和其他分子则进入更多孔道、在柱中停留更长，从而实现不同尺寸组分的时间分离。
在海报对应CCM处理中，qEV220用于处理5.4 L客户预浓缩样品，纯化后收集液为9.9 L。这里纯化后的总体积增加，并不代表样本"重新变差"，而是SEC本身需要使用缓冲液进行洗脱，因此目标EV会被收集在更大的洗脱体积中。真正需要观察的是蛋白负荷和颗粒/蛋白纯度的变化。
海报报告，在这一流程后实现了约15倍纯度提升 和约96%蛋白去除。这也体现了TFF和SEC之间非常明确的功能分工：前者把大体积样本转换为可以进入层析的进料，后者才真正负责进一步拉开EV与高丰度游离蛋白之间的差距。
六、把四个处理阶段放在一起看，才能理解工艺中的颗粒和蛋白去了哪里
海报提供了CCM从粗样品、澄清、TFF到qEV纯化的完整数据链，因此可以直接观察不同单元操作对颗粒浓度、蛋白浓度和颗粒/蛋白比的影响。以下数值按照原海报及原稿格式保留：
| 处理步骤 | 颗粒浓度(particles/mL) | 蛋白浓度(µg/mL) | 纯度(particles/µg protein) |
|---|---|---|---|
| Raw（粗样品） | 1.30×10¹3 | 15300 | 8.5×108 |
| Clarified（澄清后） | 1.51×10¹2 | 14307 | 1.06×108 |
| Post-TFF（TFF浓缩后） | 1.81×10¹3 | 86619 | 2.09×108 |
| qEV Purified（qEV纯化后） | 8.68×10¹2 | 6000 | 1.29×10⁹ |
表2：CCM（qEV220）各处理步骤颗粒浓度、蛋白浓度与纯度变化。
这些数据最值得关注的不是某一行单独数值，而是不同单元操作之间的功能差异。澄清阶段去除大颗粒和细胞碎片，因此颗粒浓度下降并不意外；进入TFF后，颗粒和蛋白同时被浓缩，因此颗粒浓度显著回升，而蛋白浓度也同步升高；进入qEV220之后，颗粒浓度由于SEC洗脱稀释从1.81×10¹3下降到8.68×10¹2 particles/mL，但蛋白浓度从86619显著降至6000 µg/mL，最终颗粒/蛋白纯度提升至1.29×10⁹ particles/µg protein。
因此，如果只比较TFF前后的颗粒浓度，很容易认为TFF已经完成了主要纯化工作；但真正把蛋白背景降下来的步骤，是后续SEC。对于复杂CCM而言，这也说明"EV浓度高"和"EV纯度高"是两个不同的问题，需要通过不同工艺单元解决。
七、为什么中试规模必须引入自动化馏分收集
实验室使用小规格SEC柱时，研究人员可以人工计时、人工收集馏分并根据固定体积获取EV富集区间，但当样本进入数升规模、并且需要多次连续运行时，人工操作会迅速成为批次误差来源。流速略有变化、馏分切换时间不同或者操作人员判断差异，都可能影响最终EV富集馏分的组成。
qEV Zenco的作用就是把SEC运行中的流速控制、UV在线监测和馏分收集自动化，使每一轮运行按照更统一的参数执行。海报中展示了qEV220连续多轮运行的UV洗脱曲线，整体具有较高一致性。
图2：qEV220连续运行多轮UV吸收峰。
原稿对该自动化重复运行次数存在两种表述：前文写到qEV Zenco"连续运行22次"，后续稳健性总结则以"20次连续运行"作为验证结论。本文不对两处数字做额外推断，具体运行次数应以原始海报图表和正式实验记录为准；二者共同支持的核心信息是，多轮运行的洗脱曲线表现出较高重复性。
八、为什么自动化重复性比单次高纯度数据更重要
对于外泌体药物开发或者中试工艺而言，单次实验获得非常高的纯度只能证明"这一次可以做到"，而规模化生产真正需要回答的是下一批、下一轮甚至更换操作人员后是否还能得到类似结果。因此，当SEC逐渐进入中试规模之后，层析柱重复运行性能、流速控制、自动馏分收集和过程数据记录的重要性会明显提升。
多轮UV洗脱曲线保持相似，意味着至少从层析运行行为上观察不到明显的快速柱效漂移，也说明自动化系统能够重复执行相近的过程条件。这类数据对于进一步建立层析循环次数、柱使用寿命、清洗再生策略和工艺控制范围具有参考价值。
但需要注意的是，多轮洗脱曲线一致并不能单独等同于"已经完成GMP工艺验证"。真正进入更严格生产体系，还需要根据项目进一步建立回收率、残留杂质、EV身份、效力、清洁验证、柱寿命、批间一致性及其他关键质量和过程控制指标。因此，更准确的理解是：自动化和多轮重复运行，为后续更加规范的工艺开发提供了工程化基础。
九、qEV10、qEV220和qEV500代表的是同一技术路线的规模扩展思路
海报研究并不只展示单一qEV220柱，而是讨论从qEV10到qEV500的大规格SEC体系。这种设计对于工艺开发的重要意义，是研究人员可以在较小规模先确认SEC分离逻辑和目标馏分，再随着上游样本体积增加逐步切换到更大的层析柱，而不需要在放大阶段完全更换纯化原理。
从方法开发角度看，这种"同一分离机制、不同处理规模"的路线有利于减少小试与中试之间的方法学变化。当然，不同柱规格之间仍然需要重新确认上样体积、流速、馏分范围、回收率以及质量属性，不能简单认为更换更大规格后所有参数都能够按比例直接复制。
十、这套SEC-TFF工作流对于CCM规模化纯化的主要启示
这项研究最核心的技术启示，是把复杂CCM纯化拆解成几个职责明确的单元操作。5×稀释和澄清负责降低样本黏度并去除大颗粒；TFF负责把大体积、相对稀释的CCM快速浓缩到适合SEC进样的体积，同时完成一定程度的缓冲液置换；qEV220 SEC负责进一步去除大量游离蛋白和小分子杂质；qEV Zenco则负责提高多轮层析运行中的自动化和重复性。Exoid TRPS与BCA等分析方法则帮助研究人员把每一步的颗粒和蛋白变化量化下来。
因此，SEC-TFF并不是两种相互竞争的EV纯化方案，而是两个功能互补的工艺模块。对于大体积CCM来说，只做SEC可能面临进样量过大，只做TFF又难以解决高蛋白背景；先TFF再SEC，则分别针对"体积"和"纯度"两个瓶颈。
这种工艺逻辑对于MSC-EV、工程化细胞EV以及其他细胞培养上清来源的EV具有较强参考意义，但实际项目仍需要根据培养基组成、起始颗粒浓度、蛋白负荷、EV尺寸范围、最终用途和后续分析要求重新确定膜孔径、浓缩倍数、SEC树脂和馏分区间。
参考文献
- Li Y, Pal VK, Mauleon G, Marchioni M, Severi C, Xuan B. Translating EV Isolation to Pilot Scale: A Validated SEC-TFF Workflow for High-Purity Processing Across Diverse Biofluids Poster. Izon Science; 202X.
- Böing AN, et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 2014;3:23430.
拓展阅读
关于技术来源
本文基于IZON Science公开海报及其SEC、TFF和EV分析相关公开技术资料，曼博生物MineBio整理，用于科研信息分享、实验参考和CCM来源EV中试纯化工艺理解。本文涉及的5×稀释、10× TFF浓缩、300 kDa MWCO推荐膜、qEV220、35 nm树脂、5.4 L预浓缩样品、9.9 L纯化收集液、约15倍纯度提升和约96%蛋白去除等均来源于对应研究体系，不应直接视为适用于所有细胞培养上清和EV产品的固定参数。实际工艺仍需根据样本黏度、颗粒浓度、蛋白负荷、目标EV粒径、膜选择、SEC树脂、馏分区间和后续质量分析方法进行验证。本文围绕IZON Science、qEV220、qEV TFF、qEV Zenco、Exoid TRPS、SEC、TFF、CCM和外泌体规模化纯化等方向整理相关公开技术信息。