今天给同学们分享一篇单细胞+多重免疫组织化学+数字细胞学（CIBERSORTx）的生信文章"Single-cell analysis reveals prognostic fibroblast subpopulations linked to molecular and immunological subtypes of lung cancer"，这篇文章于2023年1月31日发表在Nat Commun期刊上，影响因子为16.6。
成纤维细胞是一类特性不明确的细胞，对肿瘤进展产生不同程度的影响。在这里，作者使用单细胞RNA测序、多重免疫组织化学和数字细胞学（CIBERSORTx）来鉴定和表征人类非小细胞肺癌中的三个主要成纤维细胞亚群：外膜、肺泡和肌成纤维细胞。肺泡和外膜成纤维细胞（在对照组组织样本中富集）定位于组织学正常的肺组织中的离散空间位点，并且当它们存在于肺腺癌（LUAD）中时，表明改善了总体生存率。
1. 从单细胞RNA测序数据中进行体外成纤维细胞鉴定
作者对人肺组织样本进行了单细胞RNA测序（n = 18；六个对照组，七个鳞状细胞癌[LUSC]，五个腺癌[LUAD]；图1a），使用先前描述的方案在组织分离过程中富集成纤维细胞。鉴于样本来自手术切除而非同时处理，作者评估了这是否会在单细胞RNA测序数据中产生批次效应，通过对来自个体患者的细胞进行k最近邻重叠分析。结果发现显著增加的重叠，因此会影响聚类结果。为了减轻这种影响，作者应用了基于互补主成分分析（rPCA）的数据整合方法。然后进行了聚类和差异基因表达分析。结果发现多个明显不同的间质细胞、免疫细胞和上皮细胞群体（图1c）。间质细胞包括两个独立的聚类：内皮细胞（通过VWF等经典标记物标记）和基质细胞（通过DCN和DPT标记）（图1c）。
图1 通过对人类非小细胞肺癌肿瘤样本的全组织均质化物进行单细胞RNA测序分析，鉴定成纤维细胞
为了研究成纤维细胞，作者检查了基质细胞簇。鉴于壁细胞是肺组织中一种突出的基质细胞类型，并且在作者最初的聚类中没有被识别出来，作者试图确定基质细胞簇是否包含了成纤维细胞和壁细胞。这一点很重要，因为肌成纤维细胞通常通过表达参与细胞收缩的蛋白编码基因（例如ACTA2 [编码αSMA的基因]）来进行鉴定，而这些基因在壁细胞中高度表达。为了区分这些细胞，作者使用人类肺组织的单细胞RNA测序数据（HLCA；图1e）在人类肺细胞图谱中鉴定了在成纤维细胞和壁细胞之间差异表达的基因。作者将这些标记限制为先前描述的在多个小鼠器官中划分成纤维细胞和壁细胞的基因的人类同源基因，生成了成纤维细胞和壁细胞的共识基因特征（图1e）。为了确定这些特征是否能有效区分壁细胞和成纤维细胞，作者计算了它们在HLCA数据集中每个细胞的平均表达量，结果显示99%的准确率可以识别这两种细胞类型（图1f，g）。然后作者在作者的数据集中检查了这些特征的表达情况（图1h-j），结果显示在基质细胞簇中检测到了壁细胞（n = 69）和成纤维细胞（n = 885）。为了进一步测试在分析整个组织均质化肿瘤样本的单细胞RNA测序时，成纤维细胞和壁细胞是否常常聚集在一起，作者在多个公开可用的数据集上重复了这个分析，始终观察到类似的结果。
总结一下，作者已经找到了一种广泛适用的方法来区分单细胞RNA测序数据中的成纤维细胞和壁细胞，证明这是在肿瘤微环境中对成纤维细胞（或壁细胞）多样性进行表征的关键步骤。
2. 非小细胞肺癌中存在三个成纤维细胞亚群
生成包含足够样本的scRNA-seq数据集以实现纤维母细胞亚群在人群水平（跨多个患者）的表征是具有挑战性的，这是由于成本、样本可用性以及从组织中分离这些细胞的困难导致不同组织中比例不一致的原因。为了克服这一挑战并全面研究非小细胞肺癌中纤维母细胞的异质性，作者使用了来自人类非小细胞肺癌和对照组织样本的另外六个scRNA-seq数据集，重复了体外纤维母细胞分选（排除壁细胞）的过程。这样生成了一个包含9673个纤维母细胞的数据集（图2a；其中包括来自39个对照组织的5183个纤维母细胞；来自46个LUAD样本的3440个纤维母细胞和来自16个LUSC样本的654个纤维母细胞）。为了整合和校正数据集之间的批次效应，作者使用了规范相关分析。然后，作者使用共享最近邻模块化优化算法进行了无监督聚类。为了确定最具生物信息的聚类解决方案，作者运行了这个分析，通过改变分辨率参数来迭代增加识别的聚类数，并检查每个聚类识别的标记基因数量（样本级平均对数折叠变化 >1，调整P值 <0.01，并由至少50%的样本表达）。结果显示，一直识别出三个主要聚类，而更高分辨率的聚类导致识别出不符合这些标准的聚类或只有很少的标记基因（图2b）。
图2 通过整合七个单细胞RNA测序数据集，研究非小细胞肺癌中成纤维细胞的异质性
所识别的三个聚类与先前在对照肺组织中描述的成纤维细胞亚群（外膜、肺泡和肌成纤维细胞）一致。为了全面描述这些成纤维细胞亚群的人群水平特征，作者首先计算了每个亚群的样本级基因表达谱（在单个细胞上平均），然后进行差异基因表达分析（图2c）；使用REACTOME通路进行基因集变异分析（图2d）以及使用先前描述的成纤维细胞亚群的基因签名进行基因集变异分析。
使用单细胞数据进行差异表达分析，发现了622个由肌成纤维细胞上调的基因，其中188个在样本水平分析中仍然显著（adj.P < 0.01）。从单细胞分析到样本水平分析的标记识别的减少表明，确保scRNA-seq数据集在样本数量方面具有足够的能力来检测群体水平的差异是非常重要的。肌成纤维细胞亚群的关键标记包括MMP11、POSTN、CTHRC1、COL1A1、ACTA2和COL3A1。GSVA显示这些细胞显著上调了多个参与生成胶原基质的通路（图2d），与肌成纤维细胞在纤维化和肿瘤中的已知作用一致。除了涉及ECM生物合成的通路外，还上调了多个涉及细胞-ECM相互作用的通路，包括整合素细胞表面相互作用和辐射素相互作用（图2d）。这些细胞还上调了多个先前描述的肌成纤维细胞和肿瘤相关基因特征。
使用单细胞数据进行差异表达分析，发现在外膜成纤维细胞中有481个基因上调，与其他亚群相比，其中73个基因在样本间差异表达分析中仍然显著，包括PI16、IGFBP6、MFAP5、APOD、PLA2G2A和GSN。GSVA发现多个通路中PTGIS（前列腺素I2合成酶）的表达增加，包括前列腺素和胆汁酸/盐的合成（图2d），这对于从肺吞噬细胞中动员胆固醇至关重要。另外，替代补体激活通路也显著上调，涉及C3和CFD（图2d）。外膜成纤维细胞还上调了与COL14A1 +基质成纤维细胞相关的基因特征，这些特征由参考文献描述 16 ；与PI16 +"通用"成纤维细胞群体相关的基因特征，这些特征由参考文献描述 19 ；以及在胰腺和乳腺癌中描述的iCAF亚群体。
对于肺泡成纤维细胞，单细胞差异表达分析鉴定出672个上调基因，其中78个在样本水平分析中仍然显著，包括MACF1、RGCC、INMT、LIMCH1、A2M和GPC3。GSVA鉴定出TRP通道的上调（图2d），这些通道能够检测和传导感觉信号（如氧化应激、pH和热量），将其转化为化学或电信号以调节细胞反应。涉及SLIT和ROBO基因家族成员的通路也上调（图2d），这些基因在调节交叉轴突导向中有着明确的作用，但也被证明在关节炎中调节成纤维细胞迁移。肺泡成纤维细胞还上调了与COL13A1 +基质成纤维细胞群体和与肺特异性NPNT +成纤维细胞群体相关的基因特征。
细胞外基质（ECM）的生产和重塑是纤维母细胞在所有组织中的关键功能。与此一致，纤维母细胞亚群之间差异表达的基因在ECM成分中显著富集（Fisher's exact p = 1.34e-62），其中31%的差异表达基因与基质组分相关联。因此，作者检查了每个纤维母细胞亚群是否上调了与特定基质组分相关的基因（基底膜、间质胶原、ECM糖蛋白和蛋白聚糖；图2e）。结果显示，肌纤维母细胞在每个基质组分中上调了多个基因，包括大部分上调的间质胶原（图2e）；肺泡纤维母细胞上调了与基底膜和ECM糖蛋白相关的多个基因；而外膜纤维母细胞上调了多个ECM糖蛋白和蛋白聚糖（图2e）。为了进一步研究这些差异，作者计算了每个基质组分的模块得分，并比较了它们在纤维母细胞亚群之间的整体表达（图2f）。这表明，与外膜和肺泡成纤维细胞相比，肌成纤维细胞显著上调了间质胶原的表达（图2f）；而肺泡和肌成纤维细胞在基底膜基因的表达上均显著增加，与外膜成纤维细胞相比（图2g）。过度胶原沉积是肌成纤维细胞发挥的关键作用，这已经有很好的描述。为了确定这是否是这些细胞的病理特异性功能，作者检查了从对照组或肿瘤组织中分离的成纤维细胞亚群中特定基质组分的表达是否有所变化。结果显示，肿瘤样本中的间质胶原表达在这三个亚群中均显著增加（图2h）。
这个结果表明，纤维母细胞亚群内可能存在由病理驱动的变异，可能反映了激活水平。为了进一步研究这一点，作者在每个亚群内对对照样本和肿瘤样本进行了差异表达分析。这发现了与对照对应的肿瘤相关外膜纤维母细胞相比，多个基因在肿瘤相关外膜纤维母细胞中下调，包括IGFBP6、FABP4和DCN。相反，与对照对应的肿瘤相关肌纤维母细胞中有多个基因上调，包括SULF1、COL11A1和LRRC15。作者还检查了先前描述的CAF亚群的基因特征是否在来自对照或肿瘤样本的纤维母细胞中差异表达。正如预期的那样，无论肿瘤亚型如何，myoCAF基因特征在肿瘤样本中显著上调（图2i）。然而，与此相反，iCAF基因特征在从肿瘤样本中分离的纤维母细胞中显著下调，与对照组织相比（图2j）。
总结一下，这些数据显示，非小细胞肺癌中存在的成纤维细胞与非癌肺组织中被鉴定为组织驻留的三个主要亚群体一致，并且很可能不同程度地调节细胞外基质的维护/重塑。这些数据还表明，与非小细胞肺癌肿瘤的相互作用导致了每个亚群体内基因表达的显著变化，其中包括间质胶原的上调以及亚群体特异性的表型变化。此外，作者还发现与对照肺成纤维细胞相比，非小细胞肺癌中的肌型癌相关基因表达特征增加，而对照肺组织中的间质型癌相关基因表达特征增加。
3. 研究亚型间的空间分布和丰度
为了对通过scRNA-seq鉴定的三个成纤维细胞亚群进行正交验证，作者设计了一个多重免疫组化（mxIHC）面板。在这个分析中，作者使用了人类蛋白质图谱数据库来识别每个亚群的标记基因，这些基因具有"增强型"抗体验证，表明在IHC或RNA-seq测量时具有一致的表达水平，并且已经记录了蛋白质的细胞内检测（图3a）。通过人类蛋白质图谱图像，顾问病理学家筛选了符合这些标准的基因，在成纤维细胞和CD34、AOC3以及POSTN或ACTA2（α-SMA）中选择了最佳的IHC标记物，分别用于外膜、肺泡和肌成纤维细胞（图3a。此外，排除标记物Pan-CK、CD31和MCAM（上皮、内皮和壁细胞标记物）也被纳入到mxIHC面板中。
图3 多重免疫组化（mxIHC）和数字细胞学显示，成纤维细胞亚群占据空间离散的生态位，并在非小细胞肺癌组织亚型富集中表现出多样性
与先前定义的肺成纤维细胞表型的命名一致，作者的mxIHC显示在这些控制（组织学正常）肺组织的区域内发现了肺泡和外膜亚群（图3b）。值得注意的是，然而，AOC3 +（肺泡）成纤维细胞也观察到在间质性肺组织中（图3b），而CD34 +（外膜）成纤维细胞也观察到在周支气管区域（图3b）。
然后，将这个mxIHC面板应用于NSCLC组织的整体切片（包括15个LUAD和10个LUSC样本，其中包括作者的scRNA-seq队列中的十个样本。正如预期的那样，作者鉴定出的三个成纤维细胞亚群显示出离散的亚群，并且每个亚群都存在于三种分析的组织类型中（对照组、LUAD和LUSC；图3c、d）。
为了检查这些成纤维细胞表型在更大的队列中的情况，使用CIBERSORTx介导的数字细胞学进行了检测，利用单细胞RNA测序数据生成了一个签名矩阵：包括每个成纤维细胞亚群、内皮细胞、壁细胞、上皮细胞和免疫细胞。通过结合单细胞转录组生成的伪块数据集进行测试，验证了该方法的准确性，为每个伪块样本提供了真实情况。这证实了准确计数所有细胞类型的能力，包括三个成纤维细胞亚群（R 2 =0.81 [外膜]，0.91 [肺泡]和0.92 [肌]；p<3.53e-76）。
作者检查了对照组、LUAD和LUSC组织样本中每个亚群的相对丰度。在单细胞RNA测序数据集中，对照组组织样本中的外膜成纤维细胞明显比LUAD和LUSC组织样本更丰富（图3e）。肺泡成纤维细胞在对照组组织中同样最为丰富，但在一些LUAD样本中也检测到高水平，而在LUSC中很少存在（图3e）。相反，肌成纤维细胞在LUAD和LUSC中的丰度增加，与对照组组织相比也在LUSC中更为丰富（图3e）。通过使用CIBERSORTx分析TCGA RNA测序数据集（图3g），作者证实了这些成纤维细胞亚群与组织类型之间的关联。然后通过mxIHC进一步验证（图3f），其中排除了组织块中被困的非肿瘤组织（如图3c所示）。
鉴于发现LUSC肿瘤中的肌成纤维细胞水平高于LUAD肿瘤，作者假设肿瘤亚型可能也会对邻近组织产生不同的影响。为了验证这一点，作者使用作者的mxIHC数据集比较了LUSC和LUAD病例中的肿瘤邻近组织区域。结果显示，与肺癌内部区域类似，LUSC邻近肺部区域的肌成纤维细胞增加，而肺泡成纤维细胞减少，与LUAD邻近肺组织相比。然后，病理学家对这些肿瘤邻近区域进行评估，以确定是否存在炎症和/或纤维化的证据，结果发现55%的LUSC病例中存在，而LUAD病例中不存在。当根据炎症和/或纤维化的存在将这些对照组织区域分组时，肺泡和肌成纤维细胞的丰度也存在显著差异。然而，在任何比较中，外膜成纤维细胞的丰度没有显著差异。
总结一下，对照组肺组织中富含外膜和肺泡成纤维细胞亚群，而非小细胞肺癌中则被肌成纤维细胞所取代。此外，成纤维细胞亚群的丰度在非小细胞肺癌亚型之间也存在差异，LUAD肿瘤在三个亚群之间表现出更大的异质性，而LUSC肿瘤则一直具有较高水平的肌成纤维细胞。
4. 使用轨迹推断研究MyoCAF的激活
为了研究肺泡和外膜成纤维细胞亚群（在对照组织中富集）向肿瘤组织中富集的肌成纤维细胞转分化的过程，作者对作者的单细胞RNA测序数据集进行了轨迹推断，使用了扩散映射降维方法。这显示外膜和肺泡成纤维细胞可能作为独立的祖细胞，从中肌成纤维细胞可以转分化（图4a，b）。然后，作者按照"伪时间"对细胞进行排序，表示它们相对于肌成纤维细胞表型的进展（图4c）。通过分别检查每个数据集，并使用Stouffer方法计算元p值（补充数据），确定了在伪时间中差异表达的基因。然后，根据在"伪时间"中相关表达的基础上，将显著基因（调整后的元p值小于1×10，且在至少三个数据集中的名义p值小于0.05）聚类成模块。这在两个轨迹上鉴定出了四个模块，代表转分化的不同阶段：祖细胞、早期激活、原始分化和分化（图4d，e）。比较分配给每个模块的基因，突出显示两个轨迹之间存在显著的重叠，表明无论前体亚群如何，肌成纤维细胞转分化的过程是相似的（Fisher精确p值小于1.03e-10）。
图4 轨迹推断识别出与肺泡或外膜成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化相关的共识基因模块
为了对这些转分化阶段进行功能注释，作者进行了富集分析，使用了REACTOME通路数据库（图4h）。早期激活模块显著富集了已知参与细胞因子信号传导的基因（图4h），并且还包含多个先前描述的iCAF标记基因 8 ），这表明转分化过程的这个阶段可能与与非小细胞肺癌肿瘤相关的刺激无关。为了确认这一点，作者将scRNA-seq数据集中的所有成纤维细胞根据它们在伪时间中的位置分为五个区间，然后计算每个模块的表达的样本平均值。结果显示，在转分化过程的所有阶段，来自对照样本的成纤维细胞中的早期激活模块显著增加，与肿瘤样本相比（图4g）。
相比之下，原始分化和分化模块在仅包含对照样本或对照和非小细胞肺癌样本的数据集中，随着伪时间的表达趋势在定性上有所不同（图4f）。因此，作者采用相同的方法来确定样本类型是否影响原始分化模块的表达。结果发现，在转分化的中间阶段，肿瘤样本的表达显著增加（图4g）。该模块富含许多编码核糖体蛋白的基因（图4h），这是肌成纤维细胞的一种良好描述的超结构特征，可能表明这些细胞具有增强的蛋白质翻译能力。热休克家族基因参与了HSF1转录激活（例如HSPA1A、DNAJB1和HSP90AB1），这些基因在该模块中也显著富集（图4h），先前已经显示它们调节了癌症介导的成纤维细胞激活。此外，参与氧化应激反应的基因（例如... HIF1A、GGT和SERPINE1是热休克反应和成纤维细胞激活的明确驱动因子，这些因子也在该模块中被发现。为了进一步研究热休克/应激反应在肌成纤维细胞激活中的作用，作者使用mxIHC检查了HSPA1A/Hsp70的表达。结果显示，在与肿瘤相邻的对照区域中，与肿瘤内的细胞相比，每个成纤维细胞亚群中的表达均显著增加（图4i），这证实了非小细胞肺癌肿瘤所产生的刺激比对照组织产生的刺激更大程度地诱导了热休克反应。
在转分化的所有阶段，与对照组相比，肿瘤组织中的分化模块显著增加（图4g）。该模块富含参与胶原形成和细胞外基质组织的基因（图4h），与上述描述的肌成纤维细胞表型和数据一致，显示与对照组织样本相比，肿瘤样本中的纤维性胶原上调。
总结一下，这些结果表明，无论是控制组织富集的纤维母细胞亚群（外膜和肺泡），都可以作为组织驻留的肌纤维母细胞的前体。这些数据还表明，无论前体亚群如何，转分化过程是相似的：包括短暂的炎症基因上调阶段，与肿瘤的直接相互作用无关；接着是原始分化阶段，涉及到热休克反应信号的增加，这种增加是通过与肿瘤的相互作用而产生的；最后，导致完全分化的肌纤维母细胞表型，其对ECM组织和胶原形成的能力增强，这种增强是由肿瘤相关刺激显著提高的。
5. 纤维母细胞表型的跨组织分析
为了检查这些成纤维细胞表型在癌症类型间是否保持一致，作者分析了来自PDAC、HNSCC和结直肠癌（CRC）的公开可用数据。在每种情况下，成纤维细胞通过无监督聚类和壁细胞排除进行鉴定，如上所述（图5a）。然后，使用概率机器学习模型将这些细胞分类为NSCLC中鉴定出的三个亚群之一（图5b，c）。结果显示，外膜和肌成纤维细胞群体在所有分析的癌症类型中都得到了很好的保留（外膜中位概率=0.67 [PDAC]，0.75 [HNSCC]，1 [CRC]；肌中位概率=1 [PDAC]，1 [HNSCC]，1 [CRC]）；而被归类为肺泡亚群的成纤维细胞具有一致较低的概率得分（中位概率=0.49 [PDAC]，0.52 [HNSCC]，0.56 [CRC]），表明其与肺部的表型差异更大。
图5 基于机器学习的单细胞RNA测序数据和多重免疫组化染色
然后，作者通过将作者的多重免疫组化（IHC）面板应用于由PDAC、HNSCC和CRC的肿瘤和对照组织核心组成的组织微阵列来验证这些结果。与单细胞RNA测序（scRNA-seq）的发现一致，这表明在这些癌症类型中，周围组织和肌成纤维细胞是主要的亚群体（图5d和附图）。此外，正如作者在非小细胞肺癌中发现的那样，与所有三种肿瘤类型相比，周围组织成纤维细胞在对照组织中明显更丰富（图5e），而肌成纤维细胞在肿瘤组织中更丰富（图5f）。
为了测试肺泡表型是否特异于肺组织，作者对源自特发性肺纤维化（IPF）样本的单细胞RNA测序数据进行了类似的分析（即非癌性肺病理）。结果显示，这三个亚群体的高概率得分被确定（中位数概率=0.95 [外膜]，0.88 [肺泡]，0.90 [肌肉]）。值得注意的是，这个分析还显示，与癌症数据集相比，IPF中的肌成纤维细胞分类的概率较低，这表明在癌症和纤维化中发现的肌成纤维细胞可能存在细微差异。
6. 使用多个非小细胞肺癌队列进行生存分析
为了研究纤维母细胞亚群在非小细胞肺癌（NSCLC）中的临床相关性，作者利用CIBERSORTx介导的数字细胞学推断细胞丰度，对大型临床注释的NSCLC队列进行了调查（四个LUAD队列，n = 1669；四个LUSC队列，n = 1104；补充数据）。每个纤维母细胞亚群的相对丰度用于Cox比例风险回归模型。这发现了LUAD中肌成纤维细胞与整体生存率不良的一致关联（p < 0.01），但在LUSC中没有找到显著相关性。鉴于肌成纤维细胞在这两种NSCLC亚型中都非常丰富，作者假设这种差异可能是由于亚型之间的表型变化。然而，通过样本水平分析没有发现显著差异表达的基因，这表明这两种NSCLC亚型中的肌成纤维细胞在转录组水平上的表型差异很小。
为了评估肺腺癌患者分层中使用肌成纤维细胞丰度作为预后生物标志物的潜力，作者使用TCGA-LUAD数据集作为测试队列，确定将样本分类为肌成纤维细胞高（>85.2%）和低（<85.2%）的最佳阈值（图6a-c）。然后，作者将这个阈值应用于三个验证队列，结果显示出持续显著的患者分层效果（log-rank p ≤ 0.02；图6d）。多变量Cox回归分析还表明，这些预后相关性与疾病阶段和患者年龄无关（p < 0.0001，HR [95% CI] = 1.70 [1.38, 2.09]；图6i）。
图6 CIBERSORTx介导的数字细胞学显示，肺腺癌中的肌成纤维细胞和肺泡成纤维细胞与总体生存率相关
相比之下，肺泡和外膜成纤维细胞的丰度与多个LUAD数据集中的整体生存率有关。这种关联尤其在肺泡成纤维细胞中一致性较高，在所有分析的数据集中都具有显著性（p < 0.01）。因此，作者采用了与上述相同的方法来测试肺泡成纤维细胞丰度作为预后标志物的潜力（图6e-g）。同样，结果显示将LUAD队列分为肺泡成纤维细胞高（>22.0%）或低（<22.0%）能够一致有效地分层整体生存率（Log-rank p <= 0.02；图6h）；而且这种关联与疾病阶段和患者年龄无关（图6j）。
7. 研究与LUAD的关键预后特征的关联
LUAD肿瘤的形态亚型与患者生存率有关。根据CIBERSORTx（n = 623, p < 0.0001; 图7b）、scRNA-seq（n = 21; 图7c）和mxIHC（n = 15; 图7a, d）的结果显示，LUAD的形态亚型之间的成纤维细胞亚群丰度存在显著差异。与中/低分化（G1/G2; 鳞状、腺泡和乳头状）肿瘤相比，高分化（G3; 实性或微小乳头状）肿瘤中的肌成纤维细胞数量增加。尽管存在这种关联，成纤维细胞亚群的丰度仍然是多元Cox回归中的一个重要独立预后指标，包括年龄、分期和分级作为协变量（肌成纤维细胞：HR [95% CIs] = 1.44 [1.07, 1.95], adj.P = 0.015; 肺泡成纤维细胞：HR [95% CIs] = 0.67 [0.46,0.96], adj.P = 0.028; n = 601）。
图7 MxIHC和数字细胞学显示成纤维细胞亚群与LUAD肿瘤的形态学、分子学和免疫学特征相关
LUAD的形态可以在个体肿瘤内部呈现异质性。因此，作者使用作者的MxIHC数据集来研究成纤维细胞亚群与特定形态模式之间的关联。这确定了肌成纤维细胞与肿瘤实性生长模式所占比例之间的显著相关性（rho = 0.60，p < 0.01）；并且肌成纤维细胞明显是混合形态肿瘤实性区域中主要的基质细胞类型。与微乳头状生长模式之间存在较弱且不显著的相关性（rho = 0.44，p = 0.07）。
先前的研究已经描述了LUAD（肺腺癌）的形态和分子亚型（近端炎症型[PI]、近端增殖型[PP]和终末呼吸单位[TRU]）之间的联系。作者在大样本组织数据中证实了这一点，发现77%的TRU肿瘤是中度/良分化（G1/G2），而69%的PP肿瘤是差分化（G3）。符合预期的是，骨髓纤维母细胞在PP肿瘤中最为丰富；而肺泡和外膜纤维母细胞在TRU肿瘤中最为突出（图7f）。此外，与先前描述的PP肿瘤和TP53突变之间的关联一致，作者还发现骨髓纤维母细胞在携带TP53突变的LUAD肿瘤中增加（图7e）。
作者还使用CIBERSORTx来检查免疫细胞亚群（LM22 57 ）的丰度及其与成纤维细胞亚群的相关性。这表明免疫细胞与肺泡成纤维细胞之间存在反向关系，这一关系在所有分析的LUAD转录组数据集中都得到了一致观察（图7g）。显示肺泡成纤维细胞与多个静息免疫细胞亚群（图7g；例如肥大细胞、CD4 + 记忆T细胞和树突状细胞）以及单核细胞和B细胞（记忆和原始亚群）相关。相反，肌成纤维细胞与巨噬细胞、中性粒细胞、活化肥大细胞和活化CD4 + 记忆T细胞相关（图7g）。这表明肿瘤微环境中的肌成纤维细胞分化也与辅助T细胞和髓系细胞的活化/分化相关。
总结
总之，对肺部和非小细胞肺癌成纤维细胞的多样性进行的全面分析显示了某些亚群体是器官特异性的，而其他亚群体则在不同组织、癌症和病理中一直存在。肌成纤维细胞和肺泡成纤维细胞与不同的分子和免疫学LUAD亚型相关，并且它们对预后的相反影响能够准确地识别高风险患者。这些发现有望改善患者分层，并应该优化肺癌成纤维细胞治疗靶向策略。