【每天一个知识点】CITE-seq 技术

一、技术背景

单细胞RNA测序(scRNA-seq)自问世以来,极大推动了细胞异质性和组织复杂性的研究。但RNA水平并不能完全代表蛋白质水平,因为蛋白质的表达受转录后调控、翻译效率及蛋白降解等多种因素影响。此外,许多细胞类型的特征依赖于表面蛋白的表达,单纯靠转录组数据难以准确区分。
CITE-seq (Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by sequencing) 技术在 2017 年由 Stoeckius 等人提出,利用抗体标签的DNA条形码标记细胞表面蛋白,并与RNA一起测序,实现了细胞转录组与蛋白质表面表型的联合分析。


二、技术原理

  • 抗体-寡核苷酸偶联物(Antibody-Oligo Conjugates)

    研究人员将单克隆抗体与独特的DNA寡核苷酸条码(ADT,Antibody Derived Tags)偶联,每个抗体对应特定的条码,针对不同表面蛋白。

  • 双重标记单细胞

    在细胞悬液中,使用这些抗体混合物与细胞表面靶点结合,完成细胞表面蛋白的特异性标记。

  • 单细胞捕获与裂解

    标记完成后,利用微流控芯片或油滴包裹技术捕获单个细胞,细胞裂解后释放的RNA和抗体携带的DNA条码共同进行反转录。

  • 文库制备及高通量测序

    RNA和ADT条码分别构建测序文库,进行下一代测序(NGS)。

    • RNA测序获得基因表达谱

    • ADT测序获得蛋白表达量信息

  • 数据整合分析

    通过生物信息学方法,将RNA和蛋白质数据结合,得到每个细胞的转录组和表面蛋白双模态信息。


三、实验流程

  1. 抗体标记

    细胞悬液与含有独特DNA条码的抗体混合,进行细胞表面蛋白标记。

  2. 单细胞捕获

    使用10x Genomics等平台,将标记细胞单独封装于微滴中。

  3. 细胞裂解及逆转录

    裂解细胞释放mRNA和ADT条码,逆转录成cDNA。

  4. 文库构建

    分离RNA和ADT条码,分别进行扩增和文库制备。

  5. 高通量测序

    使用Illumina测序平台测序。

  6. 数据处理

    • RNA数据进行标准scRNA-seq分析(质控、归一化、降维、聚类)

    • ADT数据进行计数和归一化,获得蛋白表达强度

    • 融合两组数据,实现多模态分析


四、技术优势

  • 多模态信息获取:同时得到转录组和蛋白质信息,全面反映细胞功能状态。

  • 细胞类型鉴定准确:结合蛋白表达信息可以更准确地区分亚群和状态。

  • 低样本需求:和传统流式细胞术相比,对样本量需求更低。

  • 兼容现有scRNA-seq平台:可直接在10x Genomics等主流单细胞平台上实施。

  • 适合复杂样本分析:肿瘤、免疫微环境、干细胞分化等多领域均可应用。


五、数据分析特点

  • 双模态数据处理:需要针对 RNA 和 ADT 数据分别预处理,常用归一化方法有所不同。

  • 多组学融合:主流分析软件如 Seurat、Scanpy 已支持 CITE-seq 数据的联合降维和聚类。

  • 去除背景噪声:ADT数据可能存在非特异性结合或背景信号,需要特定算法校正。

  • 细胞类型注释:结合蛋白和基因标记更精准,特别是在免疫细胞类型划分中优势明显。


六、主要应用领域

  • 免疫细胞研究

    精准划分免疫细胞亚型,分析免疫应答和免疫治疗机制。

  • 肿瘤微环境分析

    同时捕获肿瘤细胞与免疫细胞的转录组和蛋白质信息,解析细胞互作。

  • 干细胞与发育生物学

    追踪细胞分化路径,揭示细胞命运决定机制。

  • 疾病机制探索

    解析复杂疾病中细胞的多层次状态和功能变化。