肺腺癌上皮细胞状态及可塑性图谱

摘要

对于肺腺癌演进过程中单个细胞群的地理空间架构知之甚少。在此，我们对来自五个早期LUAD和14个来自肿瘤的具有明确空间邻近性的多区域正常肺组织的186，916个细胞进行了单细胞RNA测序。我们发现细胞谱系、状态和转录组特征在正常区域到LUAD 的地理空间中发生了演变。LUAD还表现出单个部位内显著的肿瘤内细胞异质性和转录谱系可塑性程序。与远离LUAD的正常组织相比，靠近LUAD的正常组织中调节性T细胞表型增加，而细胞毒性CD8+T细胞、抗原呈递巨噬细胞和炎症树突状细胞的特征和比例则减少。我们还发现，LUAD配体受体相互作用组中上皮CD24的表达增加，其介导了促肿瘤表型。这些数据提供了LUAD演进的空间图谱，并为识别其治疗靶点提供了资源。重要性：外周肺和早期LUAD的地理空间生态系统尚不清楚。我们对多区域单细胞测序的分析揭示了肺腺癌在肺部空间和生态进化过程中细胞群、状态和表型，其中包含具有高潜力的早期拦截靶点。

数据收集

Patients with LUAD

软件使用

软件包信息

软件名称	版本	应用领域	官网链接	核心功能
R语言	3.6.0	统计分析	www.r-project.org	开源统计计算平台，生物信息分析基础环境
10X Genomics平台	-	单细胞测序	www.10xgenomics.com	Chromium单细胞转录组/ATAC/空间转录组测序系统
NovaSeq 6000	-	高通量测序	illumina.com	Illumina高通量测序仪（单次运行最高6Tb数据量）
CellRanger	3.0.2	单细胞数据处理	10xgenomics.com	10X官方数据分析套件，包含比对、定量和基础分析
Seurat	-	单细胞分析	satijalab.org/seurat	R语言单细胞分析黄金标准工具，支持全流程分析
Harmony	-	数据整合	github文档	高效单细胞数据整合算法，可消除批次效应
Seurat v3	-	单细胞分析	satijalab.org	支持多组学数据整合的升级版本
Monocle 2	2.10.1	细胞轨迹推断	bioconductor.org	拟时序分析经典工具，可构建细胞分化轨迹
inferCNV	-	拷贝数变异分析	Broad研究所	从单细胞RNA数据推断肿瘤拷贝数变异

统计方法信息

Pearson相关系数分析

类型：参数检验
用途：衡量两个连续变量的线性相关程度
关键特性：
- 取值范围：[-1, 1]，1表示完全正相关
- 对异常值敏感
前提假设：
- 变量服从正态分布
- 存在线性关系
- 方差齐性
R语言函数 ：cor.test(x, y, method = "pearson")

双侧对数秩检验 (Log-Rank)

应用领域：生存分析
作用：比较两组生存曲线差异（无方向性假设）
特点：
- 非参数检验
- 根据风险人数加权计算
数据要求：
- 右删失数据
- 观测值独立
R语言函数 ：survdiff(Surv(time, status) ~ group, rho = 0)

Kruskal-Wallis检验

类型：非参数版方差分析
适用场景：比较≥3个独立组的中位数差异
优势：
- 不要求正态分布
- 使用秩次转换数据
注意事项：
- 适用于有序/连续数据
- 各组数据分布形状应相似
R语言函数 ：kruskal.test(因变量 ~ 分组因子, data)

Wilcoxon秩和检验

别名：Mann-Whitney U检验
用途：比较两独立组的分布差异
推荐使用时机：
- 数据不满足正态性
- 因变量为有序变量时
核心原理：
- 检验随机占优性（P(X>Y)）
- 对偏态数据比t检验更稳健
R语言函数 ：wilcox.test(y ~ x, paired = FALSE)

独立样本t检验

类型：参数检验
作用：比较两独立组均值差异
必须条件：
- 数据服从正态分布
- 方差齐性（若不满足需用Welch校正）
- 观测值独立

R语言函数：

go 复制代码

t.test(x, y, var.equal = TRUE)   # 标准t检验
t.test(x, y, var.equal = FALSE)  # Welch校正

实验验证方法

Multiregion Sampling of Surgically Resected LUADs and Normal Lung Tissues

目的

全面捕获肺腺癌(LUAD)瘤内异质性和正常肺组织的细胞组成

方法

样本采集:
- 手术切除的新鲜LUAD组织（肿瘤中心、边缘及远端正常肺组织）
- 至少采集3个不同解剖区域/样本
- 立即置于冰上HBSS缓冲液（含1%双抗）
质量控制:
- 术中冰冻切片病理确认
- 各区域样本的肿瘤纯度评估（>70%肿瘤细胞含量）
- RNA完整性检测（RIN > 7.0）
样本处理:
- 分装为三部分：

新鲜组织→单细胞悬液制备
OCT包埋→冷冻切片（空间转录组）
4%PFA固定→FFPE块（组织学验证）

scRNA-seq Analysis

目的

解析多区域样本的单细胞转录组特征

实验流程

单细胞制备:
- 机械消化+酶消化（胶原酶IV/DNase I，37℃ 15min）
- 活细胞分选（Dead Cell Removal Kit）
- 10x Genomics Chromium X捕获（目标10,000细胞/区域）
测序参数:
- 空载对照（检测环境RNA）
- 混合样本对照（评估批次效应）
- Illumina NovaSeq PE150
- 测序深度：50,000 reads/cell
- 对照设置：

研究成果

通过多区域单细胞 RNA 测序技术剖析早期肺腺癌以及周围肺部生态系统

A、展示了针对5个肺腺癌样本和14个空间界定的正常肺组织样本进行分析的多区域采样策略的流程图，该分析通过单细胞RNA测序完成。

B、来自患者一的肿瘤、相邻正常和远端正常样本的细胞的UMAP嵌入图。

C、来自P1的每个空间样本中的细胞组成和相对比例。

D、所有五名患者的细胞UMAP视图，包括P2-P5中EPCAM+和EPCAM−优先富集的细胞。

E、基于空间样本的细胞类型及其比例的UMAP视图。

F、基于转录组特征计算的欧几里得距离显示的空间样本之间细胞的层次关系的树状图

G，与D中的UMAP相同，但进一步对淋巴细胞和髓系细胞进行了细分。

H和i，折线图展示了所有患者共有的所有空间样本中EPCAM阴性子集之间相对比例的变化情况（H），以及按患者划分的情况（i）。

早期肺腺癌空间生态系统中的上皮细胞谱系多样性及肿瘤内异质性

A、所有P1至P5时期的EPCAM+细胞的UMAP可视化图。

B、EPCAM+细胞簇的主要谱系标志基因热图，同时附有对应的空间样本的条形图以显示其比例

C、显示不同空间样本中EPCAM+子集比例变化的面积图。

D、基于转录组特征计算的欧几里得距离对空间样本中三个代表性上皮细胞子集之间的层次关系进行展示，以及对应的空间样本相似性水平的热图。

E、恶性富集簇C9中细胞的UMAP图，按其对应的患者来源、空间样本和CNV分数进行着色

F、携带KRASG12D突变的细胞比例。

G、聚类图，使用NK细胞作为对照，对来自患者P3和P5肿瘤样本的CNV路径进行无监督聚类分析，以展示 CNV 路径的肿瘤内异质性。

H，通过Monocle 3分析推断出的P3和P5中EPCAM+细胞的潜在发育轨迹。

早期肺腺癌中淋巴细胞亚群向肿瘤相关表型的时空重编程

A、对P1-P5时期淋巴细胞亚群进行的UMAP可视化展示

B、气泡图展示了谱系标志物的表达情况。

C、在LUAD和空间正常样本中淋巴细胞谱系和细胞状态的丰度变化。

D、对CD8+T淋巴细胞进行细胞状态着色的UMAP图、空间样本和细胞毒性评分。

E、在LUAD的肿瘤微环境中CD8+GNLYhi CTL的减少。

F、由细胞状态、空间样本和Treg特征得分颜色编码的CD4+T淋巴细胞的UMAP图。

G，LUAD肿瘤微环境中CD4+调节性T细胞的富集情况。

早期肺癌组织微环境中抗原呈递和炎症性树突状细胞的特征显著减少

A、以细胞类型/状态对髓系细胞谱系进行颜色标注的UMAP可视化图以及空间样本图。

B、气泡图展示了髓系细胞中表达谱系特异性标记基因的百分比以及它们的缩放表达水平。

C、在LUAD样本和空间正常肺样本中髓系细胞亚群的丰度变化。

D、单核细胞和巨噬细胞亚群的UMAP图。

E、在空间样本中，簇1中表达抗原呈递基因的M2型巨噬细胞的百分比以及它们的缩放表达水平。

F、岭图显示差异情况。在M2型巨噬细胞群1中以及在所有LUAD样本和空间正常肺样本中，MHC类I和类II基因表达密度的分布情况。

G，显示了所有患者以及患者内部在M2型巨噬细胞中抗原呈递评分的violin图。

H，由细胞状态和空间样本编码的树突状细胞的UMAP图。

i，UMAP图展示了cDC2细胞的无监督分群。

J，显示cDC2细胞亚群标记基因的标准化表达的热图。

K，气泡图显示表达炎症和非炎症特征基因的cDC2细胞的百分比。

L，显示了LUAD组织中cDC2集群C2细胞的炎症特征评分的折线图。

M，展示了cDC2 C2细胞在总cDC2细胞中的比例以及在LUAD组织和空间正常肺组织中的分布情况。

N，显示了正常肺、癌前腺泡状腺癌以及来自独立队列的LUAD中的炎症特征评分。

增强了肺腺癌细胞与其免疫微环境之间的配体-受体细胞-细胞通讯网络

A、利用iTALK进行细胞间通讯的计算分析工作流程

B、热图展示了预测的基于配体-受体的相互作用在各个LUAD与与其对应的空间分布的正常肺组织之间的重叠情况。

C-F、代表性的环形图展示了患者2、3、4和5的每个LUAD与所选匹配的空间正常肺样本之间免疫检查点介导的L-R对的详细情况。

G和H、箱形图展示了涉及免疫检查点的配体和受体基因的表达。

与肺腺癌中CD24增多相关的肿瘤表型

A、箱形图展示了在一组独立的正常肺组织、癌前腺瘤样增生和肺腺癌样本中 CD24 表达水平的情况。

B、使用皮尔逊相关系数绘制的散点图，展示了NL、AAH和LUAD样本中CD24与EPCAM和PRF1的表达水平之间的关系。

C、箱形图描绘了LUAD样本和来自TCGA LUAD队列的匹配正常肺组织中CD24表达水平的情况。

D、使用皮尔逊相关系数展示的CD24与EPCAM或PRF1表达之间的相关性散点图。

E、通过靶向免疫分析对早期阶段LUAD患者进行分析，并根据CD24 mRNA表达的中位值进行二分处理。

F、在MDACC队列中使用皮尔逊相关系数展示CD24与EPCAM、PRF1或细胞毒性评分之间的表达相关性散点图。

G，图中显示了相对较高的和较低的免疫组化CD24染色。

H，在同基因小鼠体内植入MDA-F471细胞后，其皮下生长情况。

Reference

Han G, et al. An atlas of epithelial cell states and plasticity in lung adenocarcinoma. Nature. 2024 Mar;627(8004):656-663. doi: 10.1038/s41586-024-07113-9. Epub 2024 Feb 28. Erratum in: Nature. 2024 Apr;628(8006):E1. doi: 10.1038/s41586-024-07277-4. PMID: 38418883; PMCID: PMC10954546.