基因组组装：3. juicer 比对 HiC 数据至参考基因组

为了将组装完成的 contig 数据拼接成为 scaffold，需要测定样本的 HiC 数据，通过片段间的互作强度推断片段间的物理距离，互作强度越强，物理距离越近，据此将分散的 contig 挂载成为 scaffold。其中，一般使用 Juicer 软件将 HiC 数据比对至基因组并构建 contig 间互作强度矩阵。然后，根据 Juicer 软件的输出，使用 3D-DNA 软件将 contig 挂载成为 scaffold。本文主要介绍如何使用 Juicer 软件分析 HiC 数据，下一篇博文将介绍 3D-DNA 软件的使用方法。

3.1 准备软件及数据

相比于其他软件，juicer 的使用较为复杂，因为 juicer 并不会自动的准备比对所需的数据，需要用户配置。

3.1.1 使用 mamba 安装 juicer

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	$ mamba install hcc::juicer

3.1.2 配置 juicer 软件环境

mamba 下载完成 juicer 软件后，并不能直接使用，因为包含了许多版本的 juicer，需要用户手动选择版本并配置相关环境。juicer 要求软件目录下包含 script/、references/、restriction_sites/ 三个文件夹。其中，script /目录下为 juicer 运行所需的脚本及 juicer_tools.jar 软件，references/ 目录下为参考基因组 fastq 文件及索引（bwa index 结果），restriction_sites/ 目录下为参考基因组酶切位点信息（generate_site_positions.py 结果）及 contig 长度信息，具体步骤如下。

1）创建 juicer 软件目录

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	$ mkdir /home/software/juicer-1.6
	$ cd /home/software/juicer-1.6/

2）创建 scripts 文件夹并下载 juicer_tools

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	$ ln -s /home/miniconda3/pkgs/juicer-1.6-cuda_py310hbd92243_0/share/juicer-1.6-0/scripts/CPU/ scripts

"ln -s" 命令将通过 conda 下载的 juicer 文件软链接到 juicer 软件目录下，并创建 scripts/ 文件夹，CPU 表示单核版本。此外，juicer 还有SLURM、AWS（Amazon Web Services）、LSF、UGER 等集群版本。集群版本中仅 SLURM 在维护，其余版本作者已弃用。CPU/ 目录下文件为 juicer 运行所需的脚本。

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	# 下载 juicer_tools
	$ wget https://s3.amazonaws.com/hicfiles.tc4ga.com/public/juicer/juicer_tools_1.22.01.jar

	# 将 juicer_tools 移至 scripts/common/ 目录下，方可被 juicer 调用
	$ cd scripts/common/
	$ ln -s /home/software/juicer-1.6/juicer_tools_1.22.01.jar juicer_tools.jar

3）创建 references 文件夹收纳参考基因及其索引

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	$ cd /home/software/juicer-1.6/
	$ mkdir references
	$ cd references/
	
	# 将 HiC 数据的参考基因组移至 references 目录下
	$ ln -s /home/hifiasm_output/hifi.asm.bp.p_ctg.fa hifi.asm.bp.p_ctg.fa
	
	# 构建基因组索引
	$ bwa index hifi.asm.bp.p_ctg.fa

4）创建 restriction_sites 文件夹并获取参考基因组酶切位点、contig 长度信息

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	$ cd /home/software/juicer-1.6/
	$ mkdir restriction_sites
	$ cd restriction_sites/
	$ python /home/miniconda3/pkgs/juicer-1.6-cuda_py310hbd92243_0/share/juicer-1.6-0/scripts/misc/generate_site_positions.py \
	DpnII salsola ../references/hifi.asm.bp.p_ctg.fa
		DpnII									限制性内切酶名称（用于切割参考基因组及输出文件命名）：
		salsola									参考基因组名称（用于输出文件命名）：
		../references/hifi.asm.bp.p_ctg.fa		参考基因组文件路径
		salsola_DpnII.txt						输出文件，即参考基因组的酶切位点文件
	
	# 获取 contig 长度信息
	$ awk 'BEGIN{OFS="\t"}{print $1, $NF}' salsola_DpnII.txt > salsola.chrom.sizes

3.1.3 配置 juicer 工作环境

juicer 要求工作目录下包含 fastq/ 文件夹，存放 HiC 测序文件。juicer 运行时会默认从 fastq 文件夹内读取 HiC 测序信息。

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	# 创建 fastq 文件夹并建立 HiC 测序数据软链接
	$ cd /home/juicer_output/
	$ mkdir fastq
	$ cd fastq/
	$ ln -s /home/hic_data/hic.1.fq hic_R1.fastq
	$ ln -s /home/hic_data/hic.2.fq hic_R2.fastq

PS：建立软链接避免数据重复占用存储空间。

PS：注意，juicer 只识别 fastq 文件夹内 _R.fastq 格式文件，软链接重命名时需要注意。

3.2 HiC 测序 reads 比对至参考基因组

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	$ cd /home/juicer_output/salsola/
	$ /home/software/juicer-1.6/scripts/juicer.sh -t 30 -g salsola -s DpnII \
	-p /home/software/juicer-1.6/restriction_sites/salsola.chrom.sizes \
	-y /home/software/juicer-1.6/restriction_sites/salsola_DpnII.txt \
	-z /home/software/juicer-1.6/references/hifi.asm.bp.p_ctg.fa \
	-D /home/software/juicer-1.6/
	
		-t		指定 bwa 比对 HiC 数据时的线程数（30）
		-g		基因组名称（salsola）
		-s		限制性内切酶类型（DpnII）
		-p		基因组长度文件（salsola.chrom.sizes）
		-y		限制性内切酶切割位点（salsola_DpnII.txt）
		-z		参考基因组文件（hifi.asm.bp.p_ctg.fa）
		-D		juicer 软件环境（/home/software/juicer-1.6/）

3.3 juicer 输出文件说明

juicer 完成比对后，会在工作目录下生成 aligned/、split/ 文件夹。splits 中为 juicer 运行的中间文件，在确认 juicer 正确运行完成后，可以通过执行 clean.sh 脚本以删除中间文件、压缩较大的输出文件。aligned 目录下存放的是 juicer 最终输出结果，包括 hic 文件（inter.hic 和 inter_30.hic）、统计信息（inter.txt）、有效配对（merged_nodups）等。其中，hic 文件为图谱文件，是高度压缩的二进制文件，存储了多个分辨率的接触矩阵，支持随机访问，可以导入 juicebox 可视化不同区段间的互作强度。inter_30.hic 中 "30" 表示通过 MAPQ>30 过滤之后的结果。merged_nodups.txt 是已去除重复项的 Hi-C 接触数据，是下游 3D-DNA 等挂载软件的输入文件。

比对结果说明文件（inter.txt）

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	Sequenced Read Pairs:  321,253,776
		Normal Paired: 164,730,220 (51.28%)
		Chimeric Paired: 102,464,533 (31.90%)
		Chimeric Ambiguous: 52,596,050 (16.37%)
		Unmapped: 1,462,973 (0.46%)
		Ligation Motif Present: 1,471,774 (0.46%)
	Alignable (Normal+Chimeric Paired): 267,194,753 (83.17%)
	Unique Reads: 186,269,122 (57.98%)
	PCR Duplicates: 80,925,631 (25.19%)
	Optical Duplicates: 0 (0.00%)
	Library Complexity Estimate: 346,626,043
	Intra-fragment Reads: 38,455,575 (11.97% / 20.65%)
	Below MAPQ Threshold: 89,116,252 (27.74% / 47.84%)
	Hi-C Contacts: 58,697,295 (18.27% / 31.51%)
		Ligation Motif Present: 267,200  (0.08% / 0.14%)
		3' Bias (Long Range): 52% - 48%
		Pair Type %(L-I-O-R): 25% - 25% - 25% - 25%
	Inter-chromosomal: 20,861,914  (6.49% / 11.20%)
	Intra-chromosomal: 37,835,381  (11.78% / 20.31%)
	Short Range (<20Kb): 24,785,356  (7.72% / 13.31%)
	Long Range (>20Kb): 13,049,600  (4.06% / 7.01%)

Alignable + Ambiguous + Unmapped = 100%
Alignable = Unique Reads + PCR Duplicates
Unique Reads = Intra-fragment Reads + Below MAPQ Threshold + Hi-C Contacts
Hi-C Contacts = Inter-chrom + Intra-chrom

Alignable (Normal+Chimeric Paired)：Normal Paired 和 Chimeric Paired 是序列比对领域的两个术语，这两类 Paired 都是有效 Paired。本案例中 HiC 测序数据中总共有 83% 的 Reads 是有效的。

PCR Duplicates：是指在 PCR 扩增过程中被重复扩增的序列。因为是重复信息，不纳入后续的分析，仅考虑 Unique Reads。一般以 30% 为阈值，如果测序数据的PCR重复度 >30%，说明 PCR 扩增轮数较高，测序结果已经饱和；如果 <30%，则说明还可以适当增加扩增轮数，提高测序结果中的信息量。

Intra-fragment Reads：Juicer 会按照特定的窗口大小（分辨率），将参考基因组序列划分为等长的 fragment，fragment 内的 Reads 称为Intra-fragment Reads。.hic 文件记录的是各染色体区域之间的相互作用矩阵，不包含区间内互作信息，所以 .hic 文件中不包含 Intra-fragment Reads 信息。从 Intra-fragment Reads 开始，后续条目均存在两个百分数，第一个百分数为该条目 Reads 数占总 Reads 数的比例，第二个百分数为该条目 Reads 数占 Unique Reads 的比例。

Below MAPQ Threshold：是指比对质量低于阈值（MAPQ<Threshold）的 Reads 数量。inter.txt 文件中 Threshold = 0，inter_30.txt 文件中Threshold = 30。

Hi-C Contacts：各染色体区域之间的互作的 Reads 数量。Unique Reads = Intra-fragment Reads + Below MAPQ Threshold + Hi-C Contacts，其中仅 Hi-C Contacts 的信息被记录在 .hic 文件中。

Inter-chromosomal：Hi-C Contacts 中片段间互作，即 Paired 中两个 Reads 比对到不同的片段上。本实验输入数据中片段为 contig，Inter-chromosomeal 表示 contig 间的互作数量。Intra-chromosomal 为片段内互作，即 Paired 中两个 Reads 比对到相同片段上。一般染色体内互作数量大于染色体间（intra>inter）