作者，Evil Genius
距离300万出关越来越近了。
我们的2026年空间转录组系列课程只要开始了，就一定会完整的上完，虽然我最近几年运气一直都比较差，但是我相信，卖盗版买盗版的人会慢慢把我的霉运通通承接过去，等待我的一定不会太差。
今日参考文献
知识积累
慢性炎症导致组织适应不良重塑
炎症扰乱正常的修复过程，引起组织增生、萎缩、变形，基质变硬或变松。
驻留细胞可发生死亡、过度增殖、转分化或衰老，免疫细胞也会稳定渗入组织结构。
RA滑膜异常增生的严重程度
RA滑膜从薄层衬里扩张为体积可超原体积20倍的高度血管化组织。
可形成绒毛状突起和侵袭性血管翳，侵蚀软骨和骨，但驱动这种扩张的机制尚不清楚。
RA滑膜的细胞复杂性
成纤维细胞增生，免疫细胞浸润形成异位淋巴结构。
单细胞研究已鉴定出超过70种细胞状态，但究竟哪些细胞驱动滑膜新生，以及发生在组织深部还是表面，仍不明确。
再生与纤维化的关系
正常组织再生需要基质细胞、免疫细胞（巨噬细胞、中性粒细胞等）和ECM因子的协同。
再生失调可导致纤维化，胶原沉积破坏组织功能。
SPP1hi巨噬细胞在纤维化中的已知角色
在肺、肝等器官中，SPP1hi巨噬细胞是促纤维化的关键细胞，与不良预后相关。
SPP1hi巨噬细胞在RA中的未解问题
RA虽不属于典型纤维化疾病，但约1/3患者滑膜富含SPP1hi巨噬细胞。
这些细胞在RA中究竟诱导纤维化，还是介导其他形式（如增生性）重塑，尚属未知。
结果1、SPP1hi巨噬细胞占据RA滑膜衬里微环境，与倾向于增殖和基质沉积的成纤维细胞相邻
使用Xenium空间转录组平台分析10例RA患者滑膜组织，480基因panel覆盖细胞谱系、RA细胞状态及组织重塑通路。
患者均为抗CCP和/或RF阳性，治疗史和组织学评分（淋巴细胞浸润、衬里增生）范围广泛
分析方法
细胞识别与分类：Baysor算法分割出4,274,575个细胞；SingleR结合RA参考数据集归入6大谱系；进一步亚聚类为33种精细细胞状态。
微环境聚类：基于局部空间邻域的细胞类型组成，识别出5个共享微环境。
空间富集分析：使用共定位商数（CLQ）量化目标细胞50 μm范围内其他细胞状态的非对称空间富集。
微环境差异表达（Niche-DE）：分析随邻近SPP1hi巨噬细胞密度变化，衬里成纤维细胞的基因表达改变。
蛋白质相互作用分析：对上调基因进行网络分析，评估其功能关联性。
微环境3（滑膜衬里） 富含HBEGF+衬里成纤维细胞（F2）和SPP1hi巨噬细胞（M2），且该微环境中增殖性成纤维细胞（F7）比例最高（F7高表达CCNB2、MKI67等分裂基因及MMP1、FAP等活化标志物）。
空间富集分析：增殖性成纤维细胞（F7）主要邻近SPP1hi巨噬细胞（M2）和cDC1s（M7）；SPP1hi巨噬细胞50 μm范围内，衬里成纤维细胞（F2）和增殖性成纤维细胞（F7）占比最高，且两者在空间上重叠或直接相邻。
SPP1hi巨噬细胞特征：高表达SPP1、CLEC5A、AQP9、FAPB5，共表达CCR2和MARCO，表达TREM2和RNASE1等抗炎标志物；少数组织中存在炎症性更强的M5亚群（SPP1hiCXCL8+）。它们不同于稳态衬里巨噬细胞（M1：FOLR2+）和炎性单核细胞来源细胞（M3）。
邻近效应（Niche-DE）：随着邻近SPP1hi巨噬细胞密度增加，衬里成纤维细胞上调组织生成因子（COL1A1、COL5A2、COL6A1、TGFB1、TNC等）、基质重塑因子（ITGB1、CTSK、CTSL、LGMN、PCOLCE、MMP1），同时下调衬里稳态标志物（CLIC5、HBEGF、GPR1、CD9）。
蛋白质相互作用：上调的12个基因产物显著互联，提示参与细胞外基质重塑的共享功能模块。
结果2、滑膜SPP1hi巨噬细胞与纤维蛋白共定位于缺乏致密胶原的微环境中
SPP1hi巨噬细胞的空间分布特征
SPP1hi巨噬细胞（M2、M5）在滑膜衬里层形成致密聚集体（线性排列或多层簇状），而其他髓系细胞（如M3 MonoDC）在组织中均匀分布，无聚集现象。
组织学染色发现：SPP1hi巨噬细胞区域富含纤维蛋白
H&E染色显示，含SPP1hi巨噬细胞的区域细胞外基质呈无定形、亮伊红染色，不同于间质中长而波浪状的胶原纤维。
多重组织学染色（Masson三色、PTAH、H&E）证实这些区域富含纤维蛋白，纤维蛋白呈薄层或宽达3mm的嵌入性聚集体，形成玻璃样网状结构包绕细胞。
纤维蛋白与SPP1hi巨噬细胞的正相关
空间上，富含纤维蛋白区域与SPP1hi巨噬细胞聚集体高度共定位。
定量分析显示，各样本中纤维蛋白面积百分比与SPP1hi巨噬细胞比例及面积百分比均呈正相关。
缺乏致密胶原（非纤维化）
圆偏振光显微镜检测双折射信号（反映高度有序的致密胶原）：含SPP1hi巨噬细胞的区域及周围无高双折射信号，表明不存在纤维化标志的致密胶原。
IF分析证实，OPN+CD14+巨噬细胞主要位于纤维蛋白丰富区（>50%细胞），而定位于富含胶原I区域的细胞不足1%。
RA滑膜衬里层中，SPP1hi巨噬细胞与纤维蛋白共定位于一个富含临时基质（纤维蛋白）但缺乏致密胶原（非纤维化） 的特殊微环境，提示该区域处于活跃的组织重塑状态，而非终末期纤维化。
结果3、RA滑膜SPP1hi巨噬细胞表现出促纤维化巨噬细胞特征
SPP1hi巨噬细胞的跨组织保守性
肺和肝脏纤维化中67%的促纤维化SPP1hi巨噬细胞与RA滑膜SPP1hi巨噬细胞转录组对齐。
关键标志基因（SPP1、CD9、LGALS3、FABP5）在两类细胞中均高表达，提示SPP1hi巨噬细胞在不同疾病和组织中具有保守的转录特征。
诱导RA SPP1hi表型的关键信号组合
已知促纤维化巨噬细胞需要三类信号：生长因子（M-CSF/GM-CSF）+ STAT3激活因子（IL-6/IL-17）+ TGF-β。
空间配体-受体分析表明，成纤维细胞和内皮细胞是M-CSF和TGF-β的主要局部来源，髓系细胞存在自分泌信号。
体外验证促纤维化组合
用M-CSF + IL-6 + TGF-β处理健康供者CD14+单核细胞，能诱导出与RA滑膜SPP1hi巨噬细胞高度一致的转录组和蛋白（OPN）表型；而促炎组合（M-CSF + TNF-α + PGE2）则诱导炎性单核细胞表型，不诱导OPN。
成纤维细胞 + TGF-β共培养可诱导OPN产生，该效应可被IL-6R抑制剂托珠单抗（TCZ） 阻断，表明成纤维细胞通过IL-6信号促进SPP1hi状态。
SPP1hi巨噬细胞的增殖亚群（M5）
空间转录组发现一个位于纤维蛋白沉积物深部的SPP1hiCXCL8hi（M5） 亚群，独特共表达增殖标志物（MKI67、CDK1、TOP2A）和炎症介质（IL1B、PTGS2、CXCL11）。
体外增殖实验与体内差异
M-CSF单独即可驱动巨噬细胞增殖，TGF-β则延迟增殖 onset。
体外添加TGF-β抑制了M5特征的增殖/炎症基因模块，与体内M5亚群的存在不符。
提示体内纤维蛋白沉积微环境可能提供额外信号，克服TGF-β的抑制作用，允许M5亚群增殖。
结果4、SPP1hi巨噬细胞消化纤维蛋白并支持成纤维细胞增殖
巨噬细胞不促进凝血，反而抑制自发凝血
虽然SPP1hi巨噬细胞高表达凝血相关基因（SERPINE1、F13A1），但体外实验显示其不促进纤维蛋白凝块形成，反而抑制无细胞血浆的自发凝血。
炎性巨噬细胞（M-CSF+TNF-α±PGE2）则快速促进凝血。
SPP1hi巨噬细胞具有纤溶（降解纤维蛋白）能力
SPP1hi巨噬细胞高表达纤溶相关基因（MMP1、MMP3、CTSL、PLAUR），且这些细胞与高表达纤溶基因程序的髓系细胞在组织边缘纤维蛋白沉积处共定位。
体外纤维蛋白凝胶降解实验：M-CSF+IL-6+TGF-β诱导的SPP1hi巨噬细胞在5天内完全溶解纤维蛋白凝胶，而促炎巨噬细胞几乎不能降解凝胶。
SPP1hi巨噬细胞通过吞噬作用摄取纤维蛋白
SPP1hi巨噬细胞高表达吞噬相关基因（MARCO、TREM2）。
荧光标记纤维蛋白摄取实验显示，SPP1hi巨噬细胞吞噬纤维蛋白量最高，促炎巨噬细胞无 detectable 摄取。
纤维蛋白摄取机制的药理学解析
依赖纤溶酶（氨甲环酸抑制有效）和组织蛋白酶（阿洛司他丁抑制有效）。
不依赖基质金属蛋白酶（伊洛马司他无效）和发动蛋白依赖性内吞（dynasore无效）。
依赖肌动蛋白聚合（细胞松弛素D抑制有效），提示为吞噬而非内吞途径。
OPN抗体阻断对纤维蛋白摄取无影响。
SPP1hi巨噬细胞通过OPN促进成纤维细胞增殖
空间转录组显示SPP1hi巨噬细胞与增殖性成纤维细胞（F7）高度共定位。
体外共培养+OPN阻断抗体实验证实，SPP1hi巨噬细胞通过分泌OPN支持成纤维细胞增殖。
核心结论
SPP1hi巨噬细胞在纤维蛋白微环境中发挥双重功能：
降解纤维蛋白（通过纤溶酶、组织蛋白酶介导的酶性降解 + 肌动蛋白依赖的吞噬摄取）；
促进成纤维细胞增殖（通过分泌OPN）。
这些功能共同支持组织重塑和增生性生长，而非简单的凝血或纤维化。
结果5、RA滑膜中SPP1hi巨噬细胞特征受IL-6R抑制而减弱
研究假设与分析方法
假设：IL-6R抑制剂（托珠单抗，TCZ）的临床疗效部分源于靶向SPP1hi巨噬细胞。
分析数据：来自TCZ和RTX（利妥昔单抗，B细胞耗竭疗法）治疗组的滑膜bulk RNA-seq数据。
分析方法：加权基因共表达网络分析（WGCNA）+ 配对差异分析。
TCZ特异性抑制模块2
两种药物（TCZ和RTX）均抑制模块4（广泛炎症/免疫信号通路）。
TCZ独特抑制模块2，该模块包含：
线粒体基因（ATP5PB、SDHC）
生物合成基因
SPP1hi巨噬细胞标志物（LGALS3、FABP5）
模块2的空间定位
模块2基因在滑膜衬里微环境（微环境3） 中富集，该区域正是SPP1hi巨噬细胞、纤维蛋白、增殖和基质重塑成纤维细胞所在之处，将TCZ效应与这些细胞/结构的空间位置联系起来。
TCZ下调SPP1hi巨噬细胞亚群
预测TCZ下调的前五种细胞类型包括：两种SPP1hi巨噬细胞亚群 + 两种炎性单核细胞 + 一种衬里下层组织巨噬细胞。
RTX主要下调B细胞/浆细胞亚群，说明TCZ对髓系（尤其是SPP1hi巨噬细胞）的靶向作用是特异性的。
体外-体内一致性验证
体外SPP1hi表型细胞（巨噬细胞+成纤维细胞+TGF-β）经TCZ处理下调的基因，在患者TCZ治疗后样本中也同样下调，验证了模型与临床数据的一致性。
SPP1hi巨噬细胞在原位接受IL-6信号
IF染色显示，大多数pSTAT3+CD14+巨噬细胞共表达OPN。
证明RA滑膜中的SPP1hi巨噬细胞活跃参与IL-6R信号传导，为其作为TCZ直接靶点提供了原位证据。
核心结论
TCZ（IL-6R抑制剂）在RA滑膜中有效减少SPP1hi巨噬细胞。
SPP1hi巨噬细胞是TCZ作用的主要靶细胞之一，这为IL-6R抑制剂在髓系丰富型RA患者中的疗效提供了机制解释。
