Fab（Fragment antigen‑binding，抗原结合片段），是 IgG 抗体经木瓜蛋白酶水解铰链区得到的抗原结合单元；也可通过基因工程重组表达获得，是抗体工程、噬菌体展示、结构生物学、双抗构建中最主流的模块化元件之一。完整 IgG 一条 Y 臂即为 1 分子 Fab，单价结合抗原，无 Fc 片段，不具备 ADCC、CDC 效应功能。
一、分子结构与基础参数
- 组成：完整轻链（VL‑CL）+ 重链 Fd 段（VH‑CH1），依靠链间二硫键组装为异二聚体。
- 分子量：50‑55 kDa，约为全长 IgG（150 kDa）的 1/3。
- 结合特性：单价抗原结合，保留亲本抗体完整 CDR 抗原识别能力；无 Fc，不会与细胞 Fcγ 受体发生非特异性结合，降低背景干扰。
区分概念
- Fab：单价，50 kDa；木瓜蛋白酶酶切产物
- F(ab')₂：双价，~110 kDa；胃蛋白酶酶切，两个 Fab 通过铰链二硫键相连，保留双抗原结合能力，无 Fc 段。
二、核心优势与固有短板
✅核心优势
- 稳定性优于 scFv：依靠天然二硫键维持构象，无 linker 依赖，VH/VL 不会发生解离错配，聚集风险显著低于单链 scFv。
- 低非特异背景：缺失 Fc 区域，免疫检测、细胞实验中规避 Fc 受体介导的非特异性吸附，适合诊断试剂、流式、免疫组化。
- 表达体系灵活：大肠杆菌周质、酵母、哺乳动物细胞均可表达；是噬菌体展示、酵母展示最常用的抗体文库格式之一PMC。
- 成药基础成熟：已有多款 FDA 获批 Fab 类治疗药物，工艺路线成熟，可直接作为阻断型治疗分子，也可作为双特异、ADC 的 building block。
- 结构生物学利器：Fab 结合抗原能够稳定膜蛋白（GPCR、离子通道）构象，助力冷冻电镜、蛋白结晶解析抗原三维结构。
⚠️主要局限
- 单价结合，无亲合力效应，同等浓度下结合信号弱于全长 IgG。
- 体内半衰期短，无 Fc 介导的 FcRn 循环，肾脏快速清除；如需体内长循环，需要做 Fc 融合、PEG 修饰、白蛋白融合改造。
- 原核表达需要二硫键正确折叠，轻重链表达量不平衡时，容易产生游离轻链杂质，增加纯化压力。
三、Fab /scFv/ VHH（纳米抗体）横向对比
| 格式 | 结构 | 分子量 | 稳定性 | 组织穿透 | 主要短板 |
|---|---|---|---|---|---|
| Fab | VL‑CL + VH‑CH1（二硫键） | 50‑55 kDa | 高 | 中等 | 半衰期短；双链表达纯化复杂 |
| scFv | VH‑linker‑VL | 25‑30 kDa | 较低，易聚集 | 高 | linker 易剪切，VH/VL 解离 |
| VHH 纳米抗体 | 单结构域 VHH | 12‑15 kDa | 极高 | 极高 | 单域，部分靶点表位受限 |
四、主流制备方式
- 蛋白酶水解法：完整 IgG 经木瓜蛋白酶切割，获得天然 Fab；适合小量科研，批次差异大，不适合大规模药物开发。
- 重组基因工程表达（主流）
- 双顺反子载体，分别表达轻链、重链 Fd 片段；原核周质分泌（PelB/OmpA 信号肽），实现二硫键正确折叠；
- 也可使用 HEK293、CHO 真核系统，适合高难度折叠分子；
- 纯化策略：His‑tag、Protein L、Protein G、离子交换、SEC‑HPLC 去除聚集体与游离轻链杂质。
- 文库筛选：构建 Fab 噬菌体 / 酵母展示文库，直接淘选得到特异性 Fab 克隆，是全人源抗体发现的经典路径。
五、研发应用场景
1. 治疗药物开发
Fab 无效应功能，多用于受体 / 配体阻断，不杀伤靶细胞。
- 眼科、抗炎、抗血栓；部分药物用于局部给药；
- 作为双特异性抗体的结构模块，常见于 IgG‑like 双抗、Cross‑Mab；
- 构建 Fab‑毒素偶联分子，作为 ADC 变体。
2. 结构生物学（高频应用）
GPCR、膜蛋白、离子通道构象不稳定，结合 Fab 后可固定蛋白构象，大幅提升冷冻电镜分辨率，是解析膜蛋白三维结构的标准手段。
3. 科研与体外诊断
- SPR/BLI 分子互作：Fab 用于测定抗原亲和力，消除 Fc 段带来的非特异干扰；
- 流式、免疫荧光、免疫组化：降低 Fc 受体背景；
- 免疫层析、化学发光诊断原料。
4. 抗体药物早期发现
从 Fab 文库淘选得到阳性克隆后，可直接重排为全长 IgG，完成抗体亲和力成熟、人源化。
六、关键质量评价指标
- SEC‑HPLC：检测聚集体、游离轻链杂质；
- BLI/SPR：测定与抗原的 KD 亲和力；
- 热稳定性 TSA，评估蛋白热变性温度；
- 功能实验：阻断活性、配体‑受体竞争结合实验；
- 表达工艺：轻重链表达平衡性、收率、内毒素控制。
小结
Fab 是介于全长 IgG 与小分子单链片段之间的黄金中间格式，相比 scFv 具备更优的结构稳定性；相比全长 IgG 拥有更小尺寸、无 Fc 干扰。广泛用于抗体发现、结构生物学、诊断试剂、双抗分子构建；短板在于单价结合与体内半衰期，需要通过融合修饰手段弥补药代缺陷。