纳米抗体又称 VHH 抗体，源自骆驼科动物重链仅有的可变区片段，是目前抗体工程领域极具潜力的小型化抗体分子。对比传统 IgG 抗体，纳米抗体分子量小、组织穿透能力强、稳定性高、易进行微生物表达，在靶点验证、体内成像、诊断试剂、靶向药物等场景得到广泛应用。完整的纳米抗体开发体系涵盖动物免疫、文库构建、筛选淘选、分子改造、表达纯化与活性表征，是一套标准化的抗体发现技术流程。
一、免疫与 B 细胞来源制备
纳米抗体开发首选驼类动物进行靶点免疫，通过多次免疫刺激，激活机体产生靶向抗原的特异性重链抗体。免疫过程需要控制抗原剂量、免疫周期，免疫结束后采集外周血，分离淋巴细胞，提取总 RNA 并反转录得到 cDNA。针对部分难免疫抗原，也可采用非免疫文库、合成文库替代动物免疫文库，直接进行体外筛选，省去动物免疫周期。
二、VHH 基因扩增与文库构建
以 cDNA 为模板，利用特异性引物扩增编码 VHH 结构域的基因片段。将回收纯化后的 VHH 片段插入噬菌体、酵母或者核糖体展示载体，构建重组质粒，转化宿主细胞，建立纳米抗体文库。文库核心质控指标包括库容、多样性、插入阳性率。库容代表文库分子数量，多样性决定后续能否筛到不同序列的阳性克隆；低多样性文库容易出现克隆冗余，很难获得高亲和力候选 VHH。
三、体外淘选与阳性克隆初筛
最常用为噬菌体展示淘选技术，将文库与固定化抗原进行多轮亲和富集，逐步富集能够结合靶抗原的 VHH 克隆。每一轮淘选包含抗原结合、洗涤去除非特异性结合分子、洗脱回收特异性噬菌体、扩增，经过 2～4 轮循环富集。富集完成后挑取单克隆，通过 ELISA 开展初步结合筛选，筛选出具备抗原结合活性的阳性克隆，测序获得 VHH 基因序列。
四、分子改造与亲和力成熟
初筛得到的阳性纳米抗体亲和力往往达不到应用要求，需要开展亲和力成熟。常见策略包括对 CDR 区进行随机突变、定点突变，构建突变文库，再次进行高通量筛选，获得亲和力提升的突变体。同时可根据使用需求开展序列优化：密码子优化提升表达量、去突变降低免疫原性、引入二硫键提升热稳定性，或者串联构建多价纳米抗体、双表位纳米抗体，强化结合活性。
五、纳米抗体表达、纯化
将优化后的 VHH 基因克隆至原核或真核表达载体。大肠杆菌原核表达体系成本低、周期快，是科研级纳米抗体最主流选择；对于需要复杂折叠、糖基化修饰的分子，则采用酵母、哺乳动物细胞表达。表达后的上清或菌体裂解液，利用标签亲和层析捕获目标纳米抗体，再经过离子交换、凝胶过滤层析进一步去除聚集体、杂蛋白，得到高纯度单体 VHH 样品。
六、活性与理化表征验证
获得纯化纳米抗体后开展多维度鉴定。采用 BLI 或 SPR 测定抗原结合动力学，获取亲和力参数；通过 ELISA、细胞结合实验验证细胞水平抗原结合活性；开展热稳定性检测评估蛋白耐温特性；SEC-HPLC 检测单体纯度与聚集情况。根据应用场景，还可进一步开展细胞功能实验、体内动物成像或者体内药效评价。
七、开发难点与应用方向
纳米抗体开发的主要挑战：部分抗原免疫后有效 VHH 克隆偏少、文库多样性不足、筛选得到的分子存在非特异性结合、单体易发生聚集。经过完整开发流程获得的纳米抗体，可用于体外诊断试剂、体内分子影像探针、蛋白抑制剂、CAR-T 胞外识别单元，以及肿瘤、炎症等疾病靶向药物研发。