Science Advances｜基于精准边界定位解析原核前噬菌体驯化与活性病毒“暗物质”

摘要

前噬菌体（provirus/prophage）是原核基因组中广泛存在的元件，但其系统刻画长期受限于整合边界识别误差。作者开发ProBord（Provirus Border Delimiter，前噬菌体边界界定器），通过跨基因组比对宿主attB位点实现单碱基精度边界定位；基于该工具构建包含430,134条边界限定前噬菌体（border-delimited provirus，BDP）的数据库。分析显示，BDP携带毒力因子基因、抗生素抗性基因、防御与抗防御系统等多类功能基因，并呈现位置特异性分布。将BDP与边界未限定前噬菌体（border-undelimited provirus，BUP）比较，作者揭示一种普遍性驯化规律：BUP选择性丢失病毒核心基因，但通过快速缺失或渐进突变保留对宿主有益的功能模块。进一步联合ProAct（Provirus Activity Detector，前噬菌体活性检测器）与ProBord进行反向挖掘，获得101例被主流工具遗漏的"暗"前噬菌体（dark provirus，DP），其多数关联病原细菌。该框架集成工具、理论与资源，包括逾430,000条BDP、4,910条活性前噬菌体与101条DP，用于解析原核前噬菌体的组成、功能与演化。

关键词：前噬菌体（provirus）；边界界定；ProBord；ProAct；暗前噬菌体（dark provirus）；驯化（domestication）；attB/attL/attR；活性检测；原核基因组

文献信息

Zhang M, Hao Y, Yi Y, Wang Y, Zhang T, Xiao X, Jian H（2026）. Deciphering pervasive domestication and active "dark matter" of proviruses in prokaryotes via precision border mapping. Science Advances 12, eaec5299. https://doi.org/10.1126/sciadv.aec5299
期刊：Science Advances（美国AAAS旗下开放获取综合期刊，ISSN 2375-2548）
2025年度二维影响因子（2026年JCR发布）为13.9，五年影响因子14.8，JCR多学科科学（Multidisciplinary Sciences）Q1
发表时间：2026年9月30日

研究总结

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工具开发
ProBord单碱基边界
ProAct覆盖深度活性
ProBord-ProAct暗病毒
数据库资源
BDP边界库
活性前噬菌体集
暗前噬菌体集
核心发现
att位点规律
功能基因分布
驯化退化模式
方法应用
基因组预处理
跨组比对评分
测序覆盖定量

背景介绍

温和病毒（temperate virus）在原核裂解-溶原循环中可整合入染色体，形成前噬菌体。整合依赖病毒attP与宿主attB位点的特异重组，由整合酶（integrase）等催化；整合后两端形成attL与attR，诱导切除时恢复attP与attB。传统观点将前噬菌体视为"定时炸弹"，但大量证据表明其调控宿主复制、转录、生物膜、胁迫耐受及毒力。大规模基因组分析显示前噬菌体在细菌与古菌中普遍存在，海洋、肠道、植物叶际等环境均有高溶原率。

然而，geNomad、VIBRANT、VirSorter2、PHASTEST等主流工具多以病毒标志蛋白锚定区域，不能报告精确整合坐标；基准评估显示其边界偏差可达4.8--95.5 kb，常过度纳入宿主序列或遗漏病毒片段。该缺陷阻碍功能基因定量、整合规律分析与活性判断。为此，作者提出以跨基因组attB重建为核心的方法学体系，并在大尺度基因组中系统重估前噬菌体结构、功能、驯化与活性。

重要结果

结果1 ProBord精准界定前噬菌体边界

作者以285条具已知att核心（att core）的基准前噬菌体评估七种主流工具，其平均边界偏差为4.8--95.5 kb，存在过度预测与欠预测两类系统误差；以大肠杆菌λ、铜绿假单胞菌B3、沙门氏菌P22为例，最大偏差可达184,462 bp。ProBord采用三段流程：对外源预测病毒区去宿主污染并两端延伸5 kb形成混合序列（mix-seq）；按短核心附件序列（CAC，5--11 bp）通过跨基因组覆盖突变定位att热区，长CAC（≥12 bp）通过末端互比定位；将候选CAC向侧翼延伸100 bp组装attB并在原核参考组中比对评分。基准集中ProBord召回率89.47%、精确率93.41%，平均偏差由4,783 bp降至98 bp，单碱基/单核苷酸水平界定89.47%前噬菌体边界，优于TIGER与PHASTEST。

图1 ProBord精准界定前噬菌体边界。A 位点特异性整合原理：未占用attB经跨基因组比对反推attL/attR。B 三段式流程：混合序列构建、CAC识别、候选attB评分。C 以Mu样元件示跨基因组比对中前病毒区与侧翼宿主区覆盖差异。D 基准集召回率与精确率比较，ProBord高于TIGER与PHASTEST及七种常规工具。E 边界长度偏差箱线图，ProBord将均值由数千碱基降至约98 bp。所有面板共同证明跨基因组attB锚定可消除常规工具的系统过预测与欠预测。

结果2 基于BDP的大规模特征与功能重分析

作者在411,904个原核基因组（细菌409,439、古菌2,465）中由794,486条预测前噬菌体获得430,134条BDP，占细菌前噬菌体54.15%、古菌前噬菌体28.64%。BDP长度呈双峰分布（峰值16,075与42,736 bp），99.76%不超过100 kb，少数超过200 kb。28个含逾千条BDP的原核家族中，BDP共编码毒力因子基因71,457个、抗生素抗性基因2,635个、抗菌肽基因8,253个、防御系统基因94,929个、抗防御系统基因62,580个。毒力因子以免疫调节、外毒素、效应传递为主；抗性以多重耐药为主；防御以限制修饰（RM）与AbiU为主，抗防御以抗RM、抗CRISPR、抗Thoeris为主。位置分析显示毒力因子与抗菌肽近端点富集，抗性基因中央富集，防御/抗防御较均匀；并存在防御-抗防御共载6,632例等功能共现。

图2 BDP规模特征与功能构成。A 分析流程与基因组覆盖范围。B BDP基因组长度双峰分布及分类层级差异。C 按病毒操作分类单元（vOTU）、属、科层面的饱和度。D 28个高频原核家族中BDP功能基因汇总，包括毒力因子、抗生素抗性、抗菌肽、防御系统与抗防御系统的数量与相对比例，展示前噬菌体作为宿主功能载体的广泛编码潜力。

结果3 BDP整合位点与att核心特征

BDP的att核心91.16%不超过100 bp，总体双峰峰值14与47 bp；不同原核谱系长度分布异质，部分类群单峰、部分双峰或多峰。同物种、同属attB匹配率分别为95.10%与99.57%，跨物种与跨门匹配率降至79.98%与19.86%，随分类距离扩大而下降。按病毒分类层级聚类，att核心单序列簇比例由种级79.89%降至科级10.25%，长度变异系数由0.12升至0.67，说明att保守性与病毒分类等级相关。整合位置分析显示39.9%插入编码区（CDS）、38.5%插入RNA位点、17.5%插入基因间区；RNA靶点中tRNA占74.8%，其中Arg、Ser、Leu占比最高。按整合酶类型划分，Y型整合酶（Y-int）att核心平均43 bp且偏好RNA靶标，S型整合酶（S-int）偏好CDS，转座酶（Tnp）相关BDP很少进入RNA。

图3 BDP整合位点与att核心规律。B 各原核类群att核心长度分布。C 同物种/同属attB匹配比例。D 跨分类层级att匹配率递减。E、F 按核酸相似度的att核心聚类数目随病毒分类等级变化。G、H 按长度的att核心变异系数变化。I RNA靶点组成，tRNA为主。J 不同整合酶类别对CDS/RNA靶标偏好。K 不同整合酶类别att核心长度差异。M 整合酶/转座酶在病毒基因组的端点位置富集模式。

结果4 前噬菌体驯化与BUP退化模式

BUP即ProBord无法获得典型att边界的前噬菌体。比较显示55.60% BUP短于20 kb，58.08%完整度低于50%；BDP中位长度37.0 kb、完整度98.1%，BUP中位17.8 kb、完整度42.4%。在病毒操作分类单元、属、科聚类下，BDP与BUP重叠度随层级升高而增加，说明二者具有同源演化关系。功能上，BDP在整合/切除、头部/包装等生命周期核心类目占比显著高于BUP（如整合/切除93.88%对64.39%），而"moron"类宿主互作附属基因比例无显著差异。同源序列覆盖（HSC）分析显示，BDP-BUP对在高相似区间（90--100%）骤降，提示BUP虽与BDP高度相似但常带大片段缺失。整体符合两套退化路径：快速缺失与渐进突变，最终使前噬菌体丧失att边界与核心模块、保留对宿主有益功能。

图4 前噬菌体驯化模式。A、B BDP与BUP基因组长度、完整度分布对比。C 病毒操作分类单元/属/科层面两类元件聚类重叠。D 病毒生命周期功能类目占比差异，核心基因在BUP中选择性丢失。E 毒力、抗性、抗菌肽、防御、抗防御五类附属功能比较。F、G 同源序列覆盖密度与拟合斜率，BDP-BUP在高相似区间因大片段缺失而骤降。I 代表性BDP-BUP基因组共线性案例，展示att丢失、核心模块缺失及moron保留。

结果5 ProAct鉴定活性前噬菌体及ESKAPE病原分布

ProAct基于全基因组测序（WGS）读数深度，定义前噬菌体/宿主覆盖比（PtoH）；溶原状态下PtoH≈1，向裂解转换后病毒自主复制使PtoH>1，以1.5为活性阈值。作者在63,309个原核基因组的76,432个SRA数据集中对127,286条BDP进行评估，检出4,910条活性前噬菌体（3.99%），覆盖97科253属，大肠杆菌、链球菌、沙门氏菌、克雷伯氏菌、葡萄球菌数量居前。WHO优先ESKAPE病原中获1,067条活性前噬菌体，其中肺炎克雷伯菌340、铜绿假单胞菌248、金黄色葡萄球菌282。蛋白共享网络显示宿主特异性聚团；金葡菌活性前噬菌体集中携带葡萄球菌激酶、肠毒素、β溶血素、补体抑制因子等毒力因子，并共载防御与抗防御系统，说明活性前噬菌体可借助可移动毒力决定簇增强病原互作与致病性。

图5 ProAct活性前噬菌体检测与病原分布。A 从SRA读数到PtoH调用的流程范围。B 各宿主活性前噬菌体数量及多活性元件共载情况。C ESKAPE六类病原中活性前噬菌体计数。D 病毒蛋白共享网络，按宿主属聚团。E 金葡菌活性前噬菌体中毒力因子、防御、抗防御细分。F 其他ESKAPE成员中毒力因子类型分布，包括超抗原、溶血素、脂多糖相关因子等。

结果6 联合流程反向挖掘暗前噬菌体（DP）

主流工具依赖已知病毒标志，对高度分化、隐秘前噬菌体检出能力弱。作者以ProAct先筛PtoH升高的复制区段，再要求存在整合酶及尾/裂解/头类标志蛋白，最后用ProBord确定att与边界，获得101条DP，均未被geNomad、VIBRANT、VirSorter2同时检出。DP在肺炎克雷伯菌（22）、肠炎沙门氏菌（17）、大肠杆菌（13）等病原中富集；PtoH均值2.6，93.14%长度低于40 kb（均值23.46 kb），近60%基因为未注释蛋白，远高于其他活性前噬菌体（14.01%）。蛋白网络显示多数DP独立成团。案例包括脓肿分枝杆菌11.46 kb DP（17个基因、PtoH=2.84）与金葡菌DP（携抗RM基因与四环素抗性基因），说明小基因组、高未注释率是常规工具漏检主因，也提示其临床可移动风险。

图6 暗前噬菌体反向挖掘。A DP宿主属分布，病原菌占优势。B PtoH活性比值分布。C DP基因组长度分布，整体偏小。D 注释状态比较，DP未注释基因比例显著升高。E 病毒蛋白共享网络，DP多形成独立簇。F 脓肿分枝杆菌DP基因组图，含整合/切除、调控、头部/包装模块。G 金葡菌DP基因组图，含抗RM与四环素抗性基因，示免疫逃逸与抗性转移潜力。

方法学参考

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CheckV去宿主污染并两端延伸5kb生成mix-seq
短CAC滑动窗口定位att热区且长CAC BLASTn互比
候选CAC侧翼各延100bp组装attB并跨原核参考组比对评分
按最高分反推attL与attR输出单碱基BDP边界
输入宿主WGS过滤后读数
BWA比对宿主基因组并计算深度
按ProBord边界取前噬菌体深度且按单拷贝基因取宿主深度
计算PtoH比值并以1.5判活性
活性窗口筛查整合酶及尾裂解头标志且排除转座酶
ProBord界定边界输出暗前噬菌体

上述流程中，mix-seq扩展、覆盖突变扫描、候选attB双翼平衡评分可用于其他带重复边界的可移动元件（基因组岛、整合共轭元件、转座子）界定；PtoH覆盖模型可迁移至宏基因组或长读长数据中的复制型病毒元件定量。

总结

作者针对前噬菌体研究的核心方法学缺口，提出以跨基因组attB重建为核心的ProBord边界框架，将大规模预测前噬菌体的边界误差由公里级降至百碱基级；基于此构建430,134条BDP资源，系统阐明att核心保守性、整合位点偏好、功能基因位置分层及与病毒分类的关联。通过BDP与BUP比较，研究给出可普遍适用的前噬菌体驯化模型：核心病毒功能选择性丢失、宿主互作模块保留，路径包括快速缺失与渐进突变。ProAct以测序覆盖比定量活性，在ESKAPE等病原中识别4,910条活性前噬菌体；ProBord-ProAct反向流程进一步获得101条常规工具遗漏的DP，揭示小基因组、高未注释率的隐秘病毒组分。整体工作在工具、理论、资源三个维度为原核病毒"暗物质"的功能解码、病原风险评估与微生物基因组可塑性研究提供基础。

参考文献

Zhang M, Hao Y, Yi Y, Wang Y, Zhang T, Xiao X, Jian H（2026）. Deciphering pervasive domestication and active "dark matter" of proviruses in prokaryotes via precision border mapping. Science Advances 12, eaec5299. https://doi.org/10.1126/sciadv.aec5299
Science Advances期刊指标页：https://www.science.org/content/page/journal-metrics-overview
NCBI RefSeq与GenBank：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/ 、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
CheckV工具与聚类脚本：https://bitbucket.org/berkeleylab/checkv/src/master/
PHROGs病毒功能注释：可检索PHROGs数据库用于前噬菌体结构/生命周期基因注释
VFDB毒力因子库：http://www.mgc.ac.cn/VFs/ ；SARG抗性基因库用于抗生素抗性注释
DefenseFinder与Macrel：分别用于防御/抗防御系统、抗菌肽预测
geNomad、VIBRANT、VirSorter2、PHASTEST等基准工具文档，用于前噬菌体预测比较与暗病毒交叉过滤