RNA 35. SCI 文章基于RNA-seq推断CNVs (RNAseqCNV)

转录组测序(RNA-seq)被广泛用于检测急性淋巴细胞白血病(ALL)的基因重排和定量基因表达，但其在鉴定CNVs方面的实用性和准确性尚未得到很好的描述。由于非整倍体亚型在ALL中的高发，通过RNA-seq推断出的CNV信息对于指导ALL的疾病分类和风险分层具有很高的信息性。在这里，我们描述了RNAseqCNV，一种从RNA-seq数据中检测大规模拷贝数变化的方法。我们使用基于归一化基因表达和小等位基因频率的模型对ALL中臂水平的CNVs进行了分类，准确率很高(总体为99.1%，非二倍体染色体臂为98.3%)，该模型在急性髓性白血病中进一步验证了出色的表现(总体为99.8%，非二倍体染色体臂为99.4%)。RNAseqCNV在调用ALL数据集中的cnv方面优于其他基于RNA-seq的算法，特别是在具有高比例cnv的样本中。CNV与基于DNA的CNV结果高度一致，比传统的基于细胞遗传学的核型更可靠。RNAseqCNV提供了一种在没有DNA分析的情况下稳健识别拷贝数变化的方法，进一步增强了RNA-seq对ALL亚型的分类能力。

软件包安装

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# install devtools
install.packages("devtools")

# install RNAseqCNV package
devtools::install_github(repo = "honzee/RNAseqCNV")

数据读取

软件包和Shiny应用程序都接收到相同的输入。每个基因读取计数和SNV突变等位基因频率(MAF)被用来产生结果。因此，每个样本需要两种类型的信息。可以在包目录中找到输入文件的示例。使用如下命令定位软件包目录:

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# Examples of basic function calls:
library(RNAseqCNV)
system.file("extdata", package = "RNAseqCNV")
## [1] "D:/R-4.2.1/library/RNAseqCNV/extdata"
list.files(system.file("extdata", package = "RNAseqCNV"))
##  [1] "config_mock.txt"         "diploid.HTSeq"          
##  [3] "diploid.snv"             "high_hyperdiploid.HTSeq"
##  [5] "high_hyperdiploid.snv"   "low_hypodiploid.HTSeq"  
##  [7] "low_hypodiploid.snv"     "metadata_mock"          
##  [9] "near_haploid.HTSeq"      "near_haploid.snv"

要运行软件包或Shiny应用程序，需要正确格式的配置文件和metadata文件的路径:

config 文件

配置文件定义了输出目录(out_dir)、读计数文件目录(count_dir)和SNV文件目录(snv_dir)。更改相应的文件目录，但保持关键字相同，如下例所示:

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out_dir = "/Path/to/output_dir"
count_dir = "/Path/to/dir/with/count_files"
snv_dir = "/Path/to/dir/with/vcf_files"

比如我们这里使用的是软件包里面的例子：

将这个文件copy到自己的分析目录，否则会保存，因为输出目录就是当前目录。

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out_dir = "./"
count_dir = system.file("extdata", package = "RNAseqCNV")
snv_dir = system.file("extdata", package = "RNAseqCNV")

metadata 文件

metadata文件包含三列(以逗号/tab/空格分隔):

1.样品标识;

2.计算文件;

3.Vcf /custom文件。

注：不接受标题行，列的顺序必须与下面的示例相同:

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diploid diploid.HTSeq diploid.snv
high_hyperdiploid high_hyperdiploid.HTSeq high_hyperdiploid.snv
low_hypodiploid low_hypodiploid.HTSeq low_hypodiploid.snv
near_haploid near_haploid.HTSeq near_haploid.snv

再来详细说明以下这三种文件的格式：

Read count file

HTSeq-count或类似读计数软件的输出。表必须有两列:

1.集合基因id;

2.read counts;

注：表不应该有标题。

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ENSG00000000005	0
ENSG00000000419	94
ENSG00000000457	128
ENSG00000000460	133
ENSG00000000938	171
ENSG00000000971	5

SNV information

VCF文件可以通过运行GATK流程获得的vcf文件：

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#CHROM	POS	ID	REF	ALT	QUAL	FILTER	INFO	FORMAT	sample_name
1	14792	.	G	A	156.77	.	AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=-1.442;ClippingRankSum=0.000;DP=27;ExcessHet=3.0103;FS=1.690;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=60.00;MQRankSum=0.000;QD=5.81;ReadPosRankSum=-0.169;SOR=1.124	GT:AD:DP:GQ:PL	0/1:19,8:27:99:185,0,644
1	14907	.	A	G	126.77	.	AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=-0.015;ClippingRankSum=0.000;DP=10;ExcessHet=3.0103;FS=2.808;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=60.00;MQRankSum=0.000;QD=14.09;ReadPosRankSum=0.751;SOR=1.170	GT:AD:DP:GQ:PL	0/1:3,6:9:64:155,0,64
1	14930	.	A	G	161.77	.	AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=0.751;ClippingRankSum=0.000;DP=10;ExcessHet=3.0103;FS=2.808;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=60.00;MQRankSum=0.000;QD=17.97;ReadPosRankSum=2.515;SOR=1.170	GT:AD:DP:GQ:PL	0/1:3,6:9:64:190,0,64

Custom tabular data

该表有四个必需的列:

chr: 染色体;

start: SNV的位置;

depth: SNV位点的深度;

maf:突变等位基因频率，可以计算为突变等位基因的深度(与参考基因组相比)除以该位点的总体 reads的深度。

head名称应遵循以下格式:

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chr	start	depth	maf
1	14599	40	0.5
1	14604	9	0.3333
1	14610	10	0.25

实操

基因组选择

可设置参数：genome_version = "hg38" or "hg19" 。

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# example of wrapper function (DO NOT RUN)
RNAseqCNV_wrapper(config = "config_mock.txt", metadata = "metadata_mock", snv_format = "custom",
    genome_version = "hg38")

Arm-level figures

Arm-level figures的绘制显著增加了每个样本的运行时间。您可以通过arm_lvl = FALSE减少运行时间:

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RNAseqCNV_wrapper(config = "config_mock.txt", metadata = "metadata_mock", snv_format = "custom",
    arm_lvl = FALSE)

Estimation labels

可以使用以下方法从图中删除CNV估计标签:

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RNAseqCNV_wrapper(config = "config_mock.txt", metadata = "metadata_mock", snv_format = "custom",
    estimate_lab = FALSE)

Diploid adjustment

有些样本可能具有较高比例的CNVs染色体，如下图所示:

考虑到RNA-seq数据的相对性质，在这些样本中，稳定表达的基因在二倍体染色体上的归一化表达不会以零为中心。为了解决这个问题，软件包包括一个随机森林模型，它将染色体分类为二倍体或非二倍体。根据这些信息，图形的居中方式与估计为二倍体的染色体居中于零的方式相同:

此功能在默认情况下是打开的，而不需要矫正的话就adjust = FALSE:

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RNAseqCNV_wrapper(config = "config_mock.txt", metadata = "metadata_mock", snv_format = "custom",
    adjust = FALSE)

Analysis mode

样品可以分析两种模式:批量分析或每个样品分析。每个样本分析内置标准样本的基因表达规范化和定心是默认的。在批量分析中，输入样本将用于归一化和基因表达中心(log2倍变化计算)。在这种模式下，至少需要提供20个没有大量大规模CNVs的样本。为获得最佳结果，样品应具有相同的癌症类型和文库制备。要使用这种分析模式，请在RNAseqCNV_wrapper函数中使用batch = TRUE。

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RNAseqCNV_wrapper(config = "config_mock.txt", metadata = "metadata_mock", snv_format = "custom",
    batch = TRUE)

在每个样品分析中，每个样品将根据内置(或用户提供)标准样品进行分析。内建标准包含来自40个无大规模CNVs的ALL样本的基因表达数据。使用内置标准示例是默认方法。也可以提供标准样品作为输入。标准样本必须包含在metadata表中，并且它们的样本名称必须在RNAseqCNV_wrapper函数中以字符向量格式(standard_samples参数)提供。

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RNAseqCNV_wrapper(config = "config_mock.txt", metadata = "metadata_mock", snv_format = "custom",
    batch = FALSE, standard_samples = c("standard_sample_1,", "standard_sample_2,",
        "standard_sample_3,"))

Gene weights generation

除CNVs外，影响基因表达水平的因素还有很多。因此，RNAseqCNV基于精心策划的CNV数据集为每个基因分配一个权重值，以利用每个基因在预测CNV中的重要性。默认的内置基因权重基于426个B-ALL样本，源于基因在表达水平上的cnv相关性和方差。要从输入数据生成权重，参数generate_weights应设置为TRUE。然而，这些权重只考虑了样本间基因表达的差异。

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RNAseqCNV_wrapper(config = "config_mock.txt", metadata = "metadata_mock", snv_format = "custom",
    generate_weights = TRUE)

也可以根据以下格式提供自定义权重矩阵:

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ENSG	chromosome_name	weight
ENSG00000000419	20	121.923504
ENSG00000001167	6	8.474673
ENSG00000001497	X	442.760032

R函数get_weights():

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file.path(find.package("RNAseqCNV"), "R", "user_defined_analysis", "get_weights")

CNV matrix

可选地，估计的CNVs也可以以矩阵格式输出，其中样本按行排序，染色体臂按列排序。

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RNAseqCNV_wrapper(config = "config_mock.txt", metadata = "metadata_mock", snv_format = "custom",
    CNV_matrix = TRUE)

得到的文件格式如下：

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sample	1p	1q	2q	2p	3p	3q	4p	4q	5q	5p	6p	6q
sample_1	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
sample_2	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
sample_3	0	0	0	0	0	0	1	1	0	0	1	1
sample_4	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	1	1

另一方面，Shiny应用程序可以更轻松地浏览和检查结果。

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launchApp()

结果说明

软件包和Shiny应用程序的输出(图形和表格)都将保存在配置文件中指定的输出目录中。每个样本会有一个输出目录，里面都是图片，另外还有三张表格：

Main figure

主体图形由两个面板组成。上图显示了每条染色体的基因表达水平。Y轴表示基因表达相对于参比样品的log2倍变化;x轴显示1-22-X的23条染色体(Y染色体除外)。X轴也表示基因在每条染色体上的位置。对于每条染色体，根据归一化基因表达的分布绘制加权箱线图(1/4、1/2和3/4分位数)。对于每条染色体，使用随机福雷斯特算法估计CNVs，并在每条染色体上标记结果。低置信度(质量)的CNV用红色突出显示。下图显示了每条染色体的MAF密度图。请注意，仅使用杂合snv的MAF (MAF在0.05 ~ 0.9之间)来测定cnv。峰距，测量x轴上MAF密度图中两个最高峰之间的距离，也标记在顶部。

Arm-level figures

用户可以选择生成Arm-level的CNV数据：

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RNAseqCNV_wrapper(config = "config_mock.txt", metadata = "metadata_mock", snv_format = "custom", arm_lvl = TRUE)

Estimation table

估计的性别、臂位变化和染色体数目保存在输出目录的两个表中。estimation_table.tsv存储RNAseqCNV模型的输出。manual_an_table.tsv通过Shiny应用程序存储用户手动策划的结果。

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Sample	gender	chrom_n	alterations
SJHYPER141_D	male	59	1q+, 4+, 5+, 6+, 7+, ?8+, ?8+, 10+, 12+, 14+, 14+, ?16q, 17+, ?18+, ?18+, 21+, 21+, 22+, X+
SJALL015971_D1	female	28	1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 7-, 8-, 9-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-, 17-, 19-, 20-, 22-
SJALL049672_D1	male	34	2-, 3-, 4-, 5-, 7-, 9-, 13-, 15-, 16-, 17-, 20-, ?21, 22-
SJALL015927_D1	female	52	?6p+, 6q+, 10+, 14+, 17q+, 18+, 21+, 21+, X+

Reference

Bařinka J, Hu Z, Wang L, et al. RNAseqCNV: analysis of large-scale copy number variations from RNA-seq data. Leukemia. 2022;36(6):1492-1498. doi:10.1038/s41375-022-01547-8

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RNA 35. SCI 文章基于RNA-seq推断CNVs (RNAseqCNV)

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简 介

软件包安装

数据读取

config 文件

metadata 文件

Read count file

SNV information

Custom tabular data

实操

基因组选择

Arm-level figures

Estimation labels

Diploid adjustment

Analysis mode

Gene weights generation

CNV matrix

结果说明

Main figure

Arm-level figures

Estimation table

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简介