抗体药物的开发是一个非常复杂的过程，构建适用于工业生产的高表达的稳定细胞株是抗体药工艺开发的起点和基础。一株稳定高产的工程细胞株不仅能显著增加单位体积产量，降低生产成本，还可以降低下游纯化工艺复杂度，确保获得安全，高质量的蛋白产品。
一、稳定细胞株的构建原理
稳定细胞株的优势是可以使目的基因持续稳定表达或干扰特定基因表达的细胞株。可以弥补瞬转细胞目的基因保留时间短的缺点，便于长期观察蛋白间相互作用以及基因对细胞功能的影响。稳定细胞株构建的原理是将目的基因构建到含有抗性基因的载体上，常用的抗性基因有新霉素（Neomycin）、杀稻瘟菌素（Blasticidin）、嘌呤霉素（Puromycin）或G418，然后将载体转染宿主细胞，使得目的基因整合到宿主细胞染色体中，再利用抗性基因筛选混合阳性克隆。有些细胞株转染效率比较低，混合阳性克隆蛋白表达降低或不均一不明显，这种情况还需在阳性混合克隆的基础上得到单细胞长出的阳性单克隆，继而得到稳定转染细胞株。
二、稳定细胞株的构建方法
2.1慢病毒感染
慢病毒系统是经HIV-1病毒改造而来，可以高效的转染分裂期和非分裂期的细胞，从而将目的基因转入各种细胞系。慢病毒感染系统的原理是当慢病毒载体进入细胞后，在胞浆中可以利用反转录酶反转为DNA，当进入细胞核后随机整合到细胞基因组中，随后可以进行目的蛋白的表达，从而可以利用抗性基因进行稳定表达的目的基因细胞株1。
2.2稳转细胞株构建方法
（1）细胞检测（细胞状态是否良好、有无支原体污染等）。
（2）慢病毒包装及纯化：需要一个穿梭质粒（携带目的基因）、一个或两个包装质粒（编码病毒的核心蛋白、复制所需的酶和基因表达调节因子等）以及一个包膜质粒（编码蛋白质外壳）。配制转染体系，将质粒转染至293T细胞中，并采用超滤浓缩或超速离心沉淀病毒液。
（3）病毒转导与药筛：提前摸索细胞的最佳MOI值，并对铺板细胞进行病毒液感染，如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达。在转染3-4天后开始对细胞进行加药筛选。
注：为了达到最佳的实验效果，建议在正式实验前进行3-4种不同MOI值感染预实验；对于同种细胞不同种抗生素或是不同细胞对同种抗生素的使用，也建议提前摸索最佳使用浓度。
（4）稳转细胞株的检测：mRNA水平检测。检测合格后，对细胞系进行扩大培养与冻存保种。
以上步骤为构建多克隆稳转细胞系流程，若需构建单克隆稳转细胞株，则还需进行以下步骤：
① 对筛选后的多克隆稳转细胞株进行流式分选，即分选出单克隆细胞；
② 单细胞经过增殖后，继续进行第二轮筛选；
③ 筛选完成后，收集部分细胞进行mRNA水平检测，选择结果正确的单克隆细胞冻存保种2。
2.3 慢病毒介导的稳定细胞株构建优点
（1）转染宿主细胞高效，外源基因表达水平高且稳定；
（2）广泛的宿主，几乎可以感染所有类型的细胞（可感染分裂和不分裂的细胞），特别适合质粒载体转染效率低的细胞；
（3）可以适用于不同的细胞类型和不同的实验目的3；
三、卡梅德稳转细胞系构建服务的一般服务流程
3.1 载体构建&病毒包装
一般而言，将人源化的抗体基因转接到慢病毒载体上，然后对质粒表达进行检测，通过包装获得过表达目的基因的慢病毒质粒。慢病毒载体系统的包装成分与载体成分一起转染293细胞进行包装；细胞培养1-2天后，收集细胞上清液，浓缩后进行滴度测试。
3.2 细胞转染
首先确定抗生素类型、筛选浓度以及病毒转染浓度，利用病毒悬液进行转染，通过抗生素筛选稳转株，并进行ELISA和WB鉴定。
3.3 单克隆化
转染结束后即可得到细胞池，可以先利用抗性标记筛选稳定转染的阳性克隆，再通过有限稀释法挑取单克隆株的方法对细胞池进行筛选，以得到稳定转染的单克隆细胞系。
3.4 细胞系稳定筛选
为排除细胞系多次传代后会出现突变等遗传不稳定的情况，我们挑选10个最优克隆，对这10个克隆进行12-15代的传代，并通过qPCR、WB等方法对细胞稳定性进行检测，最终交付3株表达最好的细胞系以及详细的实验报告。
其他服务
针对不能连续传代的细胞，我司还可以提供细胞永生化服务，对细胞进行永生化后再进行转染和筛选。
卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)从事蛋白表达研究多年，具有丰富稳定细胞株开发经验，能够为客户提供高品质的稳定细胞系构建服务，制备的稳定细胞株适用于各种研究应用。
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参考文献：
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