原核表达载体的表达元件
①启动子:启动子在影响蛋白表达量上扮演重要角色,lac、 trp、tac、T7噬菌体启动子及IPL启动子是原核表达载体的主要启动子。 lac启动子被IPTG调控表达。lac杂合启动子被lac和trp组合而成,同样用IPTG来诱导,启动能力远超于lac和trp。色氨酸启动子trp被色氨酸诱导表达。T7噬菌体启动子具备有高度特异性,受控于T7 RNA聚合酶,T7 RNA聚合酶的活性远超过大肠杆菌聚合酶,因此可以高效表达目的基因。IPL启动子受温度的调控,活性大于trp。
②转录终止子为了保持载体系统稳定,防止被克隆的外源基因表达干扰。将转录终止子插入到多克隆位点的下游。
③核糖体结合位点mRNA转录完成后,为了能将目的蛋白完整翻译出来,需要借助宿主细胞的蛋白质合成系统。因此在插入的外源基因的mRNA上,必须存在宿主细胞核糖体的结合位点,从而起始密码子被启动翻译,蛋白质完成。
原核表达载体的表达方式
①组成型表达 组成型启动子包括T7噬菌体启动子等,当目的基因受该类启动子的控制时,外源目的基因选择表达。产量高,但对一些宿主细胞有害的蛋白不推荐用,这是是组成型表达的特点。
②诱导型表达 lac及杂合启动子tac为IPTG诱导型启动子。trp作为色氨酸诱导型启动子。IPL是温度调控启动子,无论受到何种因素调控,诱导型启动子的表达可避免宿主前期生长受到不利影响,同时可减少表达产物被蛋白酶所降解,适合于有毒蛋白的表达。
③融合型表达 表达载体的多克隆位点上存在多种融合表达标签,目的蛋白与标签共同表达为融合蛋白,有利于后续的蛋白分离纯化及检测。常见标签有GST标签SUMO标签及His标签。
④分泌型表达 在起始密码与目的基因之间加信号肽,使得目的蛋白穿过细胞膜,分泌于胞外。除此之外,分泌出的表达产物一般是可溶性的,不存在复性步骤。
选择合适的表达载体,对于成功的表达目的蛋白至关重要,我们应结合目的基因的特点,对于蛋白的下游应用等,综合评估哪种载体进行重组蛋白的表达和方案设计。