单细胞Seurat - 数据处理 (2)

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标准化

从数据集中删除不需要的细胞后，下一步是数据标准化。默认情况下，我们采用全局缩放标准化方法"LogNormalize"，该方法将每个单元格的特征表达测量值标准化为总表达，将其乘以比例因子（默认为 10,000），并对结果进行对数转换。在 Seurat v5 中，标准化值存储在 pbmc[["RNA"]]$data 中。

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pbmc <- NormalizeData(pbmc, normalization.method = "LogNormalize", scale.factor = 10000)

为了清楚起见，在前面的代码行中，我们为函数调用中的某些参数提供了默认值。

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pbmc <- NormalizeData(pbmc)

虽然这种标准化方法是标准方法并广泛用于 scRNA-seq 分析，但全局缩放依赖于每个细胞最初包含相同数量的 RNA 分子的假设。我们和其他人已经为单细胞预处理开发了替代工作流程，但不做出这些假设。对于感兴趣的用户，请查看 SCTransform() 标准化工作流程，论文中描述了该方法。

特征选择：识别高度可变的特征

接下来，我们计算数据集中表现出高细胞间差异的特征子集（即它们在某些细胞中高度表达，而在其他细胞中表达较低）。在下游分析中关注这些基因有助于突出单细胞数据集中的生物信号。

默认情况下Seurat每个数据集返回 2,000 个特征。这些将用于下游分析，例如 PCA。

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pbmc <- FindVariableFeatures(pbmc, selection.method = "vst", nfeatures = 2000)

# Identify the 10 most highly variable genes
top10 <- head(VariableFeatures(pbmc), 10)

# plot variable features with and without labels
plot1 <- VariableFeaturePlot(pbmc)
plot2 <- LabelPoints(plot = plot1, points = top10, repel = TRUE)
plot1 + plot2

缩放数据

接下来，我们应用线性变换（"缩放"），这是 PCA 等降维技术之前的标准预处理步骤。 ScaleData() 函数：

改变每个基因的表达值，使细胞间的平均表达为 0
缩放每个基因的表达，使细胞间的方差为 1
- 此步骤在下游分析中给予同等的权重，因此高表达的基因不会占主导地位
结果存储在 pbmc[["RNA"]]$scale.data 中
默认情况下，仅缩放可变特征。
您可以指定 features 参数来缩放附加功能

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all.genes <- rownames(pbmc)
pbmc <- ScaleData(pbmc, features = all.genes)

如何消除不需要的变异源

在 Seurat 中，使用 ScaleData() 函数从单细胞数据集中删除不需要的变异源。例如，我们可以"回归"与细胞周期阶段或线粒体污染相关的异质性，即：

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pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")

但是，特别是对于想要使用此功能的高级用户，我们强烈建议使用新的规范化工作流程 SCTransform()。与 ScaleData() 一样，函数 SCTransform() 也包含 vars.to.regress 参数。

线性降维

接下来我们对缩放后的数据执行 PCA。默认情况下，仅将先前确定的可变特征用作输入，但如果您希望选择不同的子集，则可以使用 features 参数进行定义（如果您确实想使用自定义的特征子集，请确保首先将它们传递给 ScaleData ）。

对于第一个主成分，Seurat 输出具有最大正负载荷的基因列表，代表在数据集中的单细胞之间表现出相关（或反相关）的基因模块。

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pbmc <- RunPCA(pbmc, features = VariableFeatures(object = pbmc))

Seurat 提供了几种有用的方法来可视化定义 PCA 的单元格和特征，包括 VizDimReduction()、DimPlot() 和 DimHeatmap()

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# Examine and visualize PCA results a few different ways
print(pbmc[["pca"]], dims = 1:5, nfeatures = 5)

## PC_ 1 
## Positive:  CST3, TYROBP, LST1, AIF1, FTL 
## Negative:  MALAT1, LTB, IL32, IL7R, CD2 
## PC_ 2 
## Positive:  CD79A, MS4A1, TCL1A, HLA-DQA1, HLA-DQB1 
## Negative:  NKG7, PRF1, CST7, GZMB, GZMA 
## PC_ 3 
## Positive:  HLA-DQA1, CD79A, CD79B, HLA-DQB1, HLA-DPB1 
## Negative:  PPBP, PF4, SDPR, SPARC, GNG11 
## PC_ 4 
## Positive:  HLA-DQA1, CD79B, CD79A, MS4A1, HLA-DQB1 
## Negative:  VIM, IL7R, S100A6, IL32, S100A8 
## PC_ 5 
## Positive:  GZMB, NKG7, S100A8, FGFBP2, GNLY 
## Negative:  LTB, IL7R, CKB, VIM, MS4A7

VizDimLoadings(pbmc, dims = 1:2, reduction = "pca")

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DimPlot(pbmc, reduction = "pca") + NoLegend()

特别是 DimHeatmap() 允许轻松探索数据集中异质性的主要来源，并且在尝试决定包含哪些 PC 进行进一步的下游分析时非常有用。细胞和特征均根据其 PCA 分数进行排序。将细胞设置为数字会在频谱两端绘制"极端"细胞，这会显着加快大型数据集的绘图速度。虽然是一种监督分析，但我们发现这是探索相关特征集的宝贵工具。

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DimHeatmap(pbmc, dims = 1, cells = 500, balanced = TRUE)

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DimHeatmap(pbmc, dims = 1:15, cells = 500, balanced = TRUE)

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