Discovery of Key Cytochrome P450 Monooxygenase (C20ox) Enables the Complete Synthesis of Tripterifordin and Neotripterifordin
摘要
C20位氧化的ent-喹烷型二萜因其独特的结构和多样的生物活性长期以来备受关注。在ent-喹烷骨架上惰性甲基（20位）进行直接羟基化的策略，将极大简化其合成过程；然而，由于其结构复杂，当前的化学合成方法仍面临挑战。此外，酶促合成策略亦受限于专一性C20氧化酶的稀缺。在本研究中，我们报道了一种关键的细胞色素P450单加氧酶（CYP），即C20ox，它可催化ent-喹烷骨架20位的选择性C--H氧化，并揭示了具有强抗HIV活性的两种C20位氧化ent-喹烷型二萜------雷公藤酮（1）和新雷公藤酮（2）的复杂生物合成网络。
我们构建了工程酿酒酵母，从葡萄糖出发合成化合物1和2。同时，我们还开发了一种简洁的化学-酶促联合合成策略，从甜菊醇（steviol）出发合成化合物1和2。我们的研究结果突显了利用植物CYPs进行C20氧化ent-喹烷型二萜可规模化合成的有效性。
引言
C20氧化在ent-kaurane二萜类化合物中广泛存在，例如tripterifordin（TF，1）、neotripterifordin（NTF，2）、oridonin、eriocalyxin B等，这些化合物具有广泛的生物活性（图1）。（1−3）例如，从雷公藤（Tripterygium wilfordii）中分离得到的TF和NTF在H9淋巴细胞中具有显著的抗HIV复制活性，半最大有效浓度（EC50）分别为3100和25 nM。（2,3）Oridonin是一种有前景的抗癌药物，能够靶向白血病（4,5），并且是一个共价的NLRP3抑制剂，具有强烈的抗炎症小体活性。（6）此外，eriocalyxin B已被证明能够诱导白血病细胞的凋亡。（7）由于其良好的生物活性，这些C20氧化化合物的全合成一直受到广泛关注，并且仍然是一个激动人心且充满活力的研究话题。（8−10）然而，使用现有化学技术在ent-kaurane碳环的C20位点进行选择性C--H氧化仍然是一个未解的难题，即使从类似的甜菜苷骨架出发，也使得这些化合物的全合成变得困难。（8）相反，基于阐明生物合成途径的合成生物学方法被认为是一种可持续的替代生产方法（11,12），能够满足临床试验和其他领域广泛应用的巨大需求。然而，关于涉及相关生物合成途径的氧化酶的知识仍然不足，这使得合成生物学方法难以获得这些特权的二萜类化合物：在这种情况下，1和2。
图1. 具有C20氧化态的选定ent-kaurane衍生的二萜类化合物。 (A) C--H氧化（此处指C20氧化）广泛存在于ent-kaurane衍生的二萜类化合物的形成中，产生了结构多样性和复杂性。 (B) C20氧化被提出用于完成TF（1）和NTF（2）的生物合成。KAO，kaurenoic酸氧化酶；GA20ox，赤霉酸C20-氧化酶；GA3ox，赤霉酸C3-氧化酶；GA13ox，赤霉酸C13-氧化酶；GA2ox，赤霉酸C2-氧化酶。
1和2源自与赤霉素（GAs）共享的共同ent-kaurene核心，据信通过二萜合成酶（TwCPS3和TwKSL2）介导的（E,E,E）-橙花菜烯二磷酸（GGPP）依次环化成二萜骨架16α-羟基ent-kaurane（ent-kauran-16-ol，3）进行生物合成。（13）Kaurene氧化酶（TwKO）催化二萜骨架C4a甲基（也称为C19）三次顺序氧化，形成醇、醛和羧酸酯产物。（14）C20氧化，作为最终的生物合成步骤，由一种未知的氧化酶启动，最终通过脱水形成C19,20-γ-内酯，生成1和2（图1B）。目前，大多数ent-kaurane骨架位置的选择性氧化酶已经被鉴定（图S1）；（15−28）然而，C20氧化酶仍然未被充分理解。相反，来源于植物、植物相关真菌和细菌的赤霉酸C20氧化酶（GA20oxs）已经在GA生物合成中被阐明，它们催化GA12（或GA53和GA14）在C20位置的顺序氧化和氧化反应，形成去甲基化化合物GA9（或GA20和GA4）（图S2），（23,29,30）表明GA20oxs可能负责ent-kaurane骨架的C20氧化。最近，Voigt小组发现了一种细菌细胞色素P450单加氧酶（CYP），其在ent-kaurane框架的C1、C15和C20位置表现出多重活性。（31）然而，选择性的C20氧化酶仍然是一个谜。
在此，我们通过体外生化实验和体内基因枪介导的RNA干扰，鉴定了来自雷公藤（T. wilfordii）的一种关键CYP（TwCYP71BE271，C20ox），它催化C20位置的选择性C--H氧化，从而完成了1和2的复杂生物合成网络。据我们所知，C20ox是首个具有ent-kaurane骨架的植物专一性C20氧化酶。随后，我们通过基因扩增获得了高蛋白生产，开发了高效的生物催化剂。我们为1和2的生产开发了两种平台：（1）使用酵母在摇瓶培养中进行的1和2的全新生物合成（分别为16和1 mg L--1）；（2）从甜菜苷起始的简洁化学酶合成路线，步骤少于8步，具有最小的保护基团操作，用于可扩展的1和2生产。总体而言，我们的结果将加速阐明具有C20氧化修饰的医学重要ent-kaurene二萜类化合物的完整途径，从而促进异源生产，并推动植物CYPs作为生物催化剂在化学酶合成中的应用，用于复杂特种代谢物的可扩展生产。
结果
C20氧化酶基因候选筛选参与TF和NTF生物合成
已有研究表明，2-氧戊二酸依赖的双加氧酶（2ODDs）和CYPs在催化C--H官能化中发挥着关键作用，通过在各种烃骨架中引入氧化官能团，因此它们是提议的1和2的生物合成途径中C20氧化反应的最有可能的候选酶。GA20oxs，作为一种2ODD，广泛存在于植物、细菌和真菌中。它们催化赤霉酸生物合成过程中典型的C20氧化反应（图S2）。在植物中，GA20oxs由多基因家族编码，并在体外发挥不同的生理作用或催化功能。（32−34）在此，我们选择了来自雷公藤（T. wilfordii）的六种GA20ox（TwGA20oxs，图S3及支持信息数据2）作为候选基因。
催化二萜碳环氧化的植物CYPs主要来自CYP71和CYP85类，其中大多数具有氧化ent-kaurane骨架的能力的CYPs属于CYP71类（图S4）。例如，TwKO（CYP701A）是该途径中鉴定出的首个CYP，属于CYP71类，（14）这表明CYP71类衍生的CYPs可能具有参与1和2生物合成的C20氧化活性。总共有65种CYP从雷公藤转录组（NCBI SRA接入号SRP199495）中分离出来，采用基于同源性的搜索方法，使用能够氧化二萜烯烃的CYP71类CYPs作为查询基因（支持信息数据3）。其中五种CYP此前已被证实参与萜类化合物的生物合成，催化雷公藤中celastrol、triptolide及其类似物的关键步骤。（37−41）此外，获得了来自六种不同组织（根皮、根韧皮部、根木质部、茎皮、去皮茎和叶片）的代谢物谱，以比较1和2的积累情况与转录本表达谱。发现1和2遍布整个雷公藤植物，但在茎皮和去皮茎中积累浓度最高，表明这两种组织是最活跃的生物合成部位（图S5）。随后，基于在茎皮和去皮茎中的高表达水平（每百万个映射读取的转录本每千碱基片段数≥1），进一步筛选了上述CYPs，最终选择了15个CYP候选基因进行进一步分析。
T. wilfordii CYP71BE271，而非GA20ox，负责ent-kaurane骨架的C20氧化
最初，六种TwGA20ox在大肠杆菌中异源表达，并在铁（II）硫酸盐、2-氧戊二酸和抗坏血酸的辅因子混合物存在下，以GA12、ent-kauran-16,19-二醇（4）和ent-kauran-16-醇-19-羧酸（6）作为底物进行孵育。三种GA20ox（TwGA20ox1、TwGA20ox2和TwGA20ox5）催化GA12的C20甲基氧化形成GA9；然而，测试的GA20oxs均未能转换底物4或6（图S6）。这表明TwGA20ox1、TwGA20ox2和TwGA20ox5作为功能性GA20oxs参与GA生物合成，但在ent-kaurane骨架上缺乏活性（C20氧化）。
为了识别CYP候选基因，我们首先通过重构其生物合成途径，建立了一个用于高效生产6的酵母底盘。简而言之，我们在背景菌株CEN.PK2--1D（a）中共表达了3的生物合成模块（表S3）。携带GGPP生物合成模块和截短的伞形花叶藓（Physcomitrella patens）ent-kaurene合成酶融合麦芽糖结合蛋白（t2PpCPS/KS-MBP）的菌株C20-05提供了最高的生产水平（图S7和S8）。接着，将包括来自雷公藤（TwKO）和拟南芥（AtKO）的KOs，以及来自相同物种的细胞色素P450还原酶（TwCPR3、TwCPR5和AtCPR2）(14,37,42)的模块引入优化过的酵母菌株C20-05中。所有菌株（C20-06--C20-11）显示出低产量的6（1-2 mg L--1），可能是因为GGPP流量不足。为了进一步提高酵母中6的产量，通过引入来自黄藓酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）的GGPP合成酶（XdGGPPS）和来自鸡（Gallus gallus）的突变FPP合成酶（GgFPSF112A）来增加GGPP流量，这些酶主要生产GGPP而非本地FPP产物（43,44）。正如预期的那样，AtKO与TwCPR3（AtKO + TwCPR3）的组合表现最佳，提供了C20-13菌株，能够生产6（24 mg L--1）并生成大量未消耗的3（图S8）。此外，来自不同物种的AtKO和细胞色素b5（CYB5）（如无刺黑莓、T. wilfordii、蒿属植物和长春花）（11,26,37,45）额外复制的拷贝被引入到C20-13菌株中，以帮助从TwCPR3到AtKO的第二电子传递。表达额外AtKO拷贝的C20-18菌株使6的滴度提高到57 mg L--1，而C20-20菌株则结合AtKO和CrCYB5，6的滴度达到了62 mg L--1，是C20-13菌株的2.6倍。6的生物合成需要足够的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），它作为CYP系统中电子传递通道的关键辅因子。为了增加NADPH的供应，我们通过过表达编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（ZWF1）和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（GND1）的关键基因，改进了戊糖磷酸途径（46）。结果，C20-23菌株的6的产量比C20-20菌株高出31%（81 mg L--1），使其成为高通量筛选候选基因的理想菌株（图2A和S7）。
Figure 2. 酵母底盘构建和CYP71BE271的功能表征。 (A) 用于生产 ent-kauran-16-ol-19-oic acid (6) 的酵母底盘的构建和工程化。 (B, C) 重组菌株表达CYP71BE271的酵母乙酸乙酯提取物的超高效液相色谱--高分辨率质谱（UPLC--HRMS）提取离子色谱图（EICs，正负模式）。 (D) CYP71BE271-RNAi 细胞系中CYP71BE271的相对表达水平以及1和2的含量。CYP71BE271的转录水平使用2--△△Ct方法测定。EFLα被指定为内参基因，载体对照组作为参考样本。数据以均值±标准差（n = 3个生物学独立重复）表示。使用双侧Student's t检验评估组间的统计学差异（**P < 0.01, *P < 0.05）。
所有CYPs均在酵母底盘（菌株C20-23）中单独表达并用于发酵。液相色谱--质谱（LC--MS）分析显示，其中一个候选酶（CYP71BE271）催化了1、2以及两个化合物（7和12）的形成（见图2B、C和S9）。随后，RNAi被应用于T. wilfordii悬浮细胞，以提供CYP71BE271在1和2生物合成中的作用的确凿证据。通过特定片段构建二元载体pK7GWIWG2D(II)并通过基因枪轰击法转染到悬浮细胞中（13）。通过特定引物扩增Egfp片段，表明转染成功（见图S10）。如预期，CYP71BE271的转录水平显著降低，并且在CYP71BE271-RNAi细胞系中观察到1和2的积累明显减少（见图2D）。总体而言，CYP71BE271（C20ox）被验证为在C20位点催化氧化，完成1和2的生物合成。
C20ox的体外表征
为了进一步阐明其功能，C20ox与TwCPR3共同表达于酵母中。制备了微粒体并用底物4和6进行孵育，随后进行LC--MS分析。仅表达TwCPR3的酵母微粒体作为对照。正如预期，C20ox与底物6反应，形成了C20羟基中间体，该中间体进一步脱水形成C19,20-γ-内酯环，生成1（见图3B、D）。C20ox还催化了底物4在C20位的连续氧化，形成相应的醇、醛和酸衍生物，最后生成2，其峰与10的峰重叠（见图3A、D和S11）。
Figure 3. C19和C20氧化过程的体外表征，由C20ox催化。 (A) C20ox催化反应的UPLC--HRMS EICs（正负模式），以4为底物。将pESC-Leu:TwCPR3载体转化到酵母中，微粒体作为对照。酶促反应在30°C下进行4小时，使用100 μM底物，总体积500 μL，含有500 μM NADPH，5 μM FAD，5 μM FMN，5 mM葡萄糖-6-磷酸，以及1单位/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。 (B) C20ox催化反应的EICs，以6为底物。 (C) 通过对接预测的底物4与C20ox/血红素的结合模式。显示底物4的C19和C20与Fe原子的距离。 (D) C20ox催化的酶促路径，分别将4转化为2，6转化为1。使用核磁共振（NMR）光谱鉴定的化合物5、8和10的结构。括号中的结构为不稳定的中间体。 (E) C20ox将4转化为5的动力学表征。 (F) C20ox将4转化为8的动力学表征。酶促反应使用10到300 μM的4底物，并在pH 7.5和30°C下与饱和浓度的辅因子共同进行，反应时间为2小时，总体积500 μL，含3 nmol C20ox。Km和kcat值以均值±标准差表示（n = 3个生物学独立重复）。
除了在C20氧化的作用外，C20ox还显示了在C19位置的氧化活性。当与4共同孵育时，C20ox表现出与TwKO相同的催化功能，在4的C19位置进行氧化，生成少量的5，这可以进一步氧化形成6（见图3A、D和S12）。此外，当与10和11共同孵育时，也观察到了C20ox对C19的氧化（见图S12--S14）。动力学分析表明，C20ox在将4转化为8的催化效率上高于将4转化为5（kcat/Km = 0.29 M--1 s--1 vs kcat/Km = 3.20 × 10--2 M--1 s--1），表明C20ox更倾向于催化C20的氧化（见图3E、F）。此外，基于对4与C20ox的分子对接，Fe原子最接近C20碳原子的距离为4.6 Å，比C19的距离更短（见图3C）。这些结果也表明C20ox更倾向于催化C20的氧化，这与其体外表现一致。
C20ox和TwKO交替作用以合成TF和NTF
有研究提出，C20氧化是1和2生物合成的最后一步。通过核磁共振（NMR）光谱鉴定，发现重组菌株表达的C20ox能够生成ent-kauran-16-ol-20-oate（7），这促使我们进一步探究C20氧化是否也可以发生在C19氧化之前。为了验证这一氧化过程，我们使用C20ox和TwKO作为生物催化剂，进行了体外生化实验。当与3共同孵育时，C20ox在C20位置展现出氧化活性，生成了其酸衍生物7，随后在TwKO的催化下，在C19位置进行了羟基化，最终通过脱水形成C19,20-γ-内酯，生成了2（见图4A、B、D）。这些结果确认了2也可以通过C20氧化在C19氧化之前生成。如前所述，TwKO催化了3在C19位置的三步氧化，形成了相应的醇（4）、醛（5）和酸（6）衍生物（见图4A）。C20ox将醇中间体4氧化形成8，随后被TwKO连续氧化生成1（见图4C、D）。
Figure 4. C20ox和TwKO催化TF和NTF生物合成过程中氧化反应的体外表征。
(A) C20ox催化3作为底物的反应EICs。 (B) C20ox催化7作为底物的反应EICs。 (C) C20ox催化8作为底物的反应EICs。 (D) 通过C20ox和TwKO催化的酶促反应，将3转化为1和2的拟议路径。酶促反应在30°C下进行4小时，使用100 μM底物，总体积500 μL，包含500 μM NADPH，5 μM FAD，5 μM FMN，5 mM葡萄糖-6-磷酸，以及1单位/mL葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。化合物4和7的结构通过NMR光谱鉴定，化合物9的结构通过Murashige和Skoog（MS）分析进行初步表征。括号内的结构是不稳定的中间体。
植物CYPs通常在萜类生物合成中具有较宽的底物适应性。(47,48) 体外酶促研究表明，由于C20ox和TwKO的多功能性，它们可以交替氧化ent-kaurane骨架以产生1和2，从而形成复杂的代谢网络（在图5A中，1和2的生物合成存在四条代谢路径，分别命名为Path 1、2、3和4）。
为了确定在酵母中获得更高产量的1和2的最优生物合成路径，将C20ox与TwKO或AtKO共同表达在3生产菌株C20-24中。结果表明，C20-25菌株（TwKO + C20ox组合）产生1和2的产量分别为11 mg L⁻¹和1 mg L⁻¹，而C20-26菌株（AtKO + C20ox组合）产生1和2的产量分别达到16 mg L⁻¹和1 mg L⁻¹，表明AtKO在酵母中的1生物合成能力优于TwKO。
随后，选择了四种关键中间体（4、6、7和8）分别添加至C20-25和C20-26菌株。向C20-25菌株补充8后，1的产量显著提高了约2.1倍，而C20-26菌株提高了约1.5倍，最终分别达到35 mg L⁻¹和40 mg L⁻¹。此外，C20-25菌株中2的产量也提高了44%。然而，在补充4和6后，1和2的产量没有显著变化（见图5B）。这些结果表明，C20ox的催化效率不足，无法将更多的底物6转化为1，并且无法有效竞争KO以捕获底物4生成8。因此，提高C20ox的催化效率可能会通过Path 1和Path 2提高1的产量（见图5A）。
补充7使得C20-25菌株中2的产量提高了约1.0倍，而C20-26菌株中2的产量增加了约6.0倍，最终分别达到2 mg L⁻¹和6 mg L⁻¹。这表明，在2的生物合成过程中，C20氧化发生在C19氧化之前。因此，Path 3可能是酵母中提高2产量的最佳生物合成路径。
图 5. 在酵母中生产 1 和 2 的最有效生物合成途径。 (A) 以 Kau-16-ol (3) 为起始物的 TF 和 NTF 生物合成网络。Path 1 和 Path 2 是 1 的生物合成路径，Path 3 和 Path 4 是 2 的生物合成路径。 (B) 向 C20-25 和 C20-26 菌株体内补充 4 (100 μM)、6 (100 μM)、7 (100 μM) 和 8 (100 μM) 作为中间体。数据以均值 ± 标准差（SD）表示（n = 3，生物学独立重复）。使用双侧 Student's t 检验评估组间统计学显著性（***P < 0.001，**P < 0.01，*P < 0.05）。
从商用甜菊醇（Steviol）进行 TF 和 NTF 的化学酶促合成
1997 年，Corey 和 Liu 通过高效的阳离子-烯烃多重环化策略首次报道了 2 的对映选择性全合成，并重新确定了其绝对构型。(49) 2018 年，Kobayashi 及其团队利用远程 C--H 官能团化策略，依赖于光诱导 Suarez 高碘酸盐反应中 C19 醇的作用，在 kaurene 框架上开发了一条简洁的 1 和 2 的半合成途径。(8) 然而，为了在 C20 位置引入羧酸，需要将 1 的内酯还原为相应的二醇，然后使用 Dess--Martin 高碘酸试剂氧化，最终以约 1:1 的比例同时生成 neotripterifordin 型骨架和不需要的 tripterifordin 型内酯。 在本研究中，我们开发了一条基于 C20ox 的化学酶促合成路线，以高选择性地从甜菊醇合成化合物 1 和 2。
CYPs 作为具有高特异性的天然酶工具，是化学酶促合成方法的理想生物催化剂。然而，其低蛋白表达量限制了催化效率。因此，我们尝试通过提高 C20ox 的表达水平来增强催化活性。
我们将 C20ox 与酵母增强型绿色荧光蛋白基因（C20ox-yEGFP）融合，并在多个强启动子 [PTDH3、PTDH3-RPS25Ai（增强型 PTDH3 启动子）(50,51) 和 PGAL1] 控制下使用着丝粒质粒 pRS415 进行过表达。结果表明，在以 2% 葡萄糖为碳源的条件下，PTDH3-RPS25Ai 启动子驱动的荧光显著增强，比 PTDH3 和 PGAL1 分别提高了 148% 和 33%。此外，PTDH3-RPS25Ai 还导致 1 和 2 产量的提高，表明 PTDH3-RPS25Ai 是 C20ox 生产的最佳启动子（图 6A）。
随后，我们在高拷贝 2μm 质粒 pESC-Leu 的控制下过表达 C20ox，但相比 pRS415 质粒，并未获得更高的蛋白表达水平。因此，我们根据 HapAmp 策略 (图 S15) (52) 在 RPL25 半倍体基因座整合了 C20ox，并同时用较弱的 PBTS1 启动子替换了其内源启动子。由于体内基因多拷贝扩增，yEGFP 荧光强度增加了约 6.3 倍（图 6B）。
图6. 从甜菊醇合成TF和NTF的化学酶法合成。(A) 在强启动子的控制下，C20ox的过表达用于生产TF (1) 和NTF (2)；p415代表着中心体质粒pRS415。(B) C20ox蛋白生产的优化。PBTS1-RPL25代表使用缺失基因RPL25作为驱动基因（原生启动子被替换为较弱的PBTS1启动子），通过PTDH3-RPS25Ai驱动的C20ox的体内基因扩增。pESC代表高拷贝2 μm质粒pESC-Leu。yEGFP荧光以参考菌株的指数相位自体荧光百分比表示。数据以均值±标准差（n = 3个生物学独立重复）呈现。(C) 从甜菊醇合成TF和NTF的化学酶法合成。反应条件在支持信息中提供。AIBN，2,2′-azobis(2-methylpropionitrile)；Bu3SnH，三丁基锡烷；LiAlH4，氢化铝锂。
甜菊醇在咪唑、三苯基膦和碘的存在下发生甲基化和C13-醇的碘取代。碘化化合物18经过自由基脱卤和氢化还原，生成了化合物19，产率极高，随后水合作用提供了大规模的化合物4。高表达C20ox的全细胞被重悬于磷酸盐缓冲液中，作为生物催化剂催化化合物4的C20羟基化，得到三种主要产物：二醇8、过氧化的半缩醛10和二醛11。有趣的是，当用氢氧化钾处理时，主要产物11发生了一种新颖的跨环Cannizzaro反应，可能通过分子内氢转移机制，经过酸性处理得到1作为唯一产物。通过一步选择性地构建1的六元内酯，尽管C19的醛基比C20更易电亲性。正如预期，使用氵硼氢还原11，得到10作为唯一产物，随后通过Dess-Martin氧化反应得到目标产物2，产率很高（图6C）。总体而言，我们开发了一种简洁的化学酶法合成1和2的工艺，包括三种有趣的转化反应：在惰性甲基基团（C20）上的关键生物催化C--H激活、分子内Cannizzaro反应以及醛还原，在不同的内酯框架之间切换。
讨论
二萜类化合物是一个结构多样的天然产物家族，已知大约有18,000种例子。它们的结构多样性和复杂性为制药工业提供了丰富的治疗线索，同时也持续激发着药物设计的灵感。大多数是具有C20氧化修饰的ent-kaurane型二萜类化合物，即tripterifordin (1)、neotripterifordin (2)、oridonin和eriocalyxin B（图1）(1−3)。C20氧化酶的阐明持续揭示了ent-kaurane二萜类化合物的生物合成网络。据我们所知，ent-kaurane骨架的氧化通常由CYPs催化，大多数CYPs属于CYP71家族（图S4）。(27,35,36) 然而，鉴定植物生物合成CYPs是具有挑战性的，因为CYPs是最大的酶家族，且仍有一些CYP家族完全未被表征。鉴于1和2在T. wilfordii植物的树皮和剥皮的茎中富集（图S5），我们创建了一组属于CYP71家族的候选基因，这些基因在树皮和剥皮的茎中高度表达。通过开发的高通量筛选平台（6产酵母载体），成功从这些候选基因中鉴定出了TwCYP71BE271，作为首个从植物中鉴定的C20氧化酶（C20ox），能够催化ent-kaurane骨架的C20位点选择性C--H氧化。随后，阐明了化合物1和2的完整生物合成途径。
在先前的研究中，通过应用模块化酵母平台，功能性表征了CYP71BE亚家族中的三种CYPs，催化了abietane型二萜类化合物的生物合成步骤。(37,53) 然而，这里鉴定的C20ox是来自同一亚家族的首个靶向ent-kaurane骨架C20位置的酶。这将有助于利用同源性搜索方法挖掘神秘的途径基因，并阐明具有重要医药价值的ent-kaurane二萜类化合物（即oridonin和eriocalyxin B）的完整途径。有趣的是，C20ox还表现出了C19氧化反应，这表明在二萜生物碱（如napelline和lepenine）合成过程中，C19和C20位置的双氧化状态参与的二醛中间体的形成很可能由专门的C20氧化酶催化（图S16）。(54) 总体而言，这些结果丰富了我们对CYPs在二萜类化合物生物合成网络中复杂作用的理解。
最近，Voigt团队建立了一个表达细菌CYPs的E. coli系统，实现了对二萜类化合物的高通量探索和化学多样性开发。(31) 然而，是否能够支持植物源CYPs的功能仍不清楚。我们开发的酵母载体可以支持高通量表征植物CYPs，它们参与了ent-kaurane骨架的氧化，以及异源生产有价值的ent-kaurane二萜类化合物。到目前为止，植物和细菌中已鉴定出几乎所有由CYPs催化的ent-kaurane骨架上各位置的氧化反应（图S1）。这为我们提供了一个有趣的机会，使用我们的酵母载体及这些已鉴定CYPs的合理组合，创造出具有结构多样性和复杂性的各种ent-kaurane二萜类化合物。在这里，我们采用合成生物学策略，成功地在酵母中使用两种植物CYPs，AtKO和C20ox，生产了1和2，分别得到了16和1 mg L--1的产量。酵母细胞工厂具有在克级规模上生产二萜类化合物的巨大潜力，正如近期生产rubusoside（55）和sclareol（56）所展示的那样。因此，未来通过应用已经有的广泛策略，将1和2的产量提高到克级规模是可行的。
CYPs作为具有高特异性的全新酶工具，是理想的生物催化剂，为化学酶法合成方法提供了低成本、环保的合成途径，用于生产那些过去仅凭当代化学手段难以或无法合成的天然产物。(57) 然而，CYPs，尤其是植物来源的CYPs，活性较低，而植物CYPs作为膜蛋白在常用酵母宿主中的基因表达水平不足，限制了它们的高效应用。我们通过提高蛋白生产克服了这一瓶颈。HapAmp方法利用缺失基因RPL25作为进化力，实现了C20ox的高产。经过全细胞反应转化的底物获得了高转换率（约80%）（图6C）。Kobayashi及其同事在2018年报道了1和2的半合成，特点是依赖于C19醇在光诱导Suarez hypoiodite反应中的C--H功能化策略；(8) 然而，该策略的选择性较差。在这里，我们开发了一条简洁且可扩展的化学酶法路线，能够从甜菊醇中选择性地合成1和2，并借助C20ox。该高效方法将有助于我们进一步追求更复杂的oridonin和eriocalyxin B以及其他具有类似骨架的C20氧化二萜类化合物的目标。
结论
我们的研究揭示了关键酶C20ox，能够选择性地对ent-kaurane骨架进行C20氧化，并阐明了1和2的生物合成完整路径。我们开发了两种生产1和2的平台：(1) 在酵母中从头生物合成1和2，分别在振荡瓶培养中获得了16和1 mg L--1的生产量；(2) 利用C20ox作为高效的生物催化剂，在化学酶法合成策略中生成了简洁的合成路线（从甜菊醇出发不到8步），并且操作中使用了最少的保护基团处理，使得1和2的可扩展生产成为可能。我们的研究结果将为其他植物、真菌和细菌中具有C20氧化修饰的二萜类化合物的生物合成提供启示，并且，异源生产高价值天然产物也将为植物CYP介导的复杂ent-kaurane二萜类化合物的化学酶法合成提供战略蓝图，这些化合物过去很难通过合成方法获得或无法获得。
材料与方法
植物材料、菌株、质粒和化学品
本研究中使用的T. wilfordii品种来自福建省三明市永安市大田桃源国有林场。T. wilfordii悬浮细胞在Murashige和Skoog (MS) 培养基中培养，培养基含有0.5 mg L--1的2,4-D，0.1 mg L--1的KT，0.5 mg L--1的IBA和30 g L--1的蔗糖（pH = 5.8）。细胞在25°C的黑暗环境下培养，120 rpm的旋转速度。所使用的菌株、质粒和引物列在表S3和S4及支持信息数据1中。PCP引物由RuiBiotech合成。PrimeSTAR HS (Premix)和PrimeSTAR max DNA聚合酶由TaKaRa Bio提供。Phusion高保真聚合酶链反应（PCR）Master Mix、限制性内切酶和T4 DNA连接酶由New England Biolabs提供。pEASY-Blunt简单克隆载体和pEASY-Uni无缝克隆与组装试剂盒由TransGen Biotech提供。Frozen-EZ酵母转化II试剂盒由Zymo Research提供。DNA凝胶提取和质粒制备试剂盒由Omega Bio-Tek提供。DNA测序由RuiBiotech进行。所有的同义密码子优化的异源基因由LOGENBIO合成，详细信息见支持信息（数据4）。其他常规化学品、生物化学品和培养基成分来自标准商业来源。
菌株培养
除非另有说明，E. coli细胞在37°C和200 rpm下，于含有10 g L--1色氨酸（OXOID）、5 g L--1酵母提取物（OXOID）和10 g L--1氯化钠（NaCl）的Luria--Bertani (LB)培养基中培养。适当时使用氨苄青霉素（100 mg L--1）。酵母菌株通常在30°C和200 rpm下培养在含有10 g L--1酵母提取物（OXOID）、20 g L--1胨（OXOID）和20 g L--1葡萄糖的酵母提取物胨葡萄糖（YPD）培养基中。用于筛选携带KanMX盒的转化子，使用G418（200 mg L--1）。含有pESC-Leu::CYP质粒的菌株在SD--LEU平板上筛选，该平板含有8 g L--1不含 leucine 的合成缺失培养基（FunGenome），20 g L--1葡萄糖和18 g L--1琼脂。含有基于URA3的gRNA质粒的菌株在SD--URA平板上筛选，该平板含有8 g L--1不含尿嘧啶的合成缺失培养基、20 g L--1葡萄糖和18 g L--1琼脂。URA3标记在SC + 5FOA平板上回收，含有8 g L--1合成完全培养基、20 g L--1葡萄糖、18 g L--1琼脂和1 g L--1的5-氟尿嘧啶酸（5-FOA）。
候选基因筛选与克隆
选择了T. wilfordii基因、6种GA20oxs和15种CYP71家族来源的CYPs作为候选基因进行研究。所有候选基因都使用Phusion高保真DNA聚合酶和根、茎或叶材料的cDNA根据厂家说明进行扩增。PCR产物被纯化并连接到pEASY-Blunt简单克隆载体中，然后进行完整的测序。测试的候选基因完整列表见表S4。
基因操作构建质粒和菌株
本研究中使用的Saccharomyces cerevisiae菌株CEN.PK2--1D(a)（MATα; ura3-52, trp1-289, leu2-3,112, his3Δ1, MAL2-8C, SUC2, XI-5::PTEF1-CAS9-TCYC1）是从CEN.PK2--1D（MATα; ura3-52, trp1-289, leu2-3,112, his3Δ1, MAL2-8C, SUC2）衍生的背景菌株，所有基因操作和菌株构建均基于此菌株（表S3）。采用金门DNA组装法、无缝克隆与组装法、重叠扩展PCR方法和基于CRISPR/Cas9的技术进行基因操作（质粒构建、染色体整合和基因敲除）。所有基因过表达盒，包括启动子、目标基因、终止子以及两端的同源臂用于同源重组，都被整合到指定的染色体位点，以提供异源基因的稳定和高水平表达（表S4）。纯化的过表达盒和gRNA质粒通过CRISPR/Cas9方法共同转化到CEN.PK2--1D(a)中进行盒子的敲入，具体操作请参见Frozen-EZ酵母转化II试剂盒用户手册。更多细节见支持信息方法。
发酵、代谢物提取和分析
菌株在玻璃试管中培养，摇床速度为200 rpm，用于菌株维护。对于发酵菌株C20-01--C20-23，细胞在塑料96孔深孔板中预培养，培养基为0.5 mL YPD培养基，覆盖AeraSeal膜（OMEGA, cat. AC1201-02），并在30°C和500 rpm的Multitron摇床（www.zhichengyp.com, 型号ZWY-200D）中摇动培养。24小时孵育后，将种子培养物转移到含有2.5 mL YPD培养基的24孔深孔塑料板中，初始光密度为600 nm（OD600）为0.2，继续在30°C下摇动培养72小时。根据之前的报道（14）并做了适当修改，提取和定量ent-kaurene、3、ent-kauren-19-oic酸和6。简而言之，将0.5 mL细胞培养液与1 mL乙酸乙酯充分振荡混合，然后在12,000g下离心5分钟以分离两相。上清液转移至样品瓶中，直接进行ent-kaurene和3的测量。对于ent-kauren-19-oic酸和6的定量，上清液先被干燥并用（trimethylsilyl）diazomethane甲基化。甲基化后的样品再干燥，并溶解在100 μL乙酸乙酯中进行气相色谱--质谱（GC--MS）分析。
GC--MS使用Thermo TRACE 1310/TSQ 8000气相色谱仪进行，配备了TG-5 MS（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）毛细管柱。样品（1 μL）以分流模式（25:1）注入，温度为280°C，氦气流速为1 mL min--1。GC炉温程序如下：50°C保持2分钟，然后以40°C min--1的速率升温至250°C，再以10°C min--1升温至300°C，最后在300°C下保持10分钟。离子阱加热温度为280°C。电子能量为70 eV，扫描范围为50--500 m/z。
功能性鉴定CYPs基于6生产菌株
为了更高效地还原CYPs，TwCPR3被插入到pESC-Leu载体的BamHI位点，按照pEASY-Uni无缝克隆和组装试剂盒的协议生成了pESC-Leu::TwCPR3质粒。CYPs被亚克隆到pESC-Leu::TwCPR3质粒的NotI位点，并由PGAL10启动子控制。所得的CYP表达质粒分别转化到能够生产高水平6的酵母菌株（C20-23菌株）。每个基因型选取三个菌落，用于发酵和产品鉴定。细胞在含有0.5 mL SD-Leu培养基的塑料96孔深孔板中预培养，覆盖AeraSeal膜（OMEGA，型号AC1201-02），并在30°C、500 rpm的Multitron摇床中摇动培养。培养24小时后，将种子培养物转移到含有2.5 mL新鲜培养基的24孔深孔塑料板中，初始OD600为0.2，在30°C下以500 rpm的速度摇动培养72小时。CYP催化的产物按照以下程序提取和分析。取0.5 mL细胞培养液与1 mL乙酸乙酯彻底振荡混合，随后在12,000g下离心5分钟以分离两相。将上清液干燥后，用100 μL甲醇溶解，进行超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱（UPLC/QTOF MS）分析。
LC-MS使用Waters ACQUITY UPLC I-Class系统（Waters公司，美国马萨诸塞州米尔福德）和Waters ACQUITY UPLC HSS T3分析柱（2.1 × 100 mm，1.8 μm）进行。TOF MS实验使用Xevo G2-S QTOF MS系统（Waters公司，美国马萨诸塞州米尔福德）进行。流动相由水中0.1%（v/v）醋酸（A）和乙腈（B）混合组成，流速为0.4 mL min--1。梯度洗脱程序如下：0分钟10% B，6分钟45% B，18分钟60% B，20分钟95% B。注射体积为2 μL。Xevo G2-S QTOF MS系统使用电喷雾电离源，操作在正负离子模式下。源温度和去溶剂温度分别为100°C和450°C，去溶剂气体流速为900 L h--1。毛细管电压为0.5 kV，锥电压为40 V。高能扫描的碰撞能量设定为20--40 eV。数据采集范围为50--1500 Da。纯化化合物的HRMS分析使用Orbitrap Exploris 120 LC-MS仪器（Thermo Scientific，匹兹堡，PA，美国）进行。
TwCYP71BE271活性的体外测定
将质粒pESC-Leu::(TwCPR3+TwCYP71BE271)转化到菌株CEN.PK2--1D中。作为对照，质粒pESC-Leu::TwCPR3也同样转化到酵母中。转化子在不含亮氨酸且含有2%葡萄糖的固体合成完全培养基（SC-Leu）上培养进行筛选。筛选得到的阳性转化子在30°C下于100 mL SC-Leu液体培养基中培养，直到OD600达到0.8--1.0，振荡速率为220 rpm。细胞经离心后，悬浮于100 mL YPL培养基中，在30°C下振荡培养16小时以诱导重组蛋白的表达。细胞通过离心收获，用10 mL TEK缓冲液[50 mM Tris-HCl pH 7.5，1 mM乙二胺四乙酸（EDTA），0.1 M氯化钾]洗涤两次后，在25°C放置5分钟。然后再次在4°C下以4000g离心5分钟，悬浮于30 mL TESB缓冲液（Tris-HCl pH 7.5，1 mM EDTA，0.6 M山梨醇）中，冰上放置10分钟。细胞悬液在4°C下使用纳米匀浆机（ATS ENGINEERING LIMITED）以12,000 psi匀浆7分钟，然后在4°C下以12,000g离心15分钟收集上清液。向上清液中加入等体积的含有0.3 M NaCl和0.2 g mL--1聚乙烯醇（PEG）-4000的TESB缓冲液，在冰上放置15分钟。通过离心收集12,000g、15分钟、4°C的微粒体部分，并悬浮于TEG缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH = 7.5，1 mM EDTA，20%甘油）中，保持在−80°C，直到使用。在C20ox的动力学表征中，使用细胞色素P450浓度定量检测试剂盒（上海育研，HL18003v.A）通过CO结合法测定样本中的CYP450浓度。酵母微粒体体外实验在含有500 μM NADPH、5 μM FAD、5 μM FMN、5 mM葡萄糖-6-磷酸、1单位 mL--1葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和100 μM底物的混合液中进行。此外，反应体积用分离的微粒体部分补充至500 μL。这些实验在30°C下100 rpm的摇床中进行4小时。提取三次后，用500 μL乙酸乙酯进行，合并的有机相被蒸发至干，然后用100 μL甲醇溶解，进行UPLC/Q-TOF MS分析。TwKO活性的体外实验根据上述方法进行测试。
体内喂养
对于菌株C20-25和C20-26，细胞在含有2.0 mL YPD培养基的塑料24孔深孔板中培养，覆盖AeraSeal膜并在30°C、500 rpm的Multitron摇床中摇动培养。培养24小时后，将种子培养物转移到含有2.5 mL YPD培养基的24孔深孔塑料板中，初始OD600为0.2，在30°C下以500 rpm的速度摇动培养24小时。然后，将四个关键中间体[4（100 μM）、6（100 μM）、7（100 μM）、8（100 μM）]溶解在甲醇中，喂入C20-25和C20-26菌株，再培养48小时。随后，取0.5 mL细胞培养液与1 mL乙酸乙酯彻底振荡混合，随后在12,000g下离心5分钟以分离两相。将上清液干燥后，溶解在100 μL甲醇中进行UPLC三重四极杆（QQQ）-MS/MS分析。更多细节请参见支持信息方法。