背景
双特异性抗体（bsAb）是一种有前途的药物形式，能够同时结合相同或不同抗原上的两个不同表位。迄今为止，已有14个双特异性抗体药物获得上市批准，尽管取得了这些成功并且迄今为止设计了多种形式，但具有高纯度和稳定性的双特异性抗体仍具有挑战性。
2024年3月25日，瑞典研究学者Nyesiga B等人在mAbs上发表了一篇名为"RUBY® - a tetravalent (2+2) bispecific antibody format with excellent functionality and IgG-like stability, pharmacology and developability properties."的文章，该研究开发了一种名为RUBY的独特双特异性抗体格式，在稳定性、可制造性、半衰期和功能性方面包含全长IgG的特征，同时具有2 + 2的几何形状，即能够同时以二价结合两个靶点，为开发肿瘤定位双特异性抗体和新的治疗概念以及临床研究提供了新思路。
RUBY的结构设计
RUBY的分子设计采用了独特的结构，由一个IgG连接到两个Fab域，通过多肽连接子（3×G4S）连接在IgG的C端末端。RUBY bsAb 因此由6条多肽链组成，它们是三种不同多肽链的双拷贝：1) 由 IgG 的重链和附加Fab的轻链组成的长链；2）与IgG部分的VH1和CH1结构域结合的轻链；3）附加到IgG的Fab的轻链结合短重链。由于Fab是通过它们的轻链附加的，经典的轻链错配对问题不会发生在RUBY中，正确配对的产物将包含所有正确的链。这是一个有价值的特征，因为轻链错配对会导致药物效价的严重变化，RUBY bsAb格式的第二个关键特征是使用VH-CH1和VL-CL对之间的界面突变，从而最大限度地减少聚集体和可溶性抗原结合片段的形成，以及引入突变以降低免疫原性的风险，来降低MHC II结合肽的形成风险。
RUBY bsAb的稳定性验证
对选定的RUBY bsAbs进行了可发育性评估，包括测定温度、剪切应力、胶体、冻融、血清和pH稳定性的研究。
BsAbs在64°C~74°C之间表现出良好的热稳定性，同时具有出良好的剪切应力、胶体稳定性（它需要PEG浓度高于9%才能诱导50%的蛋白质损失）。通过双重ELISA验证其血清稳定性，发现其在生理条件下具有良好的稳定性，论是在高温下还是在冷冻/解冻后都没有发生降解，在高蛋白质浓度下也有高稳定性，并且对低 pH不敏感。这些结果进一步证实RUBY作为稳定bsAb通用格式的潜力。
RUBY bsAb的抗原结合特性和功能
通过双ELISA验证，RUBY bsAb能够同时结合各自的靶标，且在IgG或附加的Fab中的抗原结合域的位置对其抗原结合能力影响较小。
CD40-EpCAM RUBY bsAb显示出条件性CD40激活：bsAb仅在CHO细胞上表达的EpCAM存在的情况下诱导表达CD40的细胞激活，而在缺乏EpCAM表达的CHO细胞的类似设置中未观察到激活。CD137-5T4 RUBY bsAb诱导有效的T细胞活化，通过在5T4存在的情况下干扰素（IFN）-γ释放的剂量依赖性增加来测量，在没有5T4的情况下，bsAb构建体驱动的T细胞活性不存在剂量依赖性增加，T细胞激活是通过bsAb触发的5T4依赖性聚类诱导的CD137交联介导的。这些数据表明RUBY格式在生成有条件功能的bsAb方面的优势，旨在将免疫细胞与肿瘤细胞联系起来并限制对靶组织的活性，从而最大限度地降低全身毒性的风险。
RUBY bsAb的FcγR结合特性
RUBY bsAb具有与人Fcγ受体相似的相互作用，IgG1构建物显示出与mFcγRI，FcγRIIa，hFcγRIIIa 176 V的结合相当，具有与单克隆抗体相当的特征，从而允许开发依赖于这种相互作用的生物学功能。
RUBY bsAb 在小鼠和食蟹猴的验证
RUBY bsAbs在小鼠和食蟹猴中显示出与FcRn结合和单克隆抗体类似的药代动力学特征。此外，通过评估RUBY bsAb携带LALA沉默的IgG1 Fc在小鼠中的药代动力学特征，RUBY bsAb的血清浓度与相应的单特异性抗体相似，它们之间的半衰期差异很小。在食蟹猴实验中，RUBY bsAbs也展现出类似单克隆抗体的药代动力学特性，其在不同物种中的稳定性和药代动力学表现与单特异性抗体相比，添加C端Fab以及向RUBY bsAb的可变域和恒定域引入突变对此类bsAb的PK特性没有影响或影响很小。
RUBY bsAbs在体内定位于肿瘤
RUBY bsAbs在肿瘤细胞中显示出高效的定位能力，能够有效地到达并富集在表达相关抗原的肿瘤中，而使用单特异性抗体靶向CD40治疗则使得较少的肿瘤细胞呈现IgG阳性。单特异性抗体或双特异性抗体定位到肿瘤的能力取决于几个因素，如大小、亲和力和靶抗原的表达模式。通过动态光散射（DLS）评估RUBY bsAbs的流体动力学直径与单特异性抗体之间几乎没有差异。RUBY格式非常适合开发用于定位于肿瘤或潜在其他相关组织的双特异性抗体。
小结
本研究中，研究人员开发了一种名为RUBY的独特双特异性抗体格式，具有出色的生物物理和生物学特性。RUBY采用了特定的突变来限制聚集物和副产物可溶性Fab的形成，并减少免疫原性风险。这种格式在体内表现出高效的肿瘤定位能力，且具有类似IgG的性质和自然双价靶标相互作用。此外，RUBY通过提高稳定性、降低免疫原性风险等方式，展现出很好的临床开发潜力。