在现代生物制药和分子生物学研究中，稳定细胞系是实现可重复、高产蛋白表达的基础。它不仅用于抗体和疫苗的研发，还广泛应用于酶学研究、信号通路分析和基因功能验证。
一、稳定细胞系的基本原理
稳定细胞系的核心是基因的基因组整合：
基因组整合
目标基因通过各种方法插入宿主细胞的染色体中，而不是停留在细胞质内（如瞬时转染）。
这种整合可以是随机的，也可以是位点特异性的（如 CRISPR/Cas9 或 Flp-In 系统）。
克隆选择
一个宿主细胞在整合目标基因后会衍生出整个细胞群体（克隆）。
通过筛选和单克隆分离，可以获得稳定、高表达的克隆，保证蛋白产量和一致性。
长期表达与遗传稳定性
成功整合的基因在多代传代中仍能持续表达。
避免了瞬时转染中蛋白表达随时间衰减的问题。
二、稳定细胞系构建的流程
稳定细胞系的开发一般包括以下几个核心环节：
1. 设计与载体构建
目标基因优化：提高翻译效率，添加信号肽和标签。
表达载体选择：包含启动子、增强子、筛选标记（如嘌呤霉素或潮霉素）和复制元件。
宿主细胞匹配：根据蛋白特性选择 CHO、HEK293 或其他专用细胞系。
2. 基因递送与整合
转染/转导方法：
化学转染：适用于多数易转染细胞
电穿孔：适合难转染或悬浮细胞
病毒载体（慢病毒、腺病毒等）：高效率，适合非分裂细胞
整合方式：
随机整合：快速，但表达水平受染色体位置影响
位点特异性整合：在"安全位点"插入，表达更可预测
3. 初步筛选与扩增
抗性筛选：使用药物选择只保留成功整合目标基因的细胞。
初步表达评估：通过荧光、酶活性或免疫检测确认蛋白表达。
4. 单克隆分离
目的：确保每个克隆来源于单一细胞，避免混合遗传背景。
方法：
极限稀释法
流式细胞分选（FACS）
克隆成像系统（如 CloneSelect）
5. 克隆表征与稳定性验证
表达量测定：ELISA、Western blot 或荧光定量
长期传代测试：在无选择压力下持续多代传代，观察表达水平变化
功能验证：确保蛋白结构正确、功能活性保持
6. 细胞库建设
主细胞库（MCB）：长期保存，作为原始克隆来源
工作细胞库（WCB）：用于实验或生产放大
质量检测：STR 鉴定、无菌、支原体及病毒检测
稳定细胞系构建是一个"设计 → 整合 → 筛选 → 验证 → 库存"的循环工程。每一步都涉及分子生物学、细胞培养和工程技术的交叉应用。通过标准化的流程和严谨的技术控制，稳定细胞系能够为研究和产业化提供可靠、可重复、长期稳定的蛋白生产平台。