表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）技术作为分子间相互作用检测的金标准 ，是唯一被中、美、日三国药典同时收录的分子互作检测技术，凭借实时检测、无需标记、高灵敏高分辨率等核心优势，能精准解析分子互作的特异性、亲和力与动力学特征，成为药物靶点验证、药物发现过程中的关键技术手段，可高效确认靶蛋白功能与药物药理作用，加速药物研发进程。
一、SPR 技术核心原理：基于光学共振的分子互作动态监测
SPR 技术依托经典光学现象实现分子互作的定量检测，核心通过折射率变化关联生物分子结合行为，实现无标记的动态监测：
- 入射光以临界角入射至两种不同折射率的介质界面时，引发金属表面自由电子共振，电子吸收光能量使反射光强度大幅减弱；
- 当表面等离子波与消逝波共振时，反射光能量显著降低，此时对应的入射光入射角为SPR 角，共振波长为共振波长；
- SPR 角会随金属表面的折射率变化而改变，而折射率变化与结合在金属表面的生物分子质量成正比；
- 通过捕获生物反应过程中 SPR 角的动态变化，可转化为生物分子间相互作用的特异性信号，实现分子互作的实时、定量分析。
二、SPR 标准实验步骤：四步完成，从样品处理到参数解析
SPR 实验流程标准化、自动化程度高，全程可实现高通量检测，核心分为固定配体、分析物进样、芯片再生、数据分析四个关键步骤，最终获得分子互作的核心动力学与亲和力参数：
- 固定配体：将待测分子（如蛋白质、抗体、核酸等）通过特定方法固定在金属薄膜修饰的传感芯片表面（如 CM5 芯片），形成稳定的配体固相表面，为分子结合提供基础；
- 分析物进样 ：将含待检测分子的样品梯度浓度注入流动池，使其与芯片表面的固定配体接触；通过 SPR 专用仪器（如 Biacore 系列）实时监测分子结合、解离过程中的反射光强度变化，生成传感图；
- 芯片再生：使用专用再生缓冲液清洗芯片表面，彻底洗脱未自发解离、仍结合于配体的分析物，使芯片表面恢复至初始状态；该步骤可重复进行，实现同一张芯片对多个化合物、多个浓度的连续检测；
- 数据分析 ：通过专业软件分析传感图中反射光强度随时间的变化趋势，拟合计算得到分子互作的核心参数 ------结合常数（Ka）、解离常数（Kd）、亲和力常数（KD），其中 KD=Kd/Ka，是衡量分子结合强弱的关键指标。
三、SPR 技术核心特点：七大优势，成为分子互作检测首选
SPR 技术之所以能成为分子互作检测的 "金标准"，核心源于其相较于传统检测方法的七大独特优势，全方位满足药物研发中分子互作检测的严苛需求：
- 实时动态检测 ：全程追踪分子间结合 - 解离的完整过程，捕捉互作的动态变化细节，而非仅检测终点结果；
- 无需样品标记：避免荧光标签、生物素、同位素等标记物对分子结构和活性的干扰，最大程度保持分子天然状态，保证检测结果的真实性；
- 样品需求量低：芯片表面仅需约 50μg 蛋白即可完成检测，大幅降低珍贵样品（如重组靶蛋白、候选药物小分子）的消耗；
- 高效高通量 ：检测过程以分钟为单位，仪器全自动运行，可同时实现多样品、多浓度的平行检测，提升实验效率；
- 高灵敏高分辨率 ：可精准检测出弱相互作用的分子结合行为，对微量的分子结合引发的折射率变化实现精准捕捉，检测结果可靠性高；
- 应用范围广泛：无物种、分子类型限制，可检测蛋白、小分子、核酸、抗原、抗体、受体、配体等各类分子间的相互作用；
- 信息维度全面 ：不仅能判断分子间是否存在相互作用 ，还可定量分析互作的特异性、亲和力、动力学特征，还能实现样品浓度的定量检测，一站式获取分子互作核心信息。
四、SPR 技术广泛应用范围：覆盖全类型分子互作检测
SPR 技术可实现任意两种可溶或固相化分子间的相互作用检测，适用于药物研发、分子生物学、免疫学等多个研究领域，核心应用场景包括：
- 蛋白与小分子间的相互作用（如药物小分子与靶蛋白的结合验证，药物研发核心环节）；
- 蛋白与蛋白间的相互作用（如受体 - 配体、酶 - 底物、抗体 - 抗原、蛋白复合物组装）；
- 核酸与蛋白间的相互作用（如转录因子与 DNA、RNA 结合蛋白与 RNA、核酸适配体与靶蛋白）；
- 核酸与核酸间的相互作用（如 DNA 双链杂交、miRNA 与靶 mRNA 结合）；
- 经典抗原 - 抗体分子相互作用（如抗体亲和力筛选、抗原表位鉴定）；
- 受体 - 配体间分子相互作用（如细胞表面受体与可溶性配体、激素与受体的结合分析）。
五、SPR 技术提供的核心分子互作信息：三维度解析，精准量化互作特征
SPR 技术通过对传感图的拟合分析，可从特异性、亲和力、动力学三个核心维度，实现分子间相互作用的全面、定量解析，为药物靶点验证和药物筛选提供关键数据支撑：
- 特异性分析 ：明确目标分子与靶分子之间是否存在特异性结合，排除非特异性结合的干扰，确认分子互作的靶向性（如候选药物是否仅与靶蛋白结合，而非其他杂蛋白）；
- 亲和力测定 ：通过计算亲和力常数（KD），定量判断两种分子之间的结合强弱，KD 值越小，分子结合越紧密，亲和力越高；
- 动力学分析 ：通过结合常数（Ka）、解离常数（Kd），分析两种分子结合和解离的速率快慢------Ka 越大表示结合速率越快，Kd 越小表示解离速率越慢，二者共同决定分子结合的稳定性。
六、药物靶点 SPR 验证经典应用案例：直接佐证分子结合，赋能药物研发
SPR 技术是药物靶点验证的核心技术手段，可直接定量检测候选药物分子与靶蛋白的结合亲和力，为靶点确证、先导化合物筛选提供直接的实验证据，以下为两个典型应用案例：
案例 1：小分子 GBA 与靶蛋白 CNPY3 的结合验证
通过 Biacore T200 系统检测 GBA 与 CNPY3 的相互作用，结果显示二者的亲和力常数KD=278nM ，表明 GBA 与 CNPY3 之间存在强相互作用 ，直接确证 CNPY3 为 GBA 的潜在作用靶点。实验关键细节：CM5 芯片经 N - 羟基磺基琥珀酰亚胺活化后，将 40μg/mL 的重组人 TPI 蛋白用 pH4.5 乙酸稀释后偶联于芯片，乙醇胺封闭未结合位点；梯度浓度 GBA 以 30μL/min 流速注入含 0.05% Tween 20、5% DMSO 的 PBS 运行缓冲液，Biacore T200 软件分析数据。
案例 2：化合物与靶蛋白 DCTPP1 的结合特异性与亲和力筛选
通过 Biacore S200 系统在 25℃下检测，结果显示化合物 2 与 DCTPP1 的亲和力常数KD=3.8μM ，存在显著结合；而化合物 13、15 作为对照，与 DCTPP1 未显示出显著结合，明确了化合物 2 对 DCTPP1 的结合特异性与亲和力。实验关键细节：采用胺偶联法将重组人 DCTPP1 蛋白固定于活化的 CM5 芯片；梯度浓度化合物 2 以 30μL/min 流速注入含 5% DMSO 的 PBS・P 运行缓冲液；数据拟合至 1:1 朗缪尔结合模型，Biacore S200 软件推导动力学参数。
七、分子互作亲和力（KD）判定标准：按结合类型划分，精准解读 KD 值意义
不同类型分子间的天然结合亲和力存在显著差异，需结合分子结合类型判断 KD 值对应的结合强弱，以下为各类分子互作的经典 KD 值范围参考，为实验结果解读提供依据：
- 亲和素 - 生物素结合：10⁻¹⁴ M（极强结合，不可逆结合）；
- 强的抗原 - 抗体结合、DNA 与蛋白的结合：10⁻⁸ ~ 10⁻¹⁰ M（高强度结合，稳定性高）；
- 较弱的抗原 - 抗体结合：10⁻⁶ ~ 10⁻⁷ M（中强度结合，存在一定解离）；
- 酶与底物结合：10⁻⁴ ~ 10⁻¹⁰ M（结合跨度大，与酶促反应效率相关）；
- 蛋白与小分子结合（药物研发核心类型）：10⁻³ ~ 10⁻⁶ M（常规有效结合范围，是药物小分子与靶蛋白的典型亲和力区间）。