在单细胞转录组测序研究的浪潮中，基础分析，质控、降维、聚类、注释已成标准流程，为我们描绘出细胞群体组成的静态地图。然而，真正的生物学奥秘往往隐藏在细胞的动态变化、协同调控与相互作用之中。如何从海量的单细胞数据中，深入挖掘驱动表型差异的核心机制？百趣生物为您梳理了单细胞转录组中常用的高级分析模块，助您超越细胞类型鉴定，直达分析目的。运用一系列进阶分析策略，层层递进，从锁定关键细胞、解析其内部协作网络，到最终揭示驱动一切的调控源头，从而构建一个从现象到本质的完整认知闭环。以下三大分析模块，正是实现这一跨越的强大分析方法。
寻找关键细胞，发现表型变化的核心响应者
当面对复杂的细胞群体，如何快速锚定受实验处理影响最显著的关键细胞类型，我们可以从以下角度去筛选关键细胞。差异基因统计分析（图1），从基因表达层面量化影响，差异基因数量越多的细胞类型，通常意味着其对实验条件的变化越敏感。RO/E分析（图2），从细胞丰度变化中寻找线索，通过比较实际细胞数量与统计学"随机"期望值的偏离程度，直观揭示哪些细胞类型的比例发生了特异性改变。Augur分析（图3），基于机器学习的精准鉴定，训练分类器区分不同组别的细胞，以AUC值量化各类细胞的响应特异性。AUC值越高，表明该细胞类型的整体转录状态在组间差异越大，是真正的核心响应者。以上分析适用于处理组vs对照组的比较研究、疾病进程不同阶段的样本分析，快速聚焦后续深入分析的目标细胞亚群。
图1. 差异基因统计
图2. 期望偏离热图
图3. AUC Score
共表达网络分析hdWGCNA，解码基因的团队协作
传统差异方法得到的差异基因数量众多，当面对成百上千的差异基因列表不知如何选择，这些基因之间有何内在联系也不清楚。 hdWGCNA分析专为单细胞数据设计，能够识别共表达基因模块（图4），将成千上万个基因归类为多个内部表达高度协同的几个功能模块。模块活动雷达图（图5）可以清晰展示不同实验条件下，哪些模块被整体激活或抑制，指向核心功能通路。一个模块内的基因往往在功能或调控上存在关联，可能受到共同的上游转录因子调控，或参与相同的生物学过程，该分析也可以预测驱动整个模块协同表达的潜在转录因子（图6）。最终进行功能富集分析，对功能聚焦的模块进行富集分析（图7），结果更精确的指向具体的生物学过程。该分析可作为深入探究某一关键细胞类型内部，响应外界刺激或自身状态变化的核心功能程序与调控枢纽。
图4. 共表达基因模块聚类图
图5. 模块雷达图
图6. 转录因子相关性柱状图
图7. 功能富集气泡图
发现细胞指挥官，揭示转录因子神秘世界
SCENIC通过对单细胞转录组数据进行顺式调控网络分析，识别活跃的转录因子及其调控的靶基因集合，从而推断每个细胞的调控状态，并辅助解释细胞类型或状态的生物学特性。首先转录因子活性特异性评分可以告诉我们哪些转录因子及其靶基因具有显著的特异性活性（图8），例如在巨噬细胞中Mafb的regulon特异性评分(RSS)很高，说明该转录因子的调控活性在该细胞类型中具有高度特异性，其靶基因集整体被显著激活。转录因子表达量热图（图9），可比较不同实验处理下同一细胞类型的转录因子活性变化，直观看出处理对细胞调控状态的影响。另外筛选出的转录因子可以作为关键候选，用于指导下游的湿实验，可设计体外或体内实验来验证TF的功能。
图8. RSS评分
图9. 转录因子表达量
参考文献：
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Skinnider MA, Squair JW, Kathe C, Anderson MA, Gautier M, Matson KJE, Milano M, Hutson TH, Barraud Q, Phillips AA, Foster LJ, La Manno G, Levine AJ, Courtine G. Cell type prioritization in single-cell data. Nat Biotechnol. 2021 Jan;39(1):30-34.
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Morabito S, Reese F, Rahimzadeh N, Miyoshi E, Swarup V. hdWGCNA identifies co-expression networks in high-dimensional transcriptomics data. Cell Rep Methods. 2023 Jun 12;3(6):100498.
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Van de Sande B, Flerin C, Davie K, De Waegeneer M, Hulselmans G, Aibar S, Seurinck R, Saelens W, Cannoodt R, Rouchon Q, Verbeiren T, De Maeyer D, Reumers J, Saeys Y, Aerts S. A scalable SCENIC workflow for single-cell gene regulatory network analysis. Nat Protoc. 2020 Jul;15(7):2247-2276.