一、游离载体：不整合基因组
原理：
游离载体（Episomal Vector）是一类游离于宿主细胞染色体之外、可自主复制并稳定存在的环状遗传物质，无需整合到宿主基因组即可实现目的基因的持续表达。
其功能依赖于特定元件，如来源于人β干扰素基因的S/MAR元件，可赋予载体在哺乳动物细胞中自我复制和伴随细胞分裂传递给子代细胞的特性，且无需依赖外源病毒蛋白辅助，安全性更高。
部分游离载体还可通过Cre/loxP位点特异重组酶系统实现可控删除，在不需要载体继续存在时，可通过添加Cre酶将其从细胞中彻底清除，进一步提升应用安全性。
用处：
游离载体的优势的是避免了基因整合带来的插入突变风险，因此广泛应用于对安全性要求较高的场景。
例如，在诱导性多能干细胞（iPS细胞）的制备中，可将诱导因子通过游离载体导入体细胞，诱导细胞重编程为iPS细胞，后续可通过可控删除系统去除载体，降低细胞癌变风险，为细胞治疗提供安全的种子细胞；
同时也可用于瞬时或长期的基因表达研究、细胞转分化研究，以及基因治疗中短期治疗因子的递送。
二、质粒
原理：
质粒是细菌体内天然存在的、独立于染色体之外的小型环状双链DNA分子，可自主复制，携带少量基因（如抗生素抗性基因）。
实验室使用的质粒均经过人工改造，保留了复制原点（确保在宿主细胞中复制）、多克隆位点（便于插入目的基因）、筛选标记（如抗生素抗性基因，用于筛选成功导入质粒的细胞）等元件。
其工作原理是通过转化（如CaCl₂处理或电穿孔）将重组质粒导入宿主细胞（常用大肠杆菌），利用宿主细胞的复制系统大量扩增质粒，进而实现目的基因的扩增或表达。
用处：
质粒是分子生物学研究中最基础、最常用的工具，应用场景极为广泛。
一是目的基因的克隆与扩增，作为基因克隆的载体，将目的基因插入质粒后，通过细菌培养快速获得大量纯化的目的基因片段；
二是目的基因的瞬时表达，将携带目的基因的质粒导入真核细胞（如HEK293细胞），实现基因的短期、高效表达，用于蛋白制备、基因功能初步验证；
三是作为构建病毒载体的基础骨架，慢病毒、腺病毒等病毒载体的构建，通常需先将目的基因插入质粒，再通过包装过程获得病毒颗粒；此外，质粒还可用于基因文库构建、基因突变体筛选等基础研究。
在实验室实际运用中常不特别分区游离载体与质粒
三、慢病毒：稳定整合、长效表达
原理：
慢病毒属于逆转录病毒科，其基因组为两条相同的正链RNA，可感染分裂细胞和非分裂细胞（如神经细胞、肝细胞）。
其原理是：重组慢病毒载体（经人工改造，去除致病基因，保留复制和整合相关元件）进入宿主细胞后，在逆转录酶的作用下将RNA逆转录为双链DNA，随后在整合酶的作用下，将双链DNA整合到宿主细胞的基因组中，实现目的基因的稳定、长期表达。现
代慢病毒载体多采用"伪分型"策略，用水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）替换原有包膜蛋白，大幅拓宽宿主细胞范围，同时通过多质粒包装系统（如第三代四质粒系统），降低产生具有复制能力慢病毒的风险，提升生物安全性。
用处：
慢病毒的核心优势是可实现目的基因的稳定整合与长效表达，广泛应用于需要长期基因调控的场景。在基础研究中，用于构建稳定表达或沉默特定基因的细胞系、动物模型（如小鼠、大鼠），研究基因的长期功能；
在临床应用中，是基因治疗的核心载体之一，可用于治疗遗传性疾病（如血友病、地中海贫血）、恶性肿瘤（如CAR-T细胞治疗，通过慢病毒将CAR基因导入T细胞，增强其杀伤肿瘤细胞的能力）、神经系统疾病（如帕金森病）；此外，还可用于干细胞的基因修饰，为细胞治疗提供改造后的功能细胞。
四、腺病毒：高效瞬时表达
原理：
腺病毒是一类无包膜的双链DNA病毒，呈二十面体结构，直径70~100nm，其基因组不整合到宿主细胞基因组中，仅在细胞核内进行瞬时复制和表达。
实验室使用的重组腺病毒的原理是：删除腺病毒的致病基因（如E1、E3区），插入目的基因，保留病毒的衣壳蛋白（如六邻体、五邻体），使其能够识别宿主细胞表面的特异性受体，通过内吞作用进入细胞，随后释放病毒DNA到细胞核，利用宿主细胞的转录翻译系统实现目的基因的高效瞬时表达，最终裂解宿主细胞释放病毒颗粒，完成生命周期。
用处：
腺病毒的核心优势是转染效率高、可携带较大片段（最大约8kb）、宿主范围广，且无需整合到基因组，适用于短期、高效的基因递送。
在基础研究中，用于目的基因的瞬时高表达、基因功能验证、蛋白大规模制备；
在临床应用中，可作为基因治疗载体，用于治疗癌症（如将抑癌基因、自杀基因递送到肿瘤细胞）、感染性疾病（如递送抗病毒基因）；同时，腺病毒也是疫苗研发的重要载体，如新冠疫苗、腺病毒载体流感疫苗，通过递送抗原基因，诱导机体产生免疫应答，实现预防感染的目的。
但其缺点是免疫原性较强，反复使用易引发机体免疫反应，影响递送效果。
五、腺相关病毒：低免疫原性
原理：
腺相关病毒（AAV）是一类无包膜的单链DNA病毒，属于细小病毒科，其自身无致病性，需依赖腺病毒或疱疹病毒的辅助才能完成复制。
其原理是：重组AAV载体（经人工改造，去除病毒的编码基因，保留复制和包装相关的末端反向重复序列TR），与辅助质粒共转染包装细胞（如HEK293细胞），获得重组AAV颗粒；AAV颗粒感染宿主细胞后，其基因组可在细胞核内形成环状双链DNA（ episome），实现目的基因的长期、稳定表达，且几乎不整合到宿主基因组中，仅在极少数情况下发生随机整合，安全性极高。
AAV有多种血清型，不同血清型对不同组织细胞的亲和性不同，可实现组织特异性递送。
用处：
AAV的核心优势是免疫原性极低、安全性高、可长期表达，且可感染分裂细胞和非分裂细胞，是目前基因治疗中最具潜力的载体之一。
在临床应用中，已被用于治疗多种遗传性疾病，如血友病B、先天性黑朦、脊髓性肌萎缩症（SMA）等，截至目前，已有多款AAV载体基因治疗产品获得FDA批准，且有超过225项临床 trials正在开展；
在基础研究中，用于构建长期稳定表达目的基因的动物模型（如小鼠、猴子），研究基因的长期功能，尤其适用于神经系统、肝脏、肌肉等组织的基因递送；
此外，还可用于疫苗研发，递送抗原基因，诱导机体产生持久的免疫应答。其缺点是携带片段较小（最大约4.7kb），限制了较大目的基因的递送。
六、CRISPR：基因编辑剪刀
原理：
CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列）-Cas9系统是细菌体内的天然免疫系统，用于抵御噬菌体的入侵，经人工改造后成为目前最常用的基因编辑工具。
其原理是由单向导RNA（sgRNA）和Cas9核酸酶组成：sgRNA可特异性识别宿主基因组中的目标序列（需结合 protospacer adjacent motif，PAM序列），引导Cas9核酸酶结合到目标位点，切割DNA形成双链断裂（DSB）；
随后，细胞通过非同源末端连接（NHEJ）或同源定向修复（HDR）机制修复断裂的DNA，其中NHEJ机制易导致碱基插入或缺失，实现基因敲除；
HDR机制可在模板DNA的引导下，实现目的基因的精准插入或基因突变的纠正。
目前已开发出多种改良Cas酶（如SaCas9、Base Editor），进一步提升编辑效率、特异性，降低脱靶风险。
用处：
CRISPR的优势是编辑精准、高效、操作简便，可实现对几乎任意基因的编辑，彻底改变了基因编辑领域的发展。
在基础研究中，用于基因功能研究（如基因敲除、敲入、点突变）、疾病模型构建（如癌症、遗传性疾病的细胞模型和动物模型）；
在临床应用中，用于基因治疗，治疗遗传性疾病（如镰状细胞贫血、地中海贫血）、癌症（如编辑肿瘤细胞的致癌基因，抑制肿瘤生长），目前已有多项CRISPR基因治疗临床试验正在开展，但仍面临脱靶效应、递送效率等挑战。
七、小干扰RNA（siRNA）：沉默基因
原理：
小干扰RNA（siRNA）是一类长度约21~22nt的双链RNA分子，其原理是利用真核细胞的RNA干扰（RNAi）机制，实现目的基因的转录后沉默。
siRNA进入宿主细胞后，被Dicer酶切割加工，形成单链siRNA，随后整合到RNA诱导沉默复合物（RISC）中；RISC可通过碱基互补配对识别并结合目的基因的mRNA，切割mRNA，使其无法进行翻译，从而抑制目的基因的表达，实现基因沉默，且沉默效率可达到90%以上，具有高度的序列特异性。
用处：
siRNA的优势是沉默效率高、特异性强、操作简便，适用于短期、可逆的基因沉默，广泛应用于基因功能研究和疾病治疗。
在基础研究中，用于快速沉默特定基因，研究其在细胞增殖、分化、凋亡等过程中的功能，无需构建稳定细胞系，耗时短、效率高；在临床应用中，用于治疗由异常高表达基因引起的疾病，如癌症（沉默致癌基因）、病毒性疾病（沉默病毒基因，抑制病毒复制）、自身免疫性疾病（沉默炎症相关基因）；
此外，还可用于药物靶点筛选，通过沉默候选靶点基因，验证其是否为疾病治疗的有效靶点。其缺点是沉默效果具有时效性，无法实现长期沉默，且易被核酸酶降解，需通过化学修饰（如甲基化、磷酸化）提升稳定性。