需要注意的细节
（一）实验前准备："铺胶"
-
冰上操作：
Matrigel 在 4℃是液态，室温或 37℃会凝固，拿出来后千万别离开冰盒！
-
浓度稀释：
用预冷的无血清培养基稀释（比如 25-100μg/mL，具体浓度根据细胞类型预实验确定，结直肠癌细胞常用 50-75μg/mL）。
-
均匀铺胶：
轻轻滴 50-100μL 稀释后的 Matrigel 到滤膜上表面，别产生气泡！然后立刻放进 37℃培养箱，至少孵 1-3 小时让它凝成胶状，这层胶就是模拟体内的 "障碍" 。
Matrigel 是一种从 Engelbreth-Holm-Swarm（EHS）小鼠肉瘤中提取的可溶性基底膜基质，主要成分包括层粘连蛋白、胶原蛋白 IV、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（如 perlecan）和巢蛋白等，还含有多种生长因子（如 EGF、FGF、TGF-β 等）。它在室温下会快速凝固成凝胶状，模拟体内细胞外基质（ECM）的三维结构和生物学特性，广泛用于细胞培养（如干细胞分化、类器官构建）、肿瘤侵袭实验（Transwell 侵袭实验中作为 "人工基底膜"）、血管生成研究等领域，为细胞提供一个接近体内环境的生长支架。
Matrigel基质
（二）上层溶液-细胞悬液：
-
消化：
用 0.25% 胰酶消化细胞，等细胞变圆、间隙变大时，加含血清的培养基终止消化，把细胞悬液移到离心管。
-
洗涤：
1000rpm 离心 3 分钟，弃上清，用 PBS 轻轻重悬洗一遍（洗掉残留的血清和胰酶，避免影响趋化因子的 "吸引力"），再离心弃上清。
-
无血清：
用无血清培养基重悬细胞，计数后调整密度到 1×10⁵ cells/mL 左右（具体密度根据细胞类型调整，预实验确定最佳值）。
为啥用无血清？这样细胞才会更 "渴望" 下腔室的趋化因子，迁移 / 侵袭动力更强。
（三）上层与下层组装：
-
下腔室放 "诱饵"：
在 24 孔板的下层孔里加 500μL 趋化培养基 ------
-
想测细胞普遍迁移能力：用含 10% FBS 的完全培养基（经典 "强诱饵"，血清里的生长因子能吸引大多数细胞）；
-
想测特定因子的作用：比如研究乳腺癌向骨髓转移，就加含 SDF-1α（50-100ng/mL）的无血清培养基，这样能精准看细胞对这个因子的反应。
-
-
放小室：
用无菌镊子轻轻把小室放进孔里，确保小室底部接触下层液体，膜下面没有气泡（有气泡会挡住细胞去路！）。
-
接种细胞：
往上腔室加 200μL 细胞悬液（大概 2×10⁴个细胞），动作要轻，别戳破 Matrigel（侵袭实验尤其注意）。
-
培养时间：
放进 37℃、5% CO₂培养箱，孵育 12-48 小时（时间根据细胞类型调整，比如 A549 肺癌细胞迁移 12 小时较合适，侵袭实验因为要穿 Matrigel，时间通常比迁移长 6-12 小时）。
细胞迁移过程，自上而下
（四）终止实验 & 染色：
-
擦去未迁移的细胞：
这是最关键的一步！用湿润的无菌棉签轻轻擦上腔室的膜表面，把没穿过去的细胞擦掉，只留下穿过膜到下层的细胞（下手一定要轻，别把膜擦破，也别把穿过去的细胞蹭掉）。
-
固定细胞：
在新的 24 孔板孔里加 600μL 4% 多聚甲醛，把小室膜面朝下放进去，确保膜完全浸在固定液里，室温固定 30 分钟。
-
染色计数：
把小室转移到含 0.1% 结晶紫染液的孔里，膜面浸入染液，室温避光染 20 分钟，然后用 PBS 洗 2-3 次，洗掉多余染液，把小室底面轻轻吸干。
结晶紫染色
（五）结果分析：
把染色后的小室放在倒置显微镜下，膜朝下的一面就是 "闯关成功" 的细胞（紫色）。
-
随机选 5 个不重叠的视野（比如中央、上下左右各一个），在 100 或 200 倍镜下数每个视野的细胞数。
-
算平均值后比较各组差异，比如实验组平均 40 个 / 视野，对照组 10 个，说明实验组迁移能力是对照组的 4 倍，再用 T 检验等统计方法看差异是否显著（p<0.05 才算有效）。
结果统计
优化案例
（一）Matrigel 包被精细调控
对于侵袭实验，Matrigel 包被是关键。不同细胞对 Matrigel 浓度需求各异。以结直肠癌细胞为例，可准备多个 Transwell 小室，分别用 25µg/mL、50µg/mL、75µg/mL、100µg/mL 的 Matrigel 溶液进行包被，后续按标准流程实验，最后统计各组穿膜细胞数。经预实验发现，结直肠癌细胞在 50 - 75µg/mL 浓度区间，侵袭能力评估结果稳定且符合生物学预期，过高或过低浓度会使结果偏差。此后正式实验即可选定该浓度范围。包被操作时，除避免气泡外，还应确保 Matrigel 溶液覆盖滤膜边缘，防止细胞从边缘非正常穿膜。
（二）培养时间精准确定
细胞类型与状态影响培养时间。以肺癌细胞 A549 研究迁移为例，取对数生长期细胞，按常规操作接种于 Transwell 小室（无 Matrigel 包被）。分别在 6 小时、12 小时、18 小时、24 小时终止实验，固定染色后计数。结果显示，6 小时时仅少量细胞开始迁移，12 小时迁移细胞数明显增多，18 - 24 小时细胞迁移趋于稳定。经统计分析，12 小时是该细胞迁移实验较优培养时间起点。后续针对 A549 细胞的迁移实验，可依此调整培养时间，兼顾实验效率与准确性。若研究细胞侵袭，因需突破 Matrigel 层，培养时间通常比迁移实验长 6 - 12 小时，但仍需依具体细胞和实验条件优化。
（三）多元回归分析应用
当研究多种因素对细胞迁移与侵袭的综合影响时，多元回归分析是有力工具。假设我们研究药物 X 浓度、药物 Y 浓度以及细胞密度对某肿瘤细胞侵袭能力的影响。收集多组实验数据，每组设定不同药物 X 浓度（X₁）、药物 Y 浓度（X₂）、细胞密度（X₃），记录对应的穿膜细胞数（Y）。将数据代入多元线性回归模型：
Y = β₀ + β₁X₁ + β₂X₂ + β₃X₃ + ε
利用统计软件计算回归系数 β₀、β₁、β₂、β₃ 及其 P 值。若 β₁ P 值小于 0.05，表明药物 X 浓度对侵袭能力有显著影响；同理判断其他因素。通过该模型，可量化各因素的相对重要性，如 β 值绝对值越大，因素影响越显著，从而为实验优化和机制研究提供依据。
（四）常见问题解决方案
-
细胞脱落：若细胞在 Transwell 实验中易脱落，首先检查细胞状态，确保使用对数生长期细胞，排除因细胞老化或受损导致的粘附性差。其次，优化培养基成分，在无血清上腔室培养基中添加适量细胞外基质蛋白（如纤连蛋白、层粘连蛋白），浓度为 1 - 5µg/mL，增强细胞粘附。还可以在接种细胞前，用 0.1% - 0.5% 的明胶溶液预包被 Transwell 小室上腔室，室温放置 30 分钟后吸弃明胶，晾干后接种细胞，提升细胞附着稳定性。培养过程中，避免频繁晃动培养板，保持培养环境稳定。
-
膜破损应对 ：操作 Transwell 小室时，使用无菌镊子轻柔放置和取出，避免与硬质器械碰撞。若发现膜破损，立即停止使用该小室。对于轻微破损，可尝试用蘸有培养基的无菌棉签轻柔擦拭破损处，去除可能影响实验的脱落碎片，但后续结果需谨慎分析，因其准确性可能受影响。建议每批次实验设置备用小室，以应对突发破损情况。
-
迁移数量异常*：若细胞迁移或侵袭数量异常增多，可能是下层孔趋化因子浓度过高或细胞密度过大。重新评估下层孔培养基中趋化因子浓度，参考文献或预实验数据调整至适宜范围。同时，检查细胞计数环节，确保细胞悬液密度准确，避免接种细胞数量过多。对于异常减少情况，需排查上层孔培养基是否缺氧影响细胞活性，调整培养箱氧气浓度或优化培养基配方，补充必要营养成分。还应检查 Matrigel 包被是否均匀，不均匀可能导致细胞难以突破或聚集局部穿膜。
-
差异不明显 ：首先确认实验操作规范性，包括细胞接种、培养时间、固定染色等环节。若操作无误，考虑实验生物学变异性，增加实验重复次数，一般至少进行 3 - 5 次独立重复实验。分析数据时，检查实验组与对照组间是否存在潜在干扰因素，如细胞批次差异、培养基批号不同等。可尝试更换细胞批次或培养基重新实验，同时优化实验设计，在实验组和对照组间设置梯度过渡组，更细致地观察变化趋势，挖掘可能被掩盖的差异。
（五）科研案例分享
（1）肿瘤转移机制研究案例
某研究团队利用 Transwell 实验探究非小细胞肺癌（NSCLC）细胞转移机制。他们选取多种 NSCLC 细胞系（如 A549、H1299、H1975），分别进行迁移和侵袭实验。在侵袭实验中，使用 50µg/mL Matrigel 包被 Transwell 小室。下层孔加入含 10% FBS 的培养基作为趋化源。实验发现 H1299 细胞侵袭能力显著高于其他两种细胞。进一步通过 Western blot 检测发现，H1299 细胞中上皮 - 间质转化（EMT）相关蛋白（如 N - cadherin、Vimentin）表达升高，E - cadherin 表达降低。他们查阅文献，锁定 TWIST1 蛋白作为潜在调控因子。接着，利用小 interfering RNA（siRNA）敲低 H1299 细胞中 TWIST1 表达后重复 Transwell 实验，结果显示细胞侵袭能力下降，EMT 标志蛋白表达变化逆转。该案例展示了如何借助 Transwell 实验结合分子生物学手段，从表型观察到分子机制探究肿瘤细胞转移机制。
以下是一篇肿瘤转移机制研究的文献分享，研究了短链脂肪酸受体 FFAR2 和 FFAR3 在乳腺癌细胞中的作用，通过在两种表型不同的乳腺癌细胞系（MCF7 和 MDA-MD-231）中过表达这些受体，检测其对细胞侵袭能力的影响。
（2）药物筛选应用案例
在筛选抗结直肠癌转移药物时，研究人员建立 Transwell 模型。选取结直肠癌细胞 SW480 和 LoVo，将细胞分为对照组、药物 A 组（低、中、高浓度）、药物 B 组（低、中、高浓度）。药物处理细胞后，进行 Transwell 迁移和侵袭实验，下层孔加入 50ng/mL 的趋化因子 SDF-1α。结果表明，药物 A 中、高浓度组细胞迁移和侵袭数量明显减少，而药物 B 各浓度组效果不明显。通过流式细胞术分析细胞周期和凋亡，发现药物 A 可诱导细胞周期阻滞于 G0/G1 期，并促进细胞凋亡，其作用呈浓度依赖性。进一步利用 RNA - seq 技术检测细胞基因表达变化，锁定药物 A 调控的多条与迁移侵袭相关的信号通路，为后续药物开发和作用机制研究提供方向。