摘要
库普弗细胞（Kupffer Cells）是肝脏中数量最多的常驻免疫细胞，也是维持肝脏稳态的重要组成部分。作为肝脏先天免疫系统的核心成员，Kupffer细胞不仅承担病原体清除、衰老细胞吞噬和免疫监视等功能，同时还深度参与药物性肝损伤（DILI）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纤维化及肝癌等疾病的发生发展过程。近年来，随着原代细胞培养、3D肝脏模型、类器官及器官芯片技术的发展，Kupffer细胞已成为肝病机制研究和新药筛选领域的重要研究对象。本文系统介绍Kupffer细胞的生物学特征、核心功能、疾病相关机制以及体外培养与模型构建要点。
关键词：库普弗细胞、Kupffer Cells、药物性肝损伤、原代库普弗细胞、DILI、NASH机制、肝纤维化、肝脏免疫、肝脏巨噬细胞、肝病模型、人原代肝细胞
一、库普弗细胞：肝脏中的第一道免疫防线
库普弗细胞（Kupffer Cells）是定居于肝脏血窦内的常驻巨噬细胞，占人体全部巨噬细胞总量的80%以上，是肝脏固有免疫系统的重要组成部分。由于门静脉持续将来自肠道的营养物质、代谢产物以及潜在病原体输送至肝脏，因此Kupffer细胞实际上承担着机体抵御血源性病原体入侵的重要职责。作为肝脏免疫防御体系中的"守门人"，Kupffer细胞能够持续监测循环系统中的危险信号，并快速做出反应，从而维持肝脏乃至整个机体的稳态平衡。
近年来大量研究表明，Kupffer细胞不仅参与病原体清除和免疫调节，同时也是药物性肝损伤（DILI）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、肝纤维化以及肝癌等疾病发生发展的关键调控细胞。因此，无论是在基础研究领域还是在新药研发领域，Kupffer细胞都已成为不可忽视的重要研究对象。
图1：肝脏巨噬细胞的分布与肝小叶结构示意图。库普弗细胞（Kupffer Cells）富集于门周区肝窦内。
二、库普弗细胞的解剖定位与发育来源
Kupffer细胞主要分布于肝小叶内的肝窦腔中，并呈现明显的门周区富集现象。靠近门静脉区域的肝窦内Kupffer细胞数量相对较高，而越靠近中央静脉区域，其分布密度则逐渐降低。这种特殊的空间分布方式与其生理功能高度一致，因为来自肠道的血液首先流经门周区，因此这里需要更强的免疫监测能力。
从形态学角度来看，Kupffer细胞呈星形结构，拥有大量伪足。其细胞体附着于肝窦内皮表面，而伪足则可穿过内皮细胞间隙伸向Disse间隙，与肝细胞、肝窦内皮细胞以及肝星状细胞形成复杂的细胞通讯网络。
与许多人印象中"来源于骨髓单核细胞"的巨噬细胞不同，稳态条件下的Kupffer细胞主要来源于胚胎时期卵黄囊红髓系前体细胞。成熟后的Kupffer细胞能够依靠局部自我更新机制长期维持数量稳定，仅在严重感染、毒性损伤或组织损伤等特殊情况下，骨髓来源单核细胞才会迁移至肝脏并补充Kupffer细胞群体。
三、库普弗细胞的核心生理功能
1. 病原体清除与免疫监视
Kupffer细胞最重要的生理功能之一是持续过滤门静脉血液。其表面表达多种模式识别受体和补体受体，可高效识别并吞噬细菌、病毒、真菌以及循环中的异物颗粒。研究显示，血液首次流经肝脏时，大部分血源性病原体即可被Kupffer细胞捕获和清除，从而阻止感染进一步扩散。
2. 清除衰老细胞与维持循环稳态
除病原体外，Kupffer细胞还承担着清除衰老血小板和红细胞的重要任务。衰老血小板表面糖基化结构发生改变后，可被Kupffer细胞识别并吞噬；部分衰老红细胞同样可被Kupffer细胞清除，从而参与铁代谢与铁循环过程。这种持续性的清除作用对于维持血液系统稳态具有重要意义。
3. 抗肿瘤免疫作用
Kupffer细胞同样具有重要的抗肿瘤功能。其能够识别并吞噬进入肝脏的肿瘤细胞，同时释放多种细胞因子激活T细胞和其他免疫细胞，共同参与抗肿瘤免疫反应。因此，在肝癌及肿瘤肝转移研究中，Kupffer细胞已成为重要研究方向之一。
四、库普弗细胞在肝脏疾病中的关键作用
1. 药物性肝损伤（DILI）
在药物性肝损伤研究领域，Kupffer细胞被认为是免疫介导性损伤的重要驱动因素。当药物代谢产物形成免疫原性复合物后，Kupffer细胞可被激活并释放TNF-α、IL-1β等炎症因子，从而诱导肝细胞损伤和坏死。由于这一过程涉及复杂的细胞间相互作用，因此仅采用单一肝细胞模型往往难以准确预测DILI风险。
2. NASH与脂肪肝疾病
在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中，游离脂肪酸以及肠源性内毒素能够激活Kupffer细胞，促使其向促炎表型转化。随后释放的大量炎症因子进一步诱导肝细胞脂肪变性，并激活肝星状细胞，最终促进纤维化发生。因此，Kupffer细胞已成为抗NASH药物开发的重要靶点。
3. 肝纤维化与肝硬化
长期慢性肝损伤可导致Kupffer细胞持续激活，并不断分泌TGF-β等促纤维化因子。这些信号能够刺激肝星状细胞转化为肌成纤维细胞，促进胶原蛋白沉积和细胞外基质重塑，最终推动肝纤维化和肝硬化的发展。
五、Kupffer细胞在科研中的应用价值
1. 构建高生理相关性的肝脏模型
随着药物研发对体外模型要求不断提高，研究人员越来越重视多细胞共培养体系的建立。相比传统单一肝细胞培养模型，引入Kupffer细胞后构建的共培养体系能够更真实地模拟肝脏微环境，并重现炎症反应、免疫应答以及纤维化进程，因此已广泛应用于DILI、NASH及抗纤维化药物研究。
2. 3D肝脏类器官与器官芯片研究
在3D肝脏类器官及器官芯片模型中，Kupffer细胞能够显著改善肝细胞功能维持时间，并增强模型对药物毒性和疾病机制的模拟能力。当前许多先进肝脏微生理系统（MPS）均将Kupffer细胞作为关键组成部分，以提升模型的生理相关性和预测能力。
3. 肝靶向药物递送研究
利用Kupffer细胞强大的吞噬能力，研究人员开发了多种肝脏靶向药物递送策略。通过优化纳米颗粒、脂质体或其他载体系统表面性质，可实现药物在肝脏中的富集，从而提高疗效并降低全身毒性。
六、原代Kupffer细胞培养与实验注意事项
1. 细胞特点
原代人Kupffer细胞属于终末分化细胞，在体外几乎不具备增殖能力，因此无法传代扩增。实验设计时需一次性准备足够数量的细胞，并尽量避免不必要的细胞损耗。
2. 复苏操作要点
复苏过程中应采用37℃快速解冻方式，并在细胞刚刚融化时立即停止加热。整个复苏和离心过程尽量保持低温环境，同时避免剧烈吹打，以降低细胞损伤和非特异性激活风险。
3. 铺板与贴壁
推荐细胞接种浓度为0.2--0.4×10⁶ cells/mL。接种后4--6小时应进行首次换液，以去除死亡细胞和未贴壁细胞，提高后续培养稳定性。
4. 培养维护
Kupffer细胞通常可维持培养约7天。为了保证实验结果稳定，建议尽量在复苏后72小时内完成吞噬实验、炎症刺激实验及细胞互作研究。
图2：人原代库普弗细胞。
七、FAQ：原代Kupffer细胞实验常见问题
Q1：为什么复苏后细胞活率较低？
主要与解冻速度、温度控制以及吹打操作有关。建议采用快速解冻、低温操作和轻柔重悬方式，同时确保培养体系无内毒素和支原体污染。
Q2：为什么Kupffer细胞容易脱壁？
Kupffer细胞本身贴壁能力较弱，建议使用I型胶原蛋白包被培养器皿，并控制合理接种密度，同时在接种后及时换液去除碎片和死亡细胞。
Q3：为什么原代Kupffer细胞不能传代？
原代Kupffer细胞属于终末分化细胞，在体外基本不增殖，一旦进行消化传代，其活率和功能均会明显下降，因此通常不建议传代培养。
Q4：如何减少细胞自发激活？
应避免温度剧烈变化、频繁吹打及机械刺激，同时使用低内毒素培养体系，并尽量缩短培养时间，以获得更稳定的实验结果。
Q5：共培养模型构建成功率低怎么办？
建议首先确认Kupffer细胞状态良好，再与肝细胞、肝星状细胞或肝窦内皮细胞进行联合培养，同时优化接种比例和培养条件，以提高模型稳定性和重复性。
八、总结
作为肝脏免疫系统的重要组成部分，Kupffer细胞在病原体清除、免疫调节、组织稳态维持以及疾病发生发展过程中均发挥着关键作用。从药物性肝损伤到NASH、肝纤维化乃至肝癌研究，Kupffer细胞已成为肝病机制研究和药物开发的重要工具。随着原代细胞培养、类器官和器官芯片技术不断进步，基于Kupffer细胞构建的高生理相关性模型正在成为肝病研究的重要方向。对于需要开展原代肝细胞、Kupffer细胞及相关肝脏模型研究的科研人员而言，可进一步参考相关人原代肝细胞与培养体系技术资料：
参考文献
Nusse Y., Kubes P. Liver macrophages: development, dynamics, and functions. Cell Mol Immunol. 2025;22:1178--1189.
关于技术来源
本文基于LifeNet Health公开资料及相关研究文献整理撰写。曼博生物持续关注原代肝细胞、Kupffer Cells、肝脏免疫、DILI、NASH、肝纤维化及肝脏微生理系统等研究方向，希望通过技术资料整理与分享，为科研工作者提供参考。