产品介绍
m5C是RNA甲基化修饰中丰度较低的一种类型，但在肿瘤中的研究进展已经引起了广泛关注。近年来，随着高通量测序技术的发展，可以在转录组中很好的识别对包括m5C在内的各种核苷酸甲基化修饰。m5C修饰可以影响RNA的稳定性、可变剪接、翻译和转录后修饰等多个方面，从而对基因表达和细胞功能产生影响。虽然有大量关于m5C在tRNA和rRNA中的数据，但由于mRNA的丰度较低，且缺乏有效的分离纯化技术，对其在mRNA中的作用知之甚少1。
为了推动mRNA m5C修饰研究，表观生物最新推出单碱基分辨率的mRNA m5C BS-seq技术服务。该技术使用重亚硫酸盐对不含修饰的C进行处理，使其在PCR之后转换为T，而m5C修饰并不能进行该转换。结合体外合成全转录组无修饰RNA技术，在mRNA m5C BS-seq中加入IVT RNA作为负对照，得到高置信度的m5C位点，降低了检测结果中的假阳性率。
技术流程
图1. m5C BS-seq技术流程
**关键实验步骤：**①RNA样本的准备与纯化；②重亚硫酸盐处理，将C转变为U；③cDNA合成，U转变为T；④文库构建，测序
02分析内容
标准分析：
m5C BS-seq
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原始数据过滤、质控
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参考基因组比对
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Peak calling
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Peak注释
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GO富集分析
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KEGG富集分析
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Motifs分析
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信号矩阵分析（Peak热图）
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CIMS 分析
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可视化文件
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差异分析（如果有多组样品，进行差异分析，找出差异结合位点）
mRNA
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测序原始reads去接头，质量控制
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参考基因组比对
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基因表达定量分析
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基因注释
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差异表达分析
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差异基因热图绘制（仅限有生物学重复）
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差异基因GO分析
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差异基因KEGG分析
03送样要求
样本类型：
需要富集polyA mRNA
Total RNA：50ug/样本
细胞：1.5*107 个细胞/样本
组织：25mg/样本
**样本物种：**仅限人、大小鼠，其他物种需评估
04测序数据量
10G/样本
05项目周期
40个工作日
06研究案例
Clin Transl Med：Nsun5/m5C介导的母源mRNA调控---卵巢衰老和胚胎发育的关键2
这项研究揭示了RNA甲基转移酶Nsun5及其介导的m5C修饰在调节卵巢功能和胚胎发育中的关键作用。研究人员利用Nsun5敲除（Nsun5KO）小鼠模型，并结合m5C-BS-seq、IF、WB和荧光素酶报告基因检测等技术，研究了Nsun5缺失的影响。对不同年龄Nsun5KO和野生型小鼠卵巢的m5C-BS-seq分析显示，与衰老相关的Nsun5KO小鼠m5C水平总体下降。值得注意的是，与卵母细胞成熟和生育能力相关的关键基因，如Mad2l2和Gdf9，在Nsun5KO小鼠中表现出m5C水平降低和蛋白质表达减少。进一步的研究证实了Nsun5与这些靶基因之间存在直接的相互作用。还发现Nsun5参与了对卵母细胞发育的调控。这些发现突出了Nsun5/m5C在控制母源mRNA稳定性方面的新调控轴，为了解卵巢衰老和早期胚胎发育的机制提供了重要的见解。
图2. 2个月（A-B）和6个月大(C-D)时，Nsun5KO和WT小鼠卵巢m5C水平的Pearson相关性热图（A）和总体水平的小提琴图（B）
图3. 韦恩图显示了2个月和6个月时，KO/WT比率小于0.8的m5C基因的重叠
图4. 重叠m5C基因的GO富集分析
参考文献：
1Zhang Z, Chen T, Chen HX, et al. Systematic calibration of epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library. Nat Methods. 2021;18(10):1213-1222.
2Ding C, Lu J, Li J, et al. RNA-methyltransferase Nsun5 controls the maternal-to-zygotic transition by regulating maternal mRNA stability. Clin Transl Med. 2022;12(12):e1137.