Discovery and Engineering of a Plant Glycosyltransferase for Efficient Benzylisoquinoline Alkaloid Glycosylation
一种高效催化苄基异喹啉生物碱糖基化的植物糖基转移酶发掘与改造
摘要
摘要 ：苄基异喹啉生物碱（BIAs）具备广阔药用潜力，但水溶性差、生物利用度低限制了其应用。糖基化能够改善上述理化性质，然而可高效催化多种苄基异喹啉生物碱糖基化的糖基转移酶（GTs）仍十分稀缺。本研究从马利筋（Asclepias curassavica ）中筛选得到 UGT74AN1，该酶可催化多种苄基异喹啉生物碱发生糖基化。借助结构指导的半理性改造，获得双突变体 UGT74AN1ᴹ²，其催化效率提升 341 倍。分子动力学模拟表明，突变可拓宽底物通道、增强底物结合能力。为摆脱反应对尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）的依赖，本研究利用 iMARS 平台构建融合酶 AtSuSy-L12-UGT74AN1ᴹ²，实现 UDPG 原位再生并高效催化苄基异喹啉生物碱糖基化。活性评价显示，产物 3-O-β-D - 葡萄糖基二氢药根碱（1b）相较于苷元具有更强的抑瘤活性，可显著抑制肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡。本研究建立了一套绿色合成苄基异喹啉生物碱糖苷的高效酶工具，同时为药物开发提供优质候选分子。
关键词 ：苄基异喹啉生物碱；UGT74AN1；糖基化；半理性改造；融合酶
1 引言
苄基异喹啉生物碱（BIAs）是一大类天然产物，主要分布于小檗科、毛茛科、防己科、罂粟科等植物类群。这类化合物拥有广谱生物活性，包括抗菌、调脂、抗肿瘤等。凭借抗菌特性，苄基异喹啉生物碱在农业与食品领域具备应用前景，有望开发为天然保鲜防腐制剂。同时，该类生物碱也应用于临床；1981 年获批上市的小檗碱就是代表性药物。尽管具备良好药用价值，但水溶性不佳、口服生物利用度低、潜在急性毒性等问题制约了苄基异喹啉生物碱类新药开发。
糖基化是突破上述瓶颈的有效策略，不仅能够提升生物利用度，还有望增强生物活性。例如，已有报道显示，经糖基修饰的四氢原小檗碱衍生物相较于苷元，对组织因子促凝活性的抑制作用得以保留甚至增强；糖基修饰的小檗碱衍生物降糖活性显著提升。值得关注的是，甘露糖修饰小檗碱衍生物细胞毒性大幅降低，且高低浓度下均维持优异降糖效果，具备开发新型降糖药物的潜力。
天然来源的苄基异喹啉生物碱大多以苷元形式存在，糖苷形式的天然产物鲜有报道。目前苄基异喹啉生物碱的糖基化制备主要依靠三种手段：化学合成、微生物转化与酶催化。化学合成需要繁琐的保护 / 脱保护步骤，反应效率低下；微生物转化受限于可用菌株稀缺、副产物多、产物分离纯化难度大。与之相比，糖基转移酶介导的酶促糖基化优势突出：无需保护基团、不使用有毒试剂，能够以高区域选择性与立体特异性将活化糖供体上的糖基转移至受体分子，是绿色高效的活性糖苷合成路线。
直接从苄基异喹啉生物碱原生宿主植物中挖掘糖基转移酶，是获得特异性催化剂最直接的思路，但该途径下成功挖掘的酶数量有限。另一种策略是利用糖基转移酶天然的底物杂泛性，催化非天然底物糖基化。该策略已有诸多成功案例：UGT94E13 用于合成新型 β-1,6-O - 二糖基化甜菊糖苷 Rebaudioside M9；MiCGT 催化天然黄酮 C - 糖苷生成；YjiC1 可制备蟾二烯内酯糖苷。因此，挖掘杂泛性糖基转移酶是可行备选方案，但往往存在催化效率偏低、区域选择性差等缺陷。
迄今为止，已有大量糖基转移酶完成功能表征，并作为酶工具用于各类糖苷合成。例如来源于链霉菌的改造酶 OleD 底物谱广泛，可识别 71 种不同受体；真菌糖基转移酶 MhGT1 能对 72 种底物实现区域及立体特异性糖基化。本课题组前期从长春花中鉴定的 UGT74AN3，可识别 78 种结构多样的化合物。尽管已有上述进展，能够高效催化苄基异喹啉生物碱糖基化的糖基转移酶仍鲜有报道。据我们所知，目前仅在红花中报道 3 种酶（UGT84A33、UGT71AE1、UGT90A14）可利用苄基异喹啉生物碱作为底物，但整体催化效率偏低，仅对药根碱、绿原酸（注：groenlandicine 为古伦丁）、非洲防己碱少数苷元实现较高转化率。因此，亟需发掘兼具高催化活性、底物广谱性的糖基转移酶用于多种苄基异喹啉生物碱修饰。
UGT74AN1 是来源于药用植物马利筋的类固醇 3-O - 糖基转移酶，研究发现其对药根碱具备良好催化活性。本研究通过半理性蛋白改造获得双突变体 UGT74AN1-T120F/V384G（UGT74AN1ᴹ²），催化效率显著提升，底物范围拓展至多种苄基异喹啉生物碱。借助分子动力学模拟，揭示突变体活性提升的分子机制。为满足实际应用、解除反应对外源 UDPG 的依赖，本研究依托 iMARS 平台构建融合酶 AtSuSy-L12-UGT74AN1ᴹ²，实现 UDPG 原位再生，整套体系糖基化效率与单独使用 UGT74AN1ᴹ² 相当。此外，我们评价了糖基化产物 3-O-β-D - 葡萄糖基二氢药根碱（1b）的抗肿瘤活性。上述研究为苄基异喹啉生物碱酶促糖基化提供可行方案，也为构建高效糖基转移酶工具库奠定理论基础。
2 材料与方法
2.1 试剂与药品
化合物 1～13、尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司（表 S1）。蛋白结晶相关试剂购自美国 Sigma-Aldrich 公司与美国 Hampton Research 公司。色谱纯乙腈、甲醇购自德国默克公司。氘代二甲基亚砜（DMSO-\(d_6\)）购自美国剑桥同位素实验室。Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶、DpnI 限制性内切酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。细胞培养相关试剂，包括高糖培养基（DMEM）、RPMI-1640 培养基、胎牛血清（FBS）购自美国 Gibco 公司；青链霉素混合液购自合肥 Biosharp 公司。CCK-8 试剂盒购自美国 MedChemExpress 公司。PCNA、β- 微管蛋白一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗、CoraLite 488 Plus TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒分别购自美国 Cell Signaling Technology 公司、武汉普赛特生物科技有限公司。BCA 蛋白定量试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、5× 蛋白上样缓冲液、SuperPico 超敏 ECL 化学发光试剂盒购自武汉赛维尔生物科技有限公司。含 DAPI 抗荧光淬灭封片剂购自上海碧云天生物技术有限公司。
所有核磁共振（NMR）测试均在布鲁克 Avance III-600 核磁共振仪（美国 Billerica）上完成。
2.2 基因合成、载体构建与菌株培养
马利筋来源 UGT74AN1（GenBank：MF942416）、云南萝芙木 RyUGT73A（GenBank：MT075679）、西藏钩藤 UGT72AS1（GenBank：MZ323128）、青牛胆 TcCGT1（GenBank：MK644229）、拟南芥 AtSuSy（NP_001331822.1），以及黄连 4 条候选糖基转移酶基因（GenBank：KAF9624963、KAF9625022、KAF9621976、KAF9621964）由北京擎科生物进行密码子优化、人工合成，并分别克隆至 pET-28a (+) 载体，用于大肠杆菌异源表达。重组质粒转化大肠杆菌 Rosetta (DE3) 感受态细胞，涂布于含 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 固体培养基筛选阳性克隆。
2.3 蛋白表达、纯化、结晶与结构解析
重组糖基转移酶、突变体蛋白及 AtSuSy 参照已有方法进行表达纯化。简述如下：挑取携带目标质粒的大肠杆菌 Rosetta (DE3) 单菌落，接种至含 50 μg/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基，37 ℃、220 rpm 振荡过夜培养；菌液按 1:100 比例转接至新鲜 LB 卡那霉素培养基，培养至\(OD_{600}\)≈0.6；加入 0.5 mM 异丙基 -β-D - 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导蛋白表达，18 ℃、180 rpm 培养 18 h。
5000 g 离心 20 min 收集菌体，重悬于裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，300 mM NaCl），采用高压均质机（ATS AH-NANO，中国）800 psi 破碎细胞。裂解液 12000 g 离心 60 min，上清上样至 Ni-NTA 亲和层析柱（常州 Smart-lifesciences）；使用 10 倍柱体积洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，300 mM NaCl，25 mM 咪唑）冲洗杂蛋白，洗脱缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，300 mM NaCl，300 mM 咪唑）洗脱目标蛋白。洗脱组分使用 Amicon Ultra-15 超滤管（截留分子量 30 kDa，默克密理博）浓缩；随后采用 Superdex 200 Increase 10/300 GL 凝胶过滤层析（GE Healthcare）进一步精制，流动相为储存缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8.0，150 mM NaCl，5% 甘油）。SDS-PAGE 检测蛋白纯度，NanoDrop 2000 分光光度计测定蛋白浓度。纯化蛋白分装，液氮速冻后置于−80 ℃保存。
蛋白结晶：纯化 UGT74AN1 浓缩至 5 mg/mL，采用悬滴气相扩散法，18 ℃条件下结晶；体系为 1.0 μL 蛋白溶液 + 1.0 μL 池液（0.2 M 硫酸铵、0.1 M Bis-Tris pH 6.5、20% (w/v) PEG 3350），晶体通常 2～3 d 内长出。冷冻保护：晶体短暂浸泡添加 20% (v/v) 甘油的池液，随后液氮速冻。X 射线衍射数据采集于上海同步辐射光源 BL19U1 线站。利用 XDS 软件处理衍射数据；以 AlphaFold3 预测的 UGT74AN1 模型为搜索模板，在 Phenix 软件中通过分子置换解析晶体结构；AutoBuild 搭建初始模型，Coot 手动修正；Phenix 完成多轮迭代优化与结构验证。蛋白 - 配体相互作用使用 Protein--Ligand Interaction Profiler 分析，结构图采用 PyMOL 绘制。
2.4 糖基转移酶对苄基异喹啉生物碱底物的催化活性测定
酶活初筛体系总体积 200 μL：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mM 药根碱、2.0 mM UDPG、100 μg 粗酶液。37 ℃孵育 2 h，加入等体积冰甲醇终止反应；12000 g 离心 30 min，上清采用 Thermo UltiMate 3000 高效液相色谱仪检测，色谱柱 Welch Ultimate XB-C18（250 mm × 2.1 mm，3 μm）。流动相 A 相：0.1% 甲酸水溶液，B 相：乙腈；流速 0.8 mL/min，检测波长 280 nm。洗脱梯度：0--15 min，10%--40% B；15--16 min，40%--100% B；16--18 min，100% B；18--20 min，100%--10% B；20--25 min，10% B。
UGT74AN1 针对多种 BIAs 底物（化合物 2--13）的酶活测定体系同样为 200 μL：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mM BIA 底物、2.0 mM UDPG、100 μg 纯化 UGT74AN1。37 ℃孵育 2 h，冰甲醇终止反应，采用上述 HPLC 方法评价底物杂泛性。
2.5 糖基化产物结构鉴定
制备级反应体系 40 mL：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、0.5 mM 药根碱（DMSO 溶解）、2.0 mM UDPG、0.05 mg/mL 纯化 UGT74AN1。37 ℃孵育 4 h，加入 40 mL 冰甲醇终止反应；12000 g 离心 20 min，上清使用岛津 LC-20AT 制备型液相纯化，制备柱 COSMOSIL 5C18-MS-II（250 mm × 10 mm，5 μm）。纯化产物采用 Xevo G2-XS Q-TOF 高分辨电喷雾质谱（HR-ESI-MS）与核磁共振波谱（¹H：600 MHz；¹³C：150 MHz，溶剂 DMSO-\(d_6\)）解析结构。
2.6 定点突变与突变体构建
使用特异性引物（表 S2）开展定点突变与组合突变；以 pET28a-UGT74AN1 质粒为模板进行 PCR 扩增，Phanta Max 超保真 DNA 聚合酶催化扩增；37 ℃条件下 DpnI 消化模板质粒 1 h。产物转化 DH5α 感受态细胞扩增质粒，测序验证所有突变位点；正确突变质粒转入大肠杆菌 Rosetta (DE3) 用于蛋白表达。
2.7 酶动力学参数测定
测定 UGT74AN1 及其突变体（T120F、V384G、UGT74AN1ᴹ²）对底物 4 的动力学参数。标准反应体系 100 μL：50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、4 mM UDPG、梯度浓度底物 4（0.001--1 mM）、纯化酶（UGT74AN1：20 μg；T120F/V384G/UGT74AN1ᴹ²：2 μg）。37 ℃孵育 10 min，加入 100 μL 甲醇终止反应。12000 g 离心 20 min 去除蛋白沉淀，上清 HPLC 检测；每组实验设置 3 次生物学重复。采用 GraphPad Prism 8.0 非线性拟合计算动力学参数\(K_m\)、\(k_{cat}\)。
2.8 分子动力学模拟
以 UGT74AN1/UDPG/ 底物 4 复合物晶体结构作为模拟初始模型；利用 PyMOL 引入 T120F、V384G 突变。AmberTools 中 Antechamber 模块进行体系参数化：配体采用 GAFF 力场，蛋白采用 Amber14SB 力场；体系置于 TIP3P 显性水盒中。使用 NAMD 2 开展分子动力学模拟，每个复合物独立运行 100 ns 生产模拟。采用 MDAnalysis 工具包分析轨迹，R 语言 Seaborn 包绘图可视化。
2.9 AtSuSy、UGT74AN1 游离酶共反应体系与融合酶反应体系
参照已有研究搭建反应体系：100 μL 体系含 1 mM 化合物 4、500 mM 蔗糖、0.5 mM UDP、50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）、60 μg 纯化 UGT74AN1 + 80 μg 纯化 AtSuSy（或 60 μg 融合蛋白）。37 ℃过夜孵育，加入 100 μL 甲醇终止反应；12000 rpm 离心 20 min，上清采用 HPLC 与液质联用检测。
2.10 融合酶构建及反应体系优化
以 AtSuSy、UGT74AN1 为模板，使用特异性引物（表 S2）构建融合酶；通过多片段同源重组获得融合表达质粒。4 种融合酶采用与 UGT74AN1 完全相同的方法表达纯化。针对融合酶催化体系开展条件优化，考察 4 个关键变量：UDP 与蔗糖摩尔比（1:1000、1:200、1:100、1:50、1:10、1:1、1:0.5）、反应时间（30--360 min）、pH（3.0--11.0）、温度（4--60 ℃）；所有实验均设置 3 次重复。
2.11 细胞培养
人结肠癌细胞 HCT116（RRID: CVCL_0291）购自上海中乔新舟生物科技有限公司（2024 年 10 月）；经 STR 分型鉴定，支原体检测阴性。
2.12 细胞活力检测（CCK-8）
采用 CCK-8 实验评价化合物 1 与 1b 的体外抗增殖活性。取对数生长期 HCT116 细胞，以 1×10⁴个 / 孔接种于 96 孔板，贴壁培养 24 h；更换含不同浓度药物的新鲜完全培养基，处理 24 h 或 48 h。每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，37 ℃避光继续孵育 2 h；BioTek Synergy 2 酶标仪读取 450 nm 吸光度。 细胞活力计算公式： 细胞活力 (%) = (给药组 OD − 空白 OD)/(对照组 OD − 空白 OD) × 100% GraphPad Prism 8.0 计算半数抑制浓度\(\text{IC}_{50}\)。
2.13 总蛋白提取与蛋白质免疫印迹（Western Blot）
50 μM 化合物 1 或 1b 处理 HCT116 细胞 24 h，收集细胞，预冷 PBS 洗涤 2 次；添加含蛋白酶、磷酸酶抑制剂的 RIPA 裂解液提取总蛋白；冰上超声破碎，4 ℃、12000 g 离心 15 min。BCA 试剂盒测定上清蛋白浓度；蛋白样品加入 5× 上样缓冲液，100 ℃加热 10 min 变性。每孔上样 20 μg 总蛋白，SDS-PAGE 分离后转印至 PVDF 膜；5% 脱脂牛奶 TBST 室温封闭 1 h；加入 PCNA 一抗（1:1000）、β-tubulin 一抗（1:10000），4 ℃孵育过夜。洗膜后加入 HRP 标记山羊抗兔二抗（1:5000）室温孵育 1 h。SuperPico ECL 发光试剂盒显影，Tanon 5200 化学发光成像系统采集图像；ImageJ 定量条带灰度，以 β-tubulin 作为内参归一化。
2.14 TUNEL 凋亡染色
采用 CoraLite488 Plus TUNEL 凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡。HCT116 细胞接种于铺有无菌盖玻片的 24 孔板；药物处理 24 h 后，PBS 清洗，4% 多聚甲醛固定 30 min，0.2% Triton X-100 透膜 20 min。按照试剂盒说明书配制 TUNEL 反应液滴加于盖玻片，37 ℃避光孵育 60 min；洗涤后使用含 DAPI 抗荧光淬灭封片剂封片。奥林巴斯 BX53 荧光显微镜采集图像；ImageJ 统计 TUNEL 阳性细胞比例与绿色荧光通道平均荧光强度（MFI）。
2.15 统计学分析
所有数据以平均值 ± 标准误（mean ± SEM）表示，采用 GraphPad Prism 8.0 进行统计分析。Shapiro-Wilk 检验数据正态性，Brown-Forsythe 检验方差齐性。两组正态、方差齐数据比较采用独立样本双尾 t 检验；多组比较采用单因素方差分析（ANOVA），事后检验采用 Dunnett's T3 检验；不满足正态或方差齐性条件时，选用非参数检验（Mann−Whitney U 检验、Kruskal−Wallis 检验）或 Welch 方差分析。\(P<0.05\)认为差异具有统计学意义（*\(P<0.05\)，\(P<0.01\)， *\(P<0.001\)）。
2.16 转录组测序（RNA-Seq）
HCT116 细胞接种于 6 孔板，贴壁过夜；分别使用药根碱、化合物 1a 或溶剂对照（NC）处理 24 h，每组设置 3 个生物学重复。收集细胞，RNAiso 试剂提取总 RNA。文库构建与测序由华大基因（武汉）完成：oligo (dT) 磁珠富集 mRNA，片段化后合成一链、二链 cDNA；双链 cDNA 末端修复、加 A 尾、连接接头，PCR 扩增；产物热变性环化得到单链环状 DNA 文库。合格文库在 DNBSEQ 平台采用 PE150 策略测序。
生物信息分析流程：原始测序数据经 SOAPnuke 过滤，去除测序接头、N 碱基占比＞0.1% 及低质量读段（＞20% 碱基质量值＜15）得到 clean reads；HISAT2 比对至人参考基因组 GRCh38/hg38；基因表达水平以 FPKM（每百万比对片段中每千转录本长度片段数）量化。
2.17 生物信息学分析
基于 R 语言 limma 包（v3.52.1）开展差异基因分析；满足\(|\log_2(\text{FC})|>0.3\)且\(P<0.05\)的基因判定为差异表达基因（DEGs）。使用 clusterProfiler 包（v4.4.4）进行 GO、KEGG 通路富集分析；基因集来源于 MSigDB 数据库。同时借助 clusterProfiler、GSVA 包（v1.48.0）分别开展基因集富集分析（GSEA）与基因集变异分析（GSVA）。
3 结果与讨论
3.1 可催化苄基异喹啉生物碱糖基化的糖基转移酶筛选
为挖掘能够催化苄基异喹啉生物碱（BIA）糖基化的糖基转移酶（GT），本研究采用两套策略开展功能酶发掘。首先，选取可天然积累 BIA 糖苷、且基因组数据公开的黄连（Coptis chinensis ）开展基因挖掘工作。以 3 个已功能表征的红花来源糖基转移酶 UGT84A33、UGT71AE1、UGT90A14 作为 BLAST 检索探针，筛选得到序列相似度最高的 4 条候选基因：KAF9624963、KAF9625022、KAF9621976、KAF9621964，用于后续功能验证。其次，依托多种糖基转移酶天然具备底物杂泛性的特点，额外选取 6 个已有报道、可识别多种底物的候选酶，包括云南茜草来源蒽醌糖基转移酶 RyUGT73A、铁筷子来源黄酮糖基转移酶 UGT72AS1、金莲花来源黄酮 C - 糖基转移酶 TcCGT1，以及 3 个类固醇 3-O - 糖基转移酶：马利筋 UGT74AN1、牛角瓜 UGT74AN2、长春花 UGT74AN3。
系统发育分析显示，上述候选糖基转移酶分属多个亚家族，涵盖 UGT90、UGT73、UGT72、UGT71、UGT84 与 UGT74（图 1A，表 S3）。选取具备多样药理活性的典型 BIA 药根碱作为初始筛选的糖基受体（图 1B），已有文献在黄连中报道其糖苷衍生物。体外酶活实验以药根碱为受体、UDPG 为糖供体进行检测，结果显示 4 条黄连来源候选酶均无明显催化活性。与之相比，6 个具有底物杂泛性的候选酶中，UGT74AN1、UGT74AN2、UGT74AN3 均可显著催化药根碱糖基化（图 1C）。
高效液相色谱（HPLC）检测出现一个新产物峰（命名化合物 1a），保留时间 10.7 min；高分辨质谱（HR-MS）证实化合物 1a 准分子离子峰 M+H⁺为 500.1981，相比药根碱分子量增加 162 Da，证明其为单糖基化衍生物（图 S1）。其中 UGT74AN1 催化效率最高，底物转化率接近 100%（图 1C）。值得关注的是，BIA 属于多稠环大分子，空间结构与类固醇存在相似性；这一结构特征或许可以解释：原本参与强心内酯合成的 UGT74AN1、UGT74AN2、UGT74AN3，能够催化药根碱发生糖基化。
为解析糖基化产物结构，开展放大制备反应获取化合物 1a。在纯化过程中，化合物 1a 被还原生成二氢药根碱葡萄糖苷（化合物 1b）。质谱结果显示化合物 1b M+H⁺为 502.2058，相比 1a 分子量增加 2 Da，提示 C8=N7 双键发生还原；¹H 核磁共振（¹H NMR）证实该结论，H-8 信号出现在 δ 4.21（s, 2H），符合 N7--C8 双键加氢饱和特征。进一步核磁分析检测到葡萄糖特征质子信号：δ 4.94 (1H, d, J = 6.3 Hz, Glc-H1)、3.67 (1H, d, J = 11.6 Hz, Glc-H6)、3.27--3.32 (2H, 重叠，Glc-H2、Glc-H3)、3.21 (1H, m, 重叠，Glc-H5)、3.17 (1H, 重叠，Glc-H4)；碳信号 δ 100.0 (Glc-1)、77.2 (Glc-5)、76.9 (Glc-3)、73.2 (Glc-2)、69.6 (Glc-4)、60.6 (Glc-6)（图 S3--S4）。HMBC 谱观测到葡萄糖 H1 与苷元 C-3 存在相关信号，确定糖基修饰位点为 3 位羟基；异头质子耦合常数 J=6.3 Hz，证明糖苷键为 β 构型。综上，化合物 1b 鉴定为3-O-β-D - 葡萄糖基二氢药根碱 。
3.2 UGT74AN1 对苄基异喹啉生物碱的底物杂泛性
鉴于 UGT74AN1 对药根碱具备优异糖基化活性，本研究选取一系列结构多样的 BIA 底物系统评价其底物谱（图 2A）。底物涵盖多个结构类型： A）苄基四氢异喹啉类：乌药碱 (11)、巨箭毒碱 (12)、二甲基乌药碱 (13)； B）原小檗碱型：古伦丁 (2)、去亚甲基小檗碱 (3)、非洲防己碱 (5)、小檗红碱 (8)、巴马汀红碱 (9)； C）四氢原小檗碱型：(S)- 四氢非洲防己碱 (4)、(S)- 紫堇碱 (6)、(S) 千层塔任碱 (7)、黄柏碱 (10)。
HPLC-UV/MS 结果表明，UGT74AN1 可催化 10 种底物（1--7、10、12、13）发生糖基化，表现出良好底物杂泛性（图 2B；图 S6--S15），但对不同底物催化效率差异显著。对底物 1、2、3 催化活性极高，转化率＞90%；其余多数底物（4--7、10、12、13）转化率低于 50% 甚至不足 20%。底物 2 的糖基化产物 2a 鉴定为 3-O-β-D - 葡萄糖基二氢古伦丁（图 S16--S17）。以底物 3 反应时，主峰产物 3a 之外伴随少量副产物 3b；3a 解析为 3-O-β-D - 葡萄糖基二氢去亚甲基小檗碱（图 S18--S19），推测 3b 为 C2 糖基化产物（因产率低未大量制备）。
UGT74AN1 同样可催化带有 C3 羟基的底物 4--7 糖基化；产物 4a 鉴定为 2-O-β-D - 葡萄糖基四氢非洲防己碱（图 S20--S22）。针对底物 10，核磁分析产物 10a 证实糖基修饰发生在 C2 位（图 S23--S25）。以上结果说明：针对原小檗碱母核 A 环羟基，UGT74AN1 具备严格区域选择性；该空间偏好提示底物结合口袋中，分子 A 环倾向朝向催化中心。该酶可催化 C2 或 C3 羟基糖基化，但偏好 C3 位；底物 4--7、10 转化率显著低于 1、2，印证该偏好。值得注意，仅在 C9 带有羟基的底物 8、9 完全不被催化。综上，UGT74AN1 催化 BIA 糖基化具备显著区域选择性。
另外，制备纯化阶段得到的产物均以还原形式（1b、2a、3a）存在。推测成因：旋转蒸发过程中富集流动相中的 0.1% 甲酸，酸性环境促使原小檗碱类生物碱 C8=N7 亚胺键还原，生成对应的二氢衍生物，与已有文献报道一致。
3.3 UGT74AN1 晶体结构解析与底物结合口袋特征
为指导后续蛋白改造，解析游离态 UGT74AN1 晶体结构，分辨率 2.84 Å（表 S4，图 S26）。UGT74AN1 以同源二聚体形式存在，每个不对称单元包含两个蛋白分子（图 3A）。该酶属于典型 GT-B 折叠：由 N 端结构域（NTD，1--233、456--471 位氨基酸）、C 端结构域（CTD，234--264 位氨基酸）以及连接环区（265--455 位氨基酸）构成；两个结构域均为类 Rossmann（β/α/β）折叠，该构象在植物糖基转移酶中高度保守。NTD 包含 7 个 α 螺旋与 7 条 β 折叠，CTD 包含 8 个 α 螺旋与 7 条 β 折叠（图 S27）。
为深入阐明底物识别与催化机制，搭建 UGT74AN1-UDPG - 药根碱（1）三元复合物模型（图 3B）。模型显示 UDPG 结合于高度保守的 PSPG 基序附近；底物结合口袋附近存在由 His25 与 Asp118 构成的催化二元体（图 3C）。定点突变证实 H25A、D118A 突变体完全丧失酶活（图 3D），证明 UGT74AN1 催化 BIA 糖基化遵循植物 GT1 家族保守催化机制。
结构分析显示，药根碱依靠与 Phe186、Trp383 的疏水相互作用，以及与 Asp385、His24 氢键作用稳定结合在活性中心（图 3C）。F186A、W383A、D385A 突变体酶活大幅下降（图 3D），证实上述氨基酸位于底物口袋，对底物正确定位与高效催化必不可少。进一步口袋尺寸分析：UGT74AN1 底物结合口袋深度 23.70 Å，表面积 1815.72 Ų，体积 1991.17 ų。对比另一已知广谱糖基转移酶 UGT74AN3 的结合口袋，二者尺寸高度接近（图 S28），从结构层面佐证 UGT74AN1 对多种 BIA 具备底物杂泛性。
3.4 基于蛋白工程提升 UGT74AN1 催化活性
尽管 UGT74AN1 能够识别多种 BIA，但整体催化效率偏低，限制其规模化合成 BIA 糖苷的实际应用。为改善酶催化性能，开展基于结构的蛋白改造（图 4A）。野生型酶催化四氢非洲防己碱（底物 4）转化率约 40%，因此选取底物 4 作为模型受体评价突变体酶活（图 2B）。
构建 UGT74AN1-UDPG - 底物 4 三元复合物结构模型（图 4B）。根据分子对接结果，选取距离底物 4 小于 5 Å 范围内 22 个氨基酸作为潜在改造位点；评估序列保守性，剔除保守评分＞70% 的 10 个残基。剩余 12 个位点（Phe19、Phe85、Phe88、Arg89、Ser119、Thr120、Phe186、Phe192、Val193、Leu197、Ile286、Val384）开展丙氨酸扫描突变（图 4C，图 S29）。T120A、V384A 两个单点突变活性显著提升，相对野生型分别提高 3.4 倍、3.3 倍（图 4C）。
随后对 Thr120、Val384 位点开展饱和突变，筛选得到最优单点突变 T120F、V384G，催化活性分别提升 4.3 倍、4.8 倍（图 4E）。将两个有益突变叠加，构建双突变体 T120F/V384G（UGT74AN1ᴹ²），催化活性较野生型提升 5.8 倍（图 4E）。双突变增益低于两个单点突变叠加效应；结构分析显示两个残基空间距离 9.2 Å，不存在直接位阻拮抗作用（图 S30）。
利用其余 BIA 底物评价双突变体催化能力：底物 1--7、10--11、13 转化率均超过 80%（图 4G）；底物 12 转化率提升至 48%，相比野生型（12%）提高 4 倍。值得注意，双突变体依旧无法催化仅 C9 带有羟基的底物 8、9，说明催化效率提升并未改变酶对 BIA 底物固有的区域选择性。综上，本研究获得双突变体 UGT74AN1ᴹ²，可作为高效生物催化剂催化多种 BIA 糖基化。
3.5 突变体 UGT74AN1ᴹ² 催化效率提升的结构机制
首先测定野生型与突变体针对底物 4 的动力学参数（图 4F）。野生型 UGT74AN1 底物亲和力偏弱，\(K_m\)=602.6 μM；T120F、V384G、T120F/V384G 突变体\(K_m\)分别降至 264.2、381.6、166.9 μM，底物亲和力提升 1.58～3.6 倍（表 S5，图 S31）。野生型催化效率\(k_{cat}/K_m\)=1.1 mM⁻¹・min⁻¹；T120F、V384G、T120F/V384G 分别达到 195.5、301.6、375.9 mM⁻¹・min⁻¹，相较野生型提升约 178 倍、274 倍、341 倍。结果表明：突变体活性提升源于底物亲和力增强与周转速率大幅提高。
搭建 UGT74AN1ᴹ²-UDPG - 底物 4 复合物模型，解析突变带来的结构变化（图 5A）。结构叠合显示 F120、G384 均位于底物结合口袋内部；V384G 突变移除缬氨酸侧链造成的空间位阻，有效扩大底物进入通道容积（图 5B、5C）。
对野生型与 UGT74AN1ᴹ² 复合物开展常规分子动力学模拟。突变体复合物均方根偏差（RMSD）整体更低，说明蛋白结构更稳定，配体在活性中心结合更加牢固（图 S32）。采用全原子显式溶剂力场，通过元动力学模拟构建自由能曲面（FES）。根据公认糖基转移酶催化机理：底物 4 的 2 位羟基氧原子与 UDPG 的 C1′间距＜3.5 Å，同时 O−C1′−O1′键角处于 125°--155° 区间，才能形成反应构象（图 5A）。
轨迹统计显示：突变体形成有效反应构象的概率为 13.0%，约为野生型（3.9%）的 3.3 倍（图 5D、5E），说明突变体更容易进入利于糖苷键生成的过渡态构象。野生型与突变体复合物自由能分布差异显著：野生型全局最低自由能（ΔG = −8.00 kcal/mol）对应松散结合状态，O--C1′距离 7.2 Å；另一局部极小值（ΔG = −5.35 kcal/mol）距离缩短至 4.15 Å，仍超出反应阈值（图 5D，图 S33）。突变体不仅全局最低自由能更低（ΔG = −10.58 kcal/mol），还在反应区间存在稳定局部状态（ΔG = −8.45 kcal/mol），此时 O--C1′距离 3.35 Å、O−C1′−O1′键角 140.5°，完全满足催化空间要求（图 5E，图 S33）。
催化过程代表性构象分析揭示二者相互作用差异：野生型复合物中 H24 与底物 4 的 C3 羟基形成氢键，I286、W383 与底物产生疏水作用（图 5F）；突变体复合物新增相互作用，Q141 可与底物 C3 羟基形成第二条氢键；同时 19 位、120 位苯丙氨酸（T120F 突变引入）联合 I286、W383 形成更强疏水网络（图 5G）。新增分子相互作用显著强化酶 - 底物结合能力，共同促成 UGT74AN1ᴹ² 催化活性大幅提升。
3.6 基于 iMARS 平台构建 UDPG 再生融合酶用于苄基异喹啉生物碱糖基化
苄基异喹啉生物碱（BIA）的糖基化反应高度依赖辅因子 UDPG，该因素严重制约突变体 UGT74AN1ᴹ² 的实际应用。 为解决这一难题，将糖基转移酶与蔗糖合酶偶联以实现 UDPG 原位再生，已被广泛证实是多种天然产物低成本糖基化的高效策略（图 6A）。 然而，游离酶偶联体系存在酶分子扩散、底物稀释、反应周期长等缺陷，难以实现工业化放大。 融合酶技术通过合适连接肽与排布方式将多种酶共价连接，能够有效克服上述问题。 近期，依托蛋白质结构分析的人工智能平台 iMARS 可快速设计高活性融合酶，为构建高效 UDPG 再生体系提供了新方案。
借助 iMARS 平台，本研究设计一系列融合酶，将突变体 UGT74AN1ᴹ² 与蔗糖合酶 AtSuSy 进行连接。筛选排名前四的融合构建体：AtSuSy-L83-UGT74AN1ᴹ²、AtSuSy-L90-UGT74AN1ᴹ²、AtSuSy-L50-UGT74AN1ᴹ²、AtSuSy-L12-UGT74AN1ᴹ² 开展活性评价（图 6B）。以化合物 4 为底物检测催化性能：游离酶共反应体系可将化合物 4 部分转化为产物 4a，证明 UGT74AN1ᴹ² 与 AtSuSy 联用能够实现 UDPG 原位再生。四种融合酶均具备催化活性，其中 12 号连接肽（GDGDGD）构建的融合酶活性最优，转化效率与单独使用 UGT74AN1ᴹ² 外加外源 UDPG 的体系相当（图 6C、图 S34）。
结构分析显示，该最优融合酶两个蛋白底物结合口袋间距（DIC）为 48.28 Å，底物通道夹角（OIC）为 95.49°（图 6D）。进一步对 AtSuSy-L12-UGT74AN1ᴹ² 催化合成 4a 的反应条件进行优化，得到最优条件：37 ℃、pH 7.0、蔗糖与 UDP 摩尔比 50:1，2 h 内达到最高转化率（图 S35）。 融合酶 AtSuSy-L12-UGT74AN1ᴹ² 不仅省去昂贵外源 UDPG 的添加，还简化酶制剂制备流程，为苄基异喹啉生物碱及其衍生物的糖基化提供低成本、高效率的酶催化工具。
3.7 药根碱及其还原糖苷 1b 的抗肿瘤活性评价
为评估本酶催化体系所得糖基化产物的生物活性，选取转化率与产率最高的代表性产物3-O-β-D - 葡萄糖基二氢药根碱（1b） ，利用人结肠癌细胞 HCT116 开展抗肿瘤活性评价。 化合物 1b 对 HCT116 细胞的增殖抑制活性优于母药根碱（化合物 1）。处理 24 h 后，化合物 1b 的 IC₅₀为 10.0 μM，较化合物 1（19.4 μM）降低近一半（图 7A）。作用 48 h 后，糖基衍生物仍保持更强抑制效果：化合物 1b IC₅₀降至 5.7 μM，化合物 1 IC₅₀为 11.7 μM（图 7B）。结果表明，相较于母核苷元，化合物 1b 对 HCT116 细胞具有更强的增殖抑制活性。
为探究化合物 1b 活性提升的潜在机制，检测其对关键细胞生理过程的影响。增殖细胞核抗原（PCNA）是经典细胞增殖标志物，采用蛋白免疫印迹（Western blot）检测其表达水平。使用 10 μM 化合物 1 或 1b 处理 HCT116 细胞 24 h，二者均下调 PCNA 表达；且化合物 1b 处理组 PCNA 下调程度显著高于化合物 1 组（图 7C、7D）。 诱导细胞凋亡是众多抗肿瘤药物发挥药效的重要途径，因此采用 TUNEL 染色检测化合物 1、1b 的促凋亡能力。结果显示，化合物 1b 诱导 HCT116 细胞凋亡效果优于化合物 1；基于 TUNEL 阳性细胞比例与平均荧光强度定量分析表明，同等浓度下化合物 1b 引发的细胞凋亡水平显著更高（图 7E--7G）。 以上证实，在 HCT116 细胞模型中，糖基化产物 1b 抗肿瘤活性优于母核苷元；活性提升源于更强的增殖抑制与促凋亡效应，说明糖基化修饰能够改善苄基异喹啉生物碱的生物活性。
为进一步解析活性增强的分子基础，对经化合物 1、1b 处理的 HCT116 细胞开展转录组测序（图 S36）。转录组分析发现：两种化合物均可下调一组共同的促癌基因；除此之外，1b 能够特异性抑制多个调控结直肠癌进展的关键驱动基因（如 JRK、GPR176 以及脂质代谢相关基因），同时上调 Notch 信号通路负调控因子（图 S37）。上述独特转录调控差异，解释了糖基化产物 1b 抗肿瘤效果更优的分子机制。 尽管 1b 是糖基化产物 1a 的还原形式，但其生物活性的获得根源在于改造融合酶催化完成的糖基化修饰。
小结
本研究整合酶筛选与蛋白质工程策略，建立一套高效的苄基异喹啉生物碱 O - 糖基化技术平台。 从多种具备底物杂泛性的糖基转移酶中筛选得到 UGT74AN1，证实其可催化苄基异喹啉生物碱糖基化；通过半理性设计获得双突变体 UGT74AN1ᴹ²，催化效率大幅提升。分子动力学模拟表明，两处突变能够稳定底物结合、促进形成有利于催化的构象。 针对反应依赖 UDPG 这一应用瓶颈，借助 iMARS 人工智能平台构建融合酶 AtSuSy-L12-UGT74AN1ᴹ²，可同步实现 UDPG 原位再生与 BIA 糖基化，催化效率与单独使用 UGT74AN1ᴹ² 体系持平。 活性评价证实，糖基化产物 3-O-β-D - 葡萄糖基二氢药根碱（1b）抗肿瘤活性显著优于母核苷元（化合物 1），凸显糖基化修饰对提升苄基异喹啉生物碱生物活性的重要价值。 本工作不仅为苄基异喹啉生物碱糖苷的绿色生物合成提供高效酶工具，也为通过蛋白质工程改造糖基转移酶、创制活性天然产物奠定基础。
图 1 可催化苄基异喹啉生物碱糖基化的糖基转移酶筛选 (A) 两种策略筛选得到的候选 UGT 系统发育分析：(i) 黄连基因组挖掘；(ii) 已报道的底物杂泛型糖基转移酶。红色五角星代表选取开展生化功能表征的酶。 (B) 糖基转移酶以尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）为糖供体，催化药根碱发生 O - 糖基化反应示意图。 (C) 候选糖基转移酶催化药根碱糖基化反应产物的高效液相色谱（HPLC）分析结果。
图 2 UGT74AN1 对苄基异喹啉生物碱的底物杂泛性 (A) 供试苄基异喹啉生物碱底物的化学结构。 (B) 高效液相色谱分析测得 UGT74AN1 对不同苄基异喹啉生物碱底物的转化率。红色三角（Δ）代表经核磁共振（NMR）完成结构鉴定的产物；灰色代表某一糖基化位点产物的转化率，黄色代表另一糖基化位点产物的转化率。
图 3 UGT74AN1 的晶体结构与底物结合口袋。 (A) 分辨率 2.6 Å 下 UGT74AN1 的整体晶体结构，不对称单位中呈现同源二聚体。 (B) UGT74AN1 与尿苷二磷酸葡萄糖（UDPG）、药根碱（1）形成的三元复合物模型。 (C) 底物 1 与 UGT74AN1 之间的关键相互作用。 (D) 以 UDPG 为糖供体，分析 UGT74AN1 突变体对药根碱（1）的相对酶活。
图 4 借助蛋白质工程提升 UGT74AN1 的催化活性 (A) UGT74AN1 蛋白质工程研究路线。 (B) 构建 UGT74AN1/UDPG/ 底物 4 三元复合物结构模型；局部放大插图展示底物 4 与周边氨基酸残基的相互作用。 (C) 筛选得到的 22 个氨基酸位点的序列保守性分析结果。 (D) 丙氨酸扫描突变体对底物 4 的相对催化活性，并与野生型（WT）对比。 (E) T120、V384 位点饱和突变体以及双突变体 UGT74AN1<sup>M2</sup>对底物 4 的相对活性，并与野生型对比。 (F) 野生型与不同突变体催化底物 4 反应产物的高效液相色谱（HPLC）图谱。 (G) 野生型与双突变体 UGT74AN1<sup>M2</sup>的底物转化率。
图 5 突变体 UGT74AN1<sup>M2</sup>催化活性提升的结构机制 (A) 双突变体与 UDPG、底物 4 结合的结构模型，展示催化口袋内关键残基 F120 与 G384。 (B~C) 野生型（B）与 G384 突变体（C）底物结合口袋的表面示意图。 (D~E) 基于反应坐标 d (O−C1′)、a (O−C1′−O1′) 绘制的野生型酶复合物（D）与 UGT74AN1<sup>M2</sup>突变体酶复合物（E）自由能景观图（FELs）。 (F~G) 野生型（F）与 UGT74AN1<sup>M2</sup>（G）代表性催化构象的相互作用分析；相互作用分别以黄色虚线标示。
图 6 基于 iMARS 平台指导构建可原位再生 UDP 葡萄糖的融合酶，用于苄基异喹啉生物碱（BIA）的糖基化反应 (A) 以 UGT74AN1 催化底物 4 进行生物催化糖基化，体系偶联 AtSuSy 实现 UDP 葡萄糖（UDPG）再生。 (B) 筛选得到排名前 4 的优选融合酶。 (C) HPLC 色谱对比游离酶偶联体系（AtSuSy + UGT74AN1\(^\text{M2}\)）与改造融合酶（AtSuSy - 连接肽 - UGT74AN1\(^\text{M2}\)）对底物 4 的催化转化率。 (D) 融合酶 AtSuSy-L12-UGT74AN1\(^\text{M2}\)的三维结构。
图 7 化合物 1 及其糖基化产物 1b 的抗肿瘤活性评价 (A,B) 不同浓度化合物 1 或 1b 处理后 HCT116 细胞的活力检测结果。采用 CCK-8 实验分别检测药物处理 (A) 24 h、(B) 48 h 后 HCT116 细胞的活力。 (C) 使用 50 μM 化合物 1 或 1b 处理 HCT116 细胞 24 h 后，增殖细胞核抗原（PCNA）表达水平的代表性蛋白质免疫印迹（Western blot）结果；以 β- 微管蛋白（β-Tubulin）作为内参蛋白。 (D) 3 次独立重复实验中 PCNA 蛋白表达量的灰度定量分析，以 β-Tubulin 的表达水平进行归一化。 (E) 50 μM 化合物 1 或 1b 处理 HCT116 细胞 24 h 后，TUNEL 凋亡检测的代表性荧光显微图像（n=3）。绿色荧光代表 TUNEL 阳性凋亡细胞；采用 DAPI（蓝色）对细胞核进行复染。比例尺 = 50 μm。 (F,G) TUNEL 染色结果的凋亡定量统计：(F) TUNEL 阳性细胞占比；(G) TUNEL 信号的平均荧光强度（MFI）（n=3）。**P < 0.01；***P < 0.001。