文献分享--多种感染在转录水平重编程肠上皮及上皮-免疫细胞相互作用

作者，Evil Genius

AI 对科研最大的影响，不是简单地提高科研效率，而是正在改变科研人员的能力结构、竞争方式，以及科研成果的价值判断标准。它既可能让一个普通科研人员具备过去一个团队才拥有的能力，也可能让科研人员逐渐失去独立思考、发现问题和判断真伪的能力。

一、AI 对科研的主要好处

1. 大幅降低科研的技术门槛

过去，一个人要完成单细胞测序分析，需要熟悉 R、Python、统计学、细胞生物学和多种分析软件。现在，AI 可以辅助编写 Seurat、Scanpy、Monocle、MiloR 等分析代码，解释报错，设计分析流程。

好处：一个具备生物学知识、但编程能力一般的人，也有机会独立完成复杂的生物信息学分析。

2. 显著提高科研效率

AI 可以帮助检索和整理文献、总结研究进展、撰写论文初稿、整理参考文献、制作图表，以及分析复杂的数据结果。

原本需要数天甚至数周的部分工作，现在可能缩短到数小时。

好处：科研人员可以把更多精力放在科学问题、结果验证和机制解释上，而不是重复性劳动上。

3. 让个人具备跨学科研究能力

AI 可以协助生物学研究者学习结构生物学、分子动力学、统计建模和机器学习，也可以帮助计算研究者理解免疫学和分子机制。

例如，一个原本主要做单细胞转录组分析的人，可以进一步探索细胞通讯、转录调控、空间微环境，甚至结合蛋白结构预测和药物靶点分析。

好处：个人的研究边界被拓宽，过去需要多人协作才能开展的部分工作，现在一个人也可能完成。

4. 增加提出新假设的机会

AI 能帮助研究者发现不同文献之间的联系，提出候选通路、细胞亚群和潜在机制。

例如，在川崎病的公共 PBMC 单细胞数据中，可以进一步提出：治疗后哪些中性粒细胞状态下降？哪些细胞状态持续存在？这些状态与炎症通路和细胞间通讯有什么联系？

好处： AI 不只是帮助处理数据，还可能帮助研究者发现值得验证的新问题。

二、AI 对科研的主要弊端

这部分比效率提升更值得重视。

1. 容易产生虚假的科研能力

AI 可以生成代码、分析流程和看似专业的论文，但使用者未必真正理解这些内容。

例如，AI 给出一段单细胞差异分析代码，代码运行成功、图也很漂亮，却可能忽略样本间的批次效应、患者重复测量、细胞数量不平衡，甚至把细胞当作独立生物学重复。

危险在于：会运行代码，不等于会做科研。

2. 更容易产生错误结论

AI 可能把相关性说成因果关系，把细胞亚群标记基因误判为功能机制，或者把计算预测解释为已经得到实验验证的事实。

例如：

观察到某个细胞亚群比例下降，不一定意味着该细胞在患者体内真实减少。
发现某条通路富集，不一定证明这条通路驱动了疾病。
发现两个细胞群之间存在预测的通讯，不一定代表真实的配体---受体作用已经发生。

AI 能帮助解释结果，但不能替代证据本身。

3. 可能削弱独立思考能力

如果每一个问题都直接询问 AI，久而久之，研究者可能不再主动推导分析方案，也不再怀疑结果是否合理。

更深层的问题是：当 AI 给出一个错误但逻辑完整的解释时，使用者可能缺乏识别错误的能力。

真正的科研能力，不只是找到答案，而是知道什么答案不可信。

4. 论文数量增加，但创新性未必提高

AI 降低了论文写作和数据分析的成本，更多人可以快速完成一套分析流程。

但如果大家都使用类似的提示词、公共数据集、分析工具和常见通路，最终可能出现大量结构相似、结论相近的论文。

结果可能是：论文数量增加，真正具有原创性和解释力的研究却没有同比增加。

5. 科研竞争可能更加激烈

当大多数人都能借助 AI 编写代码、润色英文、制作图表时，这些技能本身的竞争优势就会逐渐下降。

过去，能够熟练掌握分析软件的人可能就具备优势；未来，真正拉开差距的可能是研究问题是否重要、设计是否严谨、结论是否可信，以及能否提出别人没有想到的解释。

AI与科研

科研工作	AI 的影响趋势	人的核心价值
文献初筛与总结	自动化程度提高	判断证据质量与研究空白
常规数据分析代码	自动化程度提高	设计正确的统计方案
常规图表制作	自动化程度提高	判断图表是否准确表达结果
论文英文润色	自动化程度提高	保证科学内容真实严谨
细胞亚群注释	AI 辅助增强	结合生物学知识综合判断
科学假设提出	AI 辅助增强	判断假设的重要性与可验证性
关键实验设计与解释	部分辅助	识别混杂因素，验证因果关系
学术创新与研究方向选择	难以完全自动化	形成独立判断和原创思想

注意：AI 已经能够参与相当复杂的研究设计和假设生成，因此不能简单认为创新永远是人类独有的能力。更合理的判断是，研究者必须能够评估 AI 的输出，并对研究结论负责。

结合生物信息学科研，未来什么能力最值钱？

第一层：生物学理解

能否判断一个中性粒细胞亚群究竟代表成熟状态、炎症激活、应激状态，还是技术噪声？能否区分标记基因、功能状态和真正的致病机制？

这是防止 AI 给出错误注释的基础。

第二层：统计学与研究设计

能否识别伪重复、批次效应、样本混杂和多重检验问题？能否判断某种分析是否真正回答了研究问题？

这决定研究结果是否可信。

第三层：整合研究能力

能否把细胞组成、亚群状态、差异通路、细胞通讯、轨迹分析以及临床背景组织成一个逻辑一致的研究故事？

例如，不能只是分别展示中性粒细胞、T 细胞和 B 细胞的变化，而要分析这些变化之间是否存在相互支持的证据。

第四层：提出别人没有解决的问题

当常规分析都能被 AI 辅助完成时，研究问题本身就更加重要。

同样使用公共数据，有人只做常规聚类和差异分析；有人却能发现一个值得进一步验证的免疫状态变化，并提出明确、可检验的机制假设。两者的科研价值可能有明显差距。

AI 时代，普通科研人员应该怎样做？

让 AI 负责提高执行效率，自己负责判断研究方向和结果是否成立。

具体做法

先提出自己的问题，再让 AI 帮忙。不要直接要求 AI 生成整套分析，而是先明确研究目的、比较组别和核心假设。

要求 AI 解释分析方法的适用条件。不只询问代码，还要了解为什么使用这种方法、有哪些假设、什么情况下会失效。

对重要结果进行独立验证。细胞注释结合多个标记基因、差异表达和已知生物学；统计结论考虑患者层面的重复；关键机制尽可能用独立数据或实验验证。

把 AI 当作质疑者，而不是只让它支持自己的观点。可以要求它列出替代解释、潜在混杂因素和反驳当前结论的证据。

保留可复现的研究记录。保存数据来源、分析代码、软件版本、参数、筛选标准以及结果生成过程，避免无法复现的分析。

简单总结一下AI的价值

两种情况的差异，不在于谁使用了 AI，而在于谁真正理解自己正在做什么。

如果把科研比作一场竞赛，AI 正在降低完成标准化任务的门槛，却可能进一步抬高原创性研究的门槛。

未来，单纯掌握软件操作、会跑常规流程、会写论文的人，优势可能逐渐减弱；而能够提出好问题、设计可靠分析、识别错误并建立可信科学解释的人，会更善于利用 AI。

科研真正稀缺的，不再只是完成工作的能力，而是判断什么工作值得做，以及如何证明所得结论是真的。

今日参考文献

摘要

远端小肠通过调节营养和液体稳态在宿主生理中发挥重要作用。尽管在克罗恩病中受到影响，并作为一系列感染的主要靶标，我们对感染期间回肠细胞反应复杂性和细胞-细胞通讯知之甚少。

GutPath ，一个包含超过500,000个单细胞 、具有RNA和蛋白质表达谱的图谱，涵盖回肠中91种细胞状态，跨越多种感染原型。
显示GutPath准确捕获了已建立的感染免疫反应，同时揭示了肠上皮细胞中的病原体特异性反应。
为突出图谱的发现潜力，识别出一种在假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis）感染 期间存在的新肠上皮细胞转录状态，该状态在空间上与细菌载量和组织病理学相关联。
GutPath为免疫学界建立了一个急需的资源，将加速小肠细胞景观中转录多样性的研究。

引言

1. 小肠的生理与免疫挑战

小肠构成巨大表面积，负责执行必要的消化功能，同时应对一系列免疫挑战，包括对食物来源抗原的耐受、对共生菌反应的调节以及感知和限制感染。
为满足这些生理和免疫需求，小肠进化出复杂的细胞环境，具有数十种不同细胞类型和独特的代谢和免疫生态位。
回肠与其他肠道部分不同，作为维生素B12和胆汁酸吸收的主要部位，在营养和液体平衡中发挥关键作用，并高效吸收脂溶性维生素（A、D、E、K）、水、钠和氯。
回肠上皮调节营养运输并作为对抗感染的物理屏障，包括吸收性肠上皮细胞、杯状细胞及其分泌的黏蛋白、Paneth细胞、tuft细胞和其他特化群体，共同维持肠道稳态。
肠道上皮细胞多样性在小肠和结肠之间、小肠不同解剖区域之间，甚至在绒毛等微解剖结构内也有所不同。
位于绒毛隐窝的肠道干细胞产生新生的吸收性肠上皮细胞，产生抗菌肽。随着这些细胞成熟并向绒毛尖端推进，严格调控的转录程序改变其执行营养运输的功能能力。
在上皮层之间和下方的固有层（LP）中，存在多种免疫细胞，协调免疫耐受和病原体防御。
最后，基质群体和肠神经系统对组织架构、细胞-细胞通讯和肠道生理至关重要，进一步促进小肠细胞异质性。

2. 回肠感染与炎症的后果

由于回肠在营养和液体平衡中的重要作用，该组织的感染和炎症可导致宿主生理的重大紊乱。
例如，在克罗恩病患者中，回肠是胃肠道常受影响的部位，三分之一患者仅表现为回肠炎症------这与维生素B12和胆汁酸吸收不良相关。
回肠也是病原体感染的常见靶标，可产生深远后果，从腹泻和生长迟缓到死亡。
原生动物寄生虫**隐孢子虫（Cryptosporidium）**感染回肠，是全球儿童腹泻死亡和生长迟缓的主要原因。
细菌病原体，包括沙门氏菌、志贺氏菌、弯曲杆菌、李斯特菌、耶尔森菌和一些致病性大肠杆菌，通过回肠中丰富的Peyer's斑块进入。
同样，许多蠕虫寄生虫在回肠建立感染，在全球范围内造成重大发病率。
尽管回肠在宿主生物学和防御中具有复杂和多方面的作用，但相对较少努力致力于该组织的单细胞分析。
专注于小肠感染（包括沙门氏菌、星状病毒和隐孢子虫感染）的研究增进了我们对肠道组织特异性免疫如何调节的理解；然而，这些研究通常限于一种或少数细胞类型，使其发现难以外推或与其他感染比较。
因此，需要跨广泛病原体门的大规模单细胞研究来 interrogate 小肠，以捕获不同生物如何改变细胞异质性以及病原体特异性免疫如何通过转录调控协调。

3. 单细胞技术的进展与局限

单细胞技术（包括scRNA-seq）的发展，捕获转录组、蛋白质组和表观遗传数据，扩展了我们对黏膜免疫学的理解。
最近肠道scRNA-seq研究导致发现新细胞状态，包括新识别的肠内分泌细胞亚群和结肠炎期间结肠肠道干细胞的炎症相关变化。
迄今为止，肠道scRNA-seq研究通常深度 profiling 特定细胞群体或 catalog 人类或小鼠的稳态和发育条件。
密集的研究努力集中在大肠，因为溃疡性结肠炎和结肠癌驱动兴趣，活检标本容易从人类参与者获得，且炎症小鼠模型常规使用。
尽管这些研究的数据捕获稳态和各种疾病期间的胃肠生物学，但感染诱导的免疫过程在数据中代表性不足。
因此，我们需要理解免疫反应如何针对不同类别的病原体定制。

4. 本研究目标

为填补这一关键知识空白，创建GutPath （https://gutpath.org），一个回肠单细胞转录组和蛋白质组图谱，通过CITE-seq构建，跨越一系列病毒、细菌、真菌、原生动物和蠕虫小鼠感染和定植模型。
该资源包含来自回肠和回肠引流肠系膜淋巴结（MLN）的超过500,000个细胞。
回肠中总共91个注释细胞状态 和MLN中49个细胞状态，组织成多层参考注释，从广泛细胞谱系到精细细胞状态。
证明GutPath准确捕获影响远端小肠的六种模型病原体的急性感染生物学。
此外，识别病原体特异性反应，包括在巴西日圆线虫（Nippostrongylus brasiliensis） 和假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis） 感染期间出现的独特肠上皮细胞转录反应和细胞-细胞信号程序。
最后，使用空间分辨单细胞转录组学，说明独特肠上皮细胞反应在感染期间局部、区域性和整个组织中发展。

结果

结果1、创建小肠对多种微生物反应的单细胞图谱

微生物选择：

聚焦感染、定植或影响小肠的微生物，同时从不同门采样多种物种：
- 分节丝状菌（SFB）（Candidatus savagella spp.，革兰氏阳性共生细菌）
- 假结核耶尔森菌（Y. pseudotuberculosis）（革兰氏阴性细菌）
- 巴西日圆线虫（N. brasiliensis）（寄生蠕虫）
- 白色念珠菌（Candida albicans）（机会性真菌病原体）
- 微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）（顶复门寄生虫）
- 鼠诺如病毒（MNV）CR6株（杯状病毒科正链单链RNA病毒）
所有生物口服给药，除了皮下注射的Nippostrongylus第三期（L3）幼虫。
在感染第一周收集组织用于测序和感染确认。

CITE-seq profiling：

同时 profiling MLN、小肠LP和小肠IEC的单细胞RNA和约100种表面蛋白，每种条件至少两只重复小鼠。
Nippostrongylus主要局限于近端小肠，因此还从感染小鼠收集十二指肠LP和IEC样本以捕获原发感染部位。

数据质量：

跨MLN、IEC和LP组分，每个细胞的平均读数超过30,000（mRNA）和8,000（抗体衍生标签，ADTs）。
质量控制后，保留505,956个高质量细胞 ，随后按组织类型分离用于下游分析：MLN中184,973个 ，回肠中320,983个。
MLN中平均每个细胞5,867个UMI转录本和2,258个基因；回肠中平均6,398个转录本和2,186个基因。
每种条件跨组织收集40,000至100,000个细胞。

细胞类型注释：

mRNA和ADT数据独立整合，通过加权最近邻分析结合。
使用自动化方法辅以手动 curation 分类细胞类型，并通过基因和蛋白质表达谱验证。
如预期，MLN组分主要由B细胞、T细胞和先天淋巴细胞（ILC）群体组成（合计占MLN细胞的95%）。
上皮细胞占IEC组分的80%，进一步消化小肠以分离LP组分产生额外的上皮群体，特别是Paneth细胞、干细胞和 transit-amplifying 细胞。
与IEC组分相比，LP富集间充质和内皮细胞、肠神经系统细胞和B细胞。
观察到LP组分中感染特异性细胞组成改变：Yersinia诱导中性粒细胞扩张 ，而Nippostrongylus感染导致tuft细胞和ILCs扩张。
ADT面板靶向的大多数蛋白质与其相应基因的表达高度或中度相关。

高分辨率细胞注释：

使用现有资源和广泛手动注释为图谱生成高度解析的细胞标签，在MLN中定义49个 和回肠中91个独立转录细胞状态。
识别肠上皮细胞分化的早期、中期和晚期阶段，以及Yersinia感染小鼠中的独特肠上皮细胞状态（称为Yps肠上皮细胞 ）或Nippostrongylus（Pla2g4c肠上皮细胞）。
在Yersinia感染的肠道中，还观察到炎症性trophocytes群体（Pdgfra^low，表达Il6、Ccl2和Cxcl1），先前报道支持肠道干细胞并调节其分化。
图谱还捕获了几种罕见细胞类型，包括telocytes（Pdgfra^high）协调肠道干细胞Wnt信号和分化、pericytes（Cspg4和Pdgfrb）稳定血管并支持血流、enterochromaffin细胞（Lmx1a）产生血清素，以及Cajal间质细胞（Kit）作为肠道运动'起搏器'。

资源价值：

GutPath中转录状态的详细注释构成宝贵资源，可用于黏膜研究中的标签转移，加速该领域scRNA-seq数据分析。
为使这些细胞描述对研究人员可访问，使用差异表达方法为粗略、中间和精细细胞状态注释生成完整标记谱。
此外，使用随机森林分析为每个注释级别的每个细胞状态创建 condensed 标记谱。

结果2、GutPath捕获模型感染的免疫标志

差异丰度测试：

使用细胞'邻域'（由k最近邻定义）的差异丰度测试检查细胞群体的差异丰度和相对于naive样本的转录异质性。
Nippostrongylus感染中富含tuft细胞和杯状细胞的差异丰度邻域富集，但在其他感染中不富集，与蠕虫感染的tuft和杯状细胞增生特征一致。
Yersinia感染样本中观察到差异丰度邻域和髓系群体频率增加，快速招募单核细胞、中性粒细胞和其他髓系效应细胞是许多细菌感染模型（包括Y. pseudotuberculosis感染）的主要特征。
Cryptosporidium感染引发干扰素-γ（IFNγ）信号和IFNγ依赖性免疫，在Cryptosporidium和Yersinia感染样本中观察到NK细胞和NKT细胞中Ifng表达增加，以及来自这两种感染小鼠的细胞中Hallmark IFNγ信号基因集的富集增加。
在MLN中也观察到该通路的强富集。

结果3、感染期间肠上皮细胞溶质运输潜力被破坏

肠上皮细胞分化轨迹：

重新聚类来自所有条件的干细胞、 transit-amplifying 细胞和肠上皮细胞群体，并应用伪时间分析以捕获小肠绒毛中肠上皮细胞分化的轨迹。
在伪时间上，细胞从隐窝（干细胞）通过 transit-amplifying 细胞进展到成熟肠上皮细胞，最终到达绒毛尖端。
所有条件的细胞沿伪时间分布不同，反映了感染对肠上皮细胞分化的影响。

溶质转运蛋白基因：

在伪时间分析中识别82个溶质转运蛋白（Slc）基因，从隐窝到绒毛尖端呈现高度结构化的表达模式。
其中29个在一种或多种感染中失调。
例如，Slc12a2（隐窝）、Slc26a3（中绒毛）和Slc5a12（尖端）显示出 distinct 的空间表达模式。
Yersinia感染导致肠上皮细胞中差异表达基因数量最多，包括许多溶质转运蛋白基因的下调。
在感染期间观察到多个Slc基因的失调，包括Slc40a1（铁转运蛋白）在多种感染中上调。

病原体特异性反应：

不同感染导致肠上皮细胞中 distinct 的溶质转运蛋白基因表达模式。
Nippostrongylus感染导致肠上皮细胞中与脂肪酸加工相关的基因表达增加，表明与蠕虫感染相关的独特表型。
Yersinia感染导致肠上皮细胞中更多时间调控的DEGs，提示Yersinia可能产生独特的肠上皮细胞转录状态。

结果4、Nippostrongylus感染期间肠上皮细胞的代谢重编程

代谢任务分析：

使用scCellie代谢任务评分分析肠上皮细胞的代谢活动。
Nippostrongylus感染小鼠的肠上皮细胞表现出最显著的代谢任务改变，特别是脂质代谢通路。
这些改变包括次级胆汁酸合成减少和脂肪酸（如elaidate、linoleate、palmitate和arachidonate）代谢改变。
与脂肪酸加工任务相关的基因表达在Nippostrongylus感染中相比所有其他条件增加，表明与蠕虫感染相关的独特表型。

细胞类型特异性：

选定脂肪酸相关任务的活性评分中位数差异在肠上皮细胞中最高（无论其成熟度），以及在杯状细胞中。
使用细胞-细胞通讯分析识别可能驱动这种代谢失调的信号事件。
与naive小鼠的肠上皮细胞相比，Nippostrongylus感染小鼠的肠上皮细胞被预测接收IL-4和IL-13信号，如Th2主导免疫反应中所预期。
这些Th2细胞因子驱动肠道干细胞中tuft细胞和杯状细胞扩张，但其对吸收性肠上皮细胞功能能力和信号的影响尚不清楚。
Nippostrongylus感染小鼠的肠上皮细胞还被预测产生naive小鼠中不存在的独特配体用于细胞-细胞相互作用，包括FGF家族配体。
FGF和CX3C家族配体编码基因，特别是Fgf15和Cx3cl1，由肠上皮细胞产生，并被推断作用于其他细胞群体。
CX3CL1以其对肥大细胞的趋化能力而闻名，而FGF15是胆汁酸和胆固醇代谢的关键调节因子。

验证：

将观察到的Nippostrongylus感染体内肠上皮细胞反应与公开可用的IL-4刺激肠类器官RNA-seq数据集进行比较。
在Nippostrongylus感染小鼠肠上皮细胞中单细胞水平诱导的基因也被IL-4在肠类器官中上调，包括Pla2g4c。
使用基于质谱的代谢组学分析确认这些发现：
- Nippostrongylus感染期间回肠腔内容物显示胆汁酸水平改变，最显著的减少在胆酸、鹅脱氧胆酸和β-鼠胆酸初级胆汁酸中，与FGF15的活跃产生和信号一致。
- 上皮刮取物（而非腔内容物）在Nippostrongylus感染小鼠中显示脂肪酸水平升高，相比naive对照，表明肠道上皮的功能变化（而非微生物群驱动的代谢变化）导致此表型。
- 脂肪酸积累在蠕虫负荷更大的小鼠中更明显，将病原体载量与小肠代谢紊乱联系起来。
总之，这些数据表明Nippostrongylus感染重编程回肠IEC代谢，且Th2细胞因子可能对吸收性肠上皮细胞产生尚未探索的 distinct 效应。

结果5、Yersinia感染刺激肠上皮细胞中独特的促炎程序

Yps肠上皮细胞的识别：

检查每种感染产生肠上皮细胞相似聚类模式的程度，测量为缩放的不平衡（imbalance）。
不平衡测量嵌入的k最近邻中跨条件预期细胞分布的局部偏差，指示来自一种条件的细胞优先丰富的区域。
分析显示Yersinia（而非其他感染）导致肠上皮细胞聚类不平衡，提示Yersinia可能产生独特的肠上皮细胞转录状态。
应用tradeSeq确定沿肠上皮细胞伪时间相对于naive动物的差异表达，发现Yersinia引发的 temporally 调控DEGs比所有其他感染总和还多。
Yersinia DEGs的层次聚类识别出一组基因，其表达在naive动物中肠上皮细胞伪时间早期通常较高，但被Yersinia感染改变模式------表现出延长的 temporal 表达或 later 在肠上皮细胞伪时间中重新激活。
这些基因的表达富集在较高不平衡区域，对应于成熟肠上皮细胞的 distinct Yersinia驱动聚类。
将这些细胞称为Yps肠上皮细胞，因其起源于Y. pseudotuberculosis感染。
Yps肠上皮细胞仅代表Yersinia感染小鼠中所有肠上皮细胞的一个子集。为识别独特定义该子集的基因，将Yps肠上皮细胞与Yersinia感染期间所有其他肠上皮细胞比较，产生132个Yps肠上皮细胞相关基因。
其中，Saa1和Saa2（编码急性期蛋白的基因）先前显示在沙门氏菌感染和SFB定植期间上皮细胞中上调。
其他基因，包括Nos2和Reg3a，编码被认为直接限制细菌存活和复制的效应物。
Yps肠上皮细胞基因显著与免疫防御本体术语相关，进一步表明这一独特细胞状态可能代表肠上皮细胞对免疫刺激的直接适应。

上游因子和信号：

使用定义Yps肠上皮细胞表型的132个基因进行转录因子 motif 富集分析。
识别SREBF1 （标准化富集评分NES=4.69），脂肪酸合成调节因子，以及STAT3（NES=3.30），许多细胞因子信号级联的下游效应物。
比较Yersinia感染和naive小鼠中肠上皮细胞亚群的STAT3靶基因表达，揭示STAT3特征对Yps肠上皮细胞特异。
Yps肠上皮细胞与Yersinia感染小鼠中其他成熟肠上皮细胞的分离具有有趣的意义，可能反映空间限制的细菌信号或免疫信号。

结果6、Yersinia感染期间空间定位的炎症重塑回肠上皮

空间转录组学：

Y. pseudotuberculosis感染导致小肠中称为pyogranulomas（PGs） 的宏观、密集炎症细胞灶。
PGs相对于周围组织高度富含Yersinia，并积累中性粒细胞和单核细胞，通过TNF和IL-1产生促进宿主防御。
为研究Yps肠上皮细胞与PG形成之间的关系，对naive和Yersinia感染小鼠的小肠进行空间转录组 profiling。
使用Proseg进行细胞分割和质量控制过滤，在naive和Yersinia感染小鼠各两个生物学重复中获得680,410个细胞。
使用5,000个基因探针面板，平均每个细胞566个读数，每个样本126,422-207,476个细胞。
使用GutPath指导此数据的注释，观察到Yersinia感染小鼠肠上皮细胞区室中指示细胞状态变化的差异聚类。

空间验证：

首先询问基于图谱中肠上皮细胞伪时间分析预测的特定溶质转运蛋白的局部表达是否在naive和感染回肠切片的原位中重现。
例如，隐窝特异性标记基因Lgr5和Mki67以及绒毛尖端标记基因Ada分别在伪时间开始和结束时差异表达，空间转录组学确认了这一点。
还观察到许多溶质转运蛋白基因沿伪时间轴具有 distinct 表达模式，提示在隐窝或沿绒毛的局部表达。
原位探索这些基因确认了Slc12a2的隐窝定位，以及Slc26a3和Slc5a12分别在中绒毛和尖端的定位。
最后，scRNA-seq数据突出Slc40a1作为感染期间调节的溶质转运蛋白，这在Yersinia感染小鼠的空间转录组数据中得到确认。
总之，这些结果在空间转录组中 robustly 验证了scRNA-seq伪时间结果。

Yps肠上皮细胞与PG的空间关系：

组织学识别推定的PGs，并通过计算'展开'小肠Swiss rolls的等部分，沿线性化回肠创建细胞的近端到远端放置。
这将基因的空间定位减少到一段小肠长度的简单线性距离，包括两个 distinct PGs。
Il1a和Tnf（已知在PGs中表达的基因）在PGs附近富集，相比naive对照。
应用GutPath的细胞注释到空间数据，观察到PG位置髓系细胞富集峰值。
推断如果数据中识别的Yps肠上皮细胞表型由细菌信号驱动，则定义这些肠上皮细胞的标记基因可能定位到细菌载量最高的PGs。
将132基因Yps肠上皮细胞特征与空间转录组 assay 中使用的5,000基因面板交叉参考，识别53个基因，然后用于测试Yps肠上皮细胞特征的空间定位富集。
观察到统计显著的Yps肠上皮细胞相关表达峰值精确重叠组织学确认的PGs。

细胞-细胞信号事件：

聚焦单个PG和相邻组织以及非PG区域，然后分别预测这两个区域内的细胞-细胞通讯。
识别PGs最近组织中富集的配体，包括IL-1家族成员IL-18及其受体。
更仔细的检查显示，与相邻组织相比，PG内Il18表达大大降低，而编码IL-18受体组分的Il18rap在对应于PG的区域显示峰值表达。
这些发现提示肠上皮细胞衍生的IL-18可能信号到PG内的炎症细胞。
细胞-细胞通讯分析预测早期肠上皮细胞是IL-18的主要产生者，可信号到NK和NKT细胞，以及ILCs和ILC3s。
这一结果与Yps肠上皮细胞中STAT3驱动程序的观察相结合，促使询问IL-22（一种STAT3激活细胞因子，具有多效性效应，如诱导肠上皮细胞产生IL-18）的表达是否在PGs增加。
发现Il22表达在PG位点峰值，从而暗示IL-22/STAT3/IL-18信号轴在肠道Yersinia感染部位肠上皮细胞的反应中。

基因表达的空间模式：

尽管Yps肠上皮细胞相关基因表达在PGs内峰值，但相对于naive对照，在远离PGs的组织中仍保持升高，提示单个肠上皮细胞基因的表达在感染期间可能空间变化。
聚焦跨越第二个PG并包括相邻组织的区域，可视化53个Yps肠上皮细胞基因中每一个在该区域的表达热图。
分析显示大多数这些基因------包括Hif1a、Nos2和整合素Itgav和Itgb2------在位于PG正上方的肠上皮细胞中具有高度限制性表达。
然而，Saa1表达在整个检查区域相对于naive对照保持升高，并在感染期间整个回肠的肠上皮细胞中诱导。
使用更广泛的方法可视化Yersinia感染期间空间调控的基因转录模式，仅使用Xenium数据重新计算Yersinia感染小鼠所有肠上皮细胞中相对于naive对照的差异基因表达。
识别350个在Yersinia感染小鼠肠上皮细胞中上调的基因，并检查这些基因在PG周围区域的表达模式。
一些先前未识别的基因，包括Mboat1和Slc16a3，在PG的肠上皮细胞中特异性富集。
其他基因，如Stat1和Stat3，在Yersinia感染期间肠上皮细胞中广泛升高，但在PG区域峰值。
最后，分析揭示许多基因------包括编码ferropontin的Slc40a1------在Yersinia感染小鼠的所有肠上皮细胞中富集，除了PG周围的那些。
因此，这种感染诱导的重叠和 distinct 基因表达模式可能影响局部免疫细胞功能。
这些数据识别了一种Y. pseudotuberculosis相关肠上皮细胞表型，在空间上与PGs形成相关联，效应远远超出感染部位。

直接感染 vs 间接信号：

鉴于Yps肠上皮细胞与PGs的接近性，因此与Yersinia灶的接近性，这些细胞可能直接受细菌感知或间接受感染期间免疫细胞产生的细胞因子和其他分泌因子的影响。
Y. pseudotuberculosis主要是胞外的，因此假设Yps肠上皮细胞表型并非源于Yersinia对肠上皮细胞的直接感染。
使用Stereo-seq空间转录组分析（profiling 宿主和微生物RNA），发现Yersinia转录本定位到PG的基底区域，并未延伸到覆盖PG的肠上皮细胞。
此外，Nos2表达（可能在肠上皮细胞中诱导，包括PG周围的那些）与Yersinia转录本不重叠。
相反，发现Il22表达高度限制于PG，且启动子中含有STAT3 motif的基因在Yersinia感染期间肠上皮细胞中显示升高表达，提示免疫细胞募集和细胞因子分泌在塑造PG附近肠上皮细胞表型中具有主导作用。
与此概念一致，肠上皮细胞中Stat1表达在PG处升高，Stat3表达在Yersinia感染期间广泛上调。
由于这些转录因子的激活由磷酸化触发，对Yersinia感染和naive回肠切片进行phospho-STAT1和phospho-STAT3免疫组化染色。
与单细胞数据一致，观察到Yersinia感染期间STAT1激活，特别是在PGs处，包括上皮细胞，但在naive样本中未观察到。
相反，STAT3在Yersinia感染期间在整个组织中更广泛激活，再次反映scRNA-seq数据中Stat3的模式。
总之，Y. pseudotuberculosis感染显著改变肠上皮细胞的转录状态。IL-22可能与其他信号协同作用，以空间限制方式影响肠上皮细胞。然而，其他信号显然参与并能在肠道大片区域 robustly 调节肠上皮细胞基因表达。局部 vs 区域表达模式如何被调控及其在产生保护性 vs 致病性反应中的相对重要性仍是进一步研究的重要问题。

讨论

主要贡献

小肠感染是全球营养不良、生长迟缓和死亡的主要原因。
利用肠道病原体和实验感染，创建GutPath，一个包含来自回肠的超过300,000个单细胞（91种细胞状态）和来自回肠引流MLN的近200,000个细胞（49种细胞状态）的RNA和蛋白质数据的资源，跨越六种不同感染和naive对照。
代表对真菌、细菌、寄生蠕虫、原生动物和病毒的反应，从而捕获跨越Th1、Th2和Th17主导免疫原型的多样免疫状态，profiling 所有主要细胞群体和许多罕见细胞类型。
GutPath的广度和深度允许研究人员询问关于回肠生物学保守模式的新问题，将新的和现有的黏膜数据集情境化，并更好地解释其他感染性或炎症性疾病中的黏膜免疫反应。

细胞注释资源

高效分析新单细胞数据集的主要障碍是准确和详细的细胞注释，特别是在高度动态和复杂的组织如肠道中。
尽管存在多种资源辅助此过程，但它们不反映多样的免疫细胞激活状态，特别是感染引发的那些，因此需要研究人员进行艰巨的手动注释工作。
GutPath通过提供多层细胞状态注释解决此问题，从广泛细胞谱系到高度特异性细胞表型，每个都伴随标记谱。
除所有原始测序数据和代码公开可访问外，GutPath中包含的不同细胞类型和各种病原体模型系统中的基因表达可通过CELLXGENE Visualization In Plugin（VIP）在Web浏览器中直接查询，网址为https://gutpath.org。
该图谱为利用快速进化的大语言模型探索复杂细胞数据提供了基础。此类方法简化分析工作流程，大幅提高研究效率，同时加速高分辨率数据集转化为可操作的见解。

局限性

GutPath捕获急性感染诱导的广泛细胞异质性；然而，它有几个局限性。
尽管时间点选择与感染峰值重合，但每种感染如何建立和进展的差异，以及适应性免疫组分如何被招募和激活，无法在没有沿感染时程进一步采样的情况下完全解释。
尽管感染剂量在该领域是标准的，但可以进一步研究工作剂量对小肠免疫反应的影响。这尤其相关，因为揭示了Nippostrongylus感染期间蠕虫负荷与脂肪酸水平之间的关联。
一些细胞类型，特别是嗜酸性粒细胞和中性粒细胞，更脆弱，可能需要方法学调整以改善其在scRNA-seq数据集中的代表性。
还注意到，尽管设计差异测试以限制细胞数量差异引起的偏差，但数据中对上皮细胞的偏差可能增强了该群体中DEG检测的统计功效。

肠上皮细胞生物学

GutPath是理解肠上皮细胞生物学的丰富资源，特别是因为样本制备产生了肠上皮细胞的完整发育'寿命'，从隐窝驻留干细胞和 transit-amplifying 细胞到沿绒毛长度和尖端存在的成熟吸收性肠上皮细胞。
这允许使用基于伪时间的轨迹分析将转录本分配到肠上皮细胞的精确发育阶段，揭示从隐窝到绒毛尖端的82个溶质转运蛋白的高度结构化表达模式，其中29个在一种或多种感染中失调。
克罗恩病患者和感染期间肠上皮的破坏可导致广泛的吸收不良表型，但 underlying 分子机制知之甚少。本研究中观察到的溶质转运蛋白失调构成病原体破坏回肠生物学的潜在分子机制，值得进一步研究。
除肠上皮细胞外，GutPath捕获散布在上皮层内以及下方LP和引流MLN中的免疫细胞，从而使研究人员能够预测免疫细胞之间或免疫与基质细胞之间的细胞-细胞通讯。
这通过识别Yersinia感染诱导的独特肠上皮细胞表型来说明，数据提示这可能由IL-22/STAT3信号驱动产生IL-18------一种然后通过IL-18受体辅助蛋白（IL-18RAP）信号到PG内ILCs、NK细胞和NKT细胞的细胞因子。

空间与区域效应

还探索了黏膜免疫反应如何受组织病理学和病原体载量接近性的影响。
对Y. pseudotuberculosis的实验揭示，一些肠上皮细胞转录状态精确与组织病理学共定位，而其他则更区域化，发现在PGs附近甚至分布在整个组织中。
类似地，对Nippostrongylus的实验（在近端小肠建立感染）显示远端小肠上皮的显著代谢重编程。
总之，这些结果揭示基因表达的涟漪效应，可以从病原体载量和病理学最高的区域发出，提示即使高度局灶性或良好控制的感染仍可能影响远离损伤部位的肠上皮细胞行为。
由于实验仅覆盖每种感染的单个早期时间点，尚不清楚这些转录程序在多大程度上持续以及它们如何影响效应或记忆T细胞反应的发展。
尽管如此，这一发现不仅对胃肠道感染具有重要意义，而且对炎症性疾病如克罗恩病也具有重要意义，其中肠道病变的发展是疾病发病机制的关键组成部分。
空间数据提供与组织病理学最密切相关的基因及其在组织中相对定位的详细视图。这些基因应作为治疗靶点以及组织重塑和细菌控制的驱动因素进行研究。

SAA1的广泛表达

尽管免疫细胞浸润和促炎基因表达在Yersinia感染小鼠的PGs周围集中，但观察到Saa1、Stat3、Slc40a1和许多其他基因在整个远端小肠的肠上皮细胞中广泛表达。
SAA1已知由IL-1家族成员和TNF诱导，具有直接抗菌特性以及促进伤口愈合期间IEC迁移。然而，SAA1还可以通过产生致病性Th17细胞促进促炎反应，并与克罗恩病患者活动性炎症部位相关。
最近，Saa1和Saa2被显示定义独特的牙邻上皮，其中细胞与口腔微生物持续接触。
PGs周围促炎细胞因子诱导的高度局灶性可能足以引发下游靶点的组织范围表达。相反，可能存在肠上皮细胞长距离传播炎症信号的机制。
delineating 炎症信号事件如何随时间和空间展开以调节肠上皮细胞基因表达，对于识别胃肠道疾病的新治疗机会具有重要意义。

方法

单细胞数据分析

数据预处理和整合：使用Cell Ranger与小鼠基因组GRCm39生成原始和过滤特征-条形码矩阵。矩阵导入R使用Seurat，进行主要过滤：RNA和ADT文库大小在各自中位数±2.5中位数绝对偏差内；>750个检测基因；MLN样本线粒体RNA含量<5%，回肠样本<20%。ADT计数使用DSB方法归一化。
RNA和ADT数据独立处理、整合和可视化。标准可变特征识别（n=3,000）、归一化和缩放。独立样本使用Harmony整合，使用Louvain和Leiden聚类（Monocle3 v1.3.1）。RNA和ADT模态通过加权最近邻分析纳入进一步聚类和可视化。
使用自动化细胞类型注释（SingleR）和手动 curation，通过基因和蛋白质表达验证。
差异丰度测试使用milR（quasi-likelihood F检验）在细胞邻域上进行。
基因集富集分析使用escape和UCell。
代谢任务评分使用scCellie。
伪时间分析使用tradeSeq（广义加性模型，Wald检验）。
转录因子 motif 富集使用RcisTarget。
细胞-细胞通讯分析使用CellChat。
空间转录组数据分析使用Xenium Ranger和Stereo-seq Analysis Workflow。
脂肪酸和胆汁酸测量使用质谱。