Transcription factor PagMYB31 positively regulates cambium activity and negatively regulates xylem development in poplar
转录因子PagMYB31正向调控杨树84K品种的形成层活动，并负向调控木质部的发育。
同样有篇文献，二倍体毛白杨基因组~
二倍体毛白杨（Populus tomentosa Carr.）基因组-春天都是杨树毛子？？？-文献精读-11
摘要
木材的形成涉及一系列连续的发育步骤，包括维管形成层的细胞分裂、木质部细胞扩展、次生细胞壁（SCW）沉积和程序性细胞死亡。在本研究中，我们鉴定了PagMYB31作为调节这些过程的协调者在银白杨（Populus alba × Populus glandulosa）中的作用，并构建了一个由PagMYB31介导的转录调控网络。PagMYB31突变导致形成层细胞层数减少、梭形始端细胞、射线始端细胞、导管、纤维和射线细胞变大，并且增强了木质部细胞次生细胞壁的增厚，表明PagMYB31正向调控形成层细胞增殖，负向调控木质部细胞扩展和次生细胞壁生物合成。PagMYB31通过直接抑制细胞壁修饰酶基因和激活整个次生细胞壁生物合成程序的转录因子基因，分别抑制了木质部细胞的扩展和次生细胞壁的增厚。在形成层中，PagMYB31通过直接调控CLAVATA3/ESR-RELATED（CLE）基因，可能通过导管元素分化抑制因子（TDIF）/木质部与韧皮部相间（PXY）信号通路促进形成层活性，并且它还可以直接激活WUSCHEL HOMEOBOX RELATED4（PagWOX4），形成正向调控。此外，我们还观察到PagMYB31可以通过MYB31-MYB72-WOX4模块促进细胞增殖，或通过MYB31-MYB72-维管形成层相关MADS2（VCM2）/PIN-FORMED5（PIN5）模块抑制形成层活性，表明它在维持维管形成层稳态中的作用。PagMYB31可能是调控木材形成不同发育阶段的潜在靶点。
简要概述
背景：在杨树84K品种（Populus spp.）等树木中，木材的形成涉及维管形成层的细胞分裂、木质部细胞扩展、次生细胞壁沉积和程序性细胞死亡。形成层细胞持续分裂的能力对木本植物的茎、枝、干直径（径向生长）的增长至关重要。因此，理解植物如何调控形成层细胞，对于培育具有改良木材生长的树木具有重要意义。WUSCHEL同源盒转录因子WOX4已被确定为形成层细胞分裂的中心调控因子，而NAC和MYB转录因子则被认为是次生细胞壁增厚的关键调控因子。然而，目前我们对如何协调调控形成层细胞增殖和分化的了解仍然有限。
问题：我们想要确定哪些基因参与了形成层细胞的分裂和分化（木质部发育）的调控，并了解这些基因在杨树84K品种（Populus alba × Populus glandulosa）中如何调控形成层细胞的增殖和分化。
发现：对突变体和过表达转基因植物的表型特征研究表明，转录因子PagMYB31正向调控形成层细胞增殖，负向调控木质部细胞扩展和次生细胞壁生物合成。我们发现PagMYB31在通过多条途径促进或抑制WOX4表达方面，在维持维管形成层稳态中发挥了重要作用。我们还发现PagMYB31抑制了形成层细胞和木质部细胞的扩展以及木质部细胞的壁增厚，表明其在平衡形成层分生组织命运和分化方面的关键作用。PagMYB31可以直接调控控制形成层细胞增殖和木质部发育的关键基因，使其处于协调木材形成的调控网络中心。
下一步：本研究表明，PagMYB31在调控形成层细胞增殖和木质部发育（细胞扩展和壁增厚）中具有相反的功能。进一步的分析将致力于揭示上游信号或因子如何调控PagMYB31，并探索培育具有增强生长树木的策略。
引言
木本双子叶植物和裸子植物具有次生生长，在次生生长中，维管形成层的持续活动向内产生木质部，向外产生韧皮部。木质部是维管植物的特化组织，提供机械支撑并运输水分和养分。被子植物木本植物中的两种木质部细胞（纤维细胞和导管）具有增厚的次生细胞壁（SCW），纤维素、半纤维素和木质素作为主要壁成分沉积在次生细胞壁中。这些成分在纤维细胞次生细胞壁中的相互作用和高含量形成了刚性和厚实的壁，而由于木质素结构，导管次生细胞壁的疏水表面增强了其运输功能。
在次生生长过程中，形成层细胞需要保持未分化的干细胞状态以进行自我更新。我们对激素和关键调控因子在（前）形成层中维持干细胞状态的调控作用的理解主要来自模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）的研究。细胞分裂素（CK）通过D型细胞周期蛋白CYCD3促进形成层活动（Dewitte等人，2007）。生长素浓度在形成层中高于其他区域，而生长素稳态的维持由极性生长素运输调节（Schrader等人，2003）。过表达（OE）生长素运输基因PdePIN5b，该基因将生长素运输到内质网以限制细胞质生长素的可用性，降低了吲哚-3-乙酸（IAA）水平，抑制了形成层的增殖（Zheng等人，2021）。生长素通过生长素反应因子（ARFs）调节细胞分裂。ARF5/MONOPTEROS在胚胎发育过程中通过激活细胞分裂素生物合成途径中关键酶的基因表达（LONELY GUY4（LOG4）和LOG3）促进垂直平行的细胞分裂（De Rybel等人，2014；Ohashi-Ito等人，2014），但在次生生长过程中抑制维管形成层活动。相反，ARF3和ARF4正向调控形成层活动（Brackmann等人，2018）。
类似于顶端分生组织，（前）形成层中的干细胞稳态调控受肽/受体系统的非细胞自主控制，该系统中，包括CLAVATA3/胚胎周围区（CLE）家族成员CLE41、CLE42和CLE44在内的12-氨基酸导管元素分化抑制因子（TDIF）肽在韧皮部产生并移动到（前）形成层，在那里它们结合并激活TDIF受体（TDR）/韧皮部与木质部相间（PXY）（Hirakawa等人，2010）。而肽PttCLE47在形成层中产生，可能以细胞自主方式促进形成层增殖（Kucukoglu等人，2020）。TDIF/PXY信号通过WUSCHEL同源框相关蛋白4（WOX4）和WOX14调控维管干细胞增殖，这些是具有冗余功能的形成层分裂的关键调控因子。然而，WOX4和WOX14的突变并未完全消除形成层活动（Etchells等人，2013），而当WOX4和拟南芥中的1型结节样蛋白（KNAT1）/BREVIPEDICELLUS突变时，形成层活动几乎完全丧失，表明WOX4和KNAT1是形成层活动的主要决定因素（Zhang等人，2019）。WOX4被认为是形成层活动的中心调控因子，因为它整合了包括激素和TDIF/PXY信号在内的多条途径。除了作为TDIF/PXY信号的下游因子外，WOX4还需要参与ARF5介导的抑制形成层活动以及乙烯介导的促进形成层活动的作用（Brackmann等人，2018；Yang等人，2020）。通过BIN2-LIKE 1（BIL1）对ARF5的磷酸化整合了PXY和CK信号，因为PXY可以抑制BIL1活性，从而减弱ARF5对ARR7和ARR15表达的影响，以增加形成层活动（Han等人，2018）。毛银白杨PtoARF7直接激活WOX4，并与DELLA和生长素/IAA（AUX/IAA）蛋白形成三元复合体，提供了赤霉素（GA）和生长素在形成层活动上的协同调控的证据（Hu等人，2022）。
由形成层增殖产生的子细胞经历快速分化，包括细胞扩展、次生细胞壁沉积和程序性细胞死亡（PCD），形成导管和纤维细胞。有人提出，细胞扩展涉及细胞壁修饰酶的活动，包括扩展蛋白（EXPA/B）、木聚糖内转糖基酶/水解酶（XTH）、果胶甲酯酶（PME）、果胶/果胶酸裂解酶（PL）、内1,4-β-葡聚糖酶（EGase）和内1,4-β-甘露聚糖酶（MAN）（Luo和Li，2022）。在杨树84K品种中已经构建了一个四层的层级转录调控网络（hTRN），其中NAC（NAM, ATAF1/2和CUC2）转录因子（TFs）、次生细胞壁相关NAC域蛋白1（SND1）和维管相关NAC域（VND）位于TRN的顶层，MYB转录因子位于第二层，能够激活次生细胞壁的生物合成（Luo和Li，2022；Wei和Wei，2024）。
形成层细胞的增殖和分化需要精确的协调。TDIF-PXY信号通过抑制其分化为木质部细胞，有助于维持前形成层细胞，这种抑制作用是通过糖原合酶激酶3介导的BRl1-EMS抑制剂1的抑制来实现的（Kondo等人，2014）。包括WOX4和WOX14在内的几个因子在形成层细胞增殖和木质部细胞分化中具有双重功能（Zhang等人，2019）。毛银白杨乙烯反应因子PtERF85不仅激活与木质部细胞扩展相关的基因，还阻止与次生细胞壁形成相关基因的转录激活（Seyfferth等人，2021）。目前，对于形成层细胞增殖与木质部细胞分化之间的协调调控，尤其是在杨树84K品种中的理解仍然有限。
在本研究中，我们将PagMYB31表征为协调杨树84K品种（Populus alba × Populus glandulosa）木材形成不同发育阶段的中心调控因子。我们发现PagMYB31在木材形成过程中表现出相反的作用，正向调控形成层活动，负向调控木质部细胞扩展和壁增厚。PagMYB31还协调调控了形成层细胞增殖和细胞扩展/生长。我们构建了该调控因子的TRN，以了解其在木材形成中的协调调控的分子机制。
结果
杨树84K品种基因组组装的改进
在本研究中，我们使用了杨树84K品种（Populus alba × Populus glandulosa）。我们之前对该物种的基因组组装基于Pacific Biosciences（PacBio）单分子实时（SMRT）测序数据，并未达到染色体水平（Huang等人，2020）。为了获得更好的基因组组装，我们使用了25.26 Gb的PacBio高质量（HiFi）长读段和344.14 M的高通量染色质构象捕获（Hi-C）读段（补充文本S1）对基因组进行了重新组装。最终的基因组组装包含了2个单倍体基因组，总长度为879.94 Mb，具有更高的Contig N50（10.54 Mb），相比之前的版本有显著提升。这些Contig被锚定到38条拟染色体上，Scaffold N50为24.55 Mb。基准单拷贝直立植物正义基因的评估显示，该组装覆盖了99.26%（1,602/1,614）的直立植物单拷贝直系同源基因集合。基因组注释结果显示，共注释了85,392个编码蛋白的基因，其中44,998个位于亚基因组A，40,394个位于亚基因组B（补充文本S1）。
PagMYB31在杨树84K品种茎中的不同类型细胞中表达
根据RNA测序（RNA-seq）数据（Li等人，2021），PagMYB31（Potri.007G106100.v3.1），拟南芥AtMYB69（AT4G33450）的推测直系同源基因，在杨树84K品种的分化木质部中有大量表达。我们的逆转录定量PCR（RT-qPCR）分析确认了PagMYB31在分化木质部和幼根中具有较高的转录本丰度，而在叶片和韧皮部-形成层中的转录本丰度较低（图1A）。为了进一步研究PagMYB31的详细表达模式，我们使用了2.5 kb的启动子驱动GUS基因在杨树84K品种中表达。幼年的转基因植物在茎和叶脉中显示出GUS染色（图1B）。进一步的GUS染色在MYB31p-GUS转基因植物的茎横切面中进行。在具有初生生长的茎中，GUS染色明显出现在维管束中，在木质部和韧皮部细胞中都有信号（图1C和D）。在具有次生生长的茎中，GUS信号出现在分化木质部的纤维细胞、导管和射线细胞中，并且在形成层和韧皮部细胞（如韧皮纤维）中也检测到GUS信号（图1E和F）。亚细胞定位分析显示，PagMYB31蛋白定位于细胞核内（补充图S1）。
图1. PagMYB31在杨树84K品种中的表达模式。 A) PagMYB31在叶片（L）、幼根（R）、分化木质部（X）和韧皮部-形成层（P-C）中的RT-qPCR分析。数值为3个生物重复的均值±标准差。为了进行比较，叶片中的表达水平设为1。 B至F) 在组织培养的MYB31p-GUS转基因杨树84K品种中的GUS染色。 B) 幼年植株；C) 具有初生生长的茎的横切面；D) 放大的维管束图像；E) 具有次生生长的茎的横切面；F) E中韧皮部、形成层区和木质部部分的放大图像。F，纤维细胞；P，髓；PF，韧皮纤维；Ph，韧皮部；V，导管；VC，维管形成层；Xy，木质部。
CRISPR介导的PagMYB31敲除影响了形成层活性、木质部细胞扩展和次生细胞壁生物合成
为了研究PagMYB31在木材形成过程中的功能，我们首先使用CRISPR/Cas9基因编辑技术（Ma等人，2015）在杨树84K品种中生成了PagMYB31的功能丧失突变体。设计了两个向导RNA（gRNA）用于在两个位点进行突变，通过DNA测序鉴定了两个基因编辑突变体（myb31-7和11），它们在PagMYB31第一个外显子内ATG后第33个碱基处均有一个纯合突变（图2B；补充图S2A）。在myb31-7突变体的分化木质部中，Western blotting未检测到PagMYB31蛋白（图2C）。一致的是，细胞免疫定位在野生型（WT）从韧皮部到木质部的细胞中检测到PagMYB31蛋白，但在myb31-7突变体中未检测到（图2D）。
图2. PagMYB31突变减少了形成层活动并促进了细胞扩展和次生细胞壁生物合成。 A) myb31突变体和野生型（WT）植株。植株年龄为5个月。B) 测序显示PagMYB31编码区靶点2处有一个碱基缺失。C) Western blotting未在myb31-7突变体的分化木质部中检测到PagMYB31蛋白。D) myb31-7突变体和WT植株茎横切面的PagMYB31蛋白细胞免疫定位。未使用抗PagMYB31抗体的横切面作为阴性对照。E) 5个月大植株的高度。F) 7个月大植株的茎直径。G) 第5和第10节间茎横切面的细胞学观察显示木质部发育增强。H) 第12节间茎横切面的扫描电子显微镜（SEM）图像。I) 第10节间形成层区域的放大图像。J) 形成层区域切向切片的细胞学观察。K) 形成层区域切向切片的SEM观察。L) 第10节间的形成层细胞层数。myb31-7突变体的形成层细胞层数较少。M) 纤维细胞和导管的腔面积。N) 导管、纤维细胞和射线细胞的壁厚。O) NI分析。在E)、F)和L)中，误差条代表6次独立测量的标准差。在M)和N)中，误差条代表每条线3株植物中50个细胞的标准差。在O)中，误差条代表WT和myb31-7植物中3个纤维细胞的20个点的标准差。星号表示通过学生t检验的显著性差异（*P < 0.05；**P < 0.01，***P < 0.001）。F, 纤维细胞；FI, 梭形始端；RI, 射线始端；V, 导管；VC, 维管形成层；Xy, 木质部。
PagMYB31敲除突变体myb31-7在2个月龄以下时与WT植株具有相同的生长速率，而3个月大的突变体植株开始表现出较慢的生长速率（图2A和E）。对第5、第10和第15节间茎横切面的细胞学观察显示，突变体与WT之间在解剖结构上存在差异。在第5节间茎横切面中，myb31-7突变体中的韧皮部帽更为明显，表现出韧皮纤维细胞的壁增厚增强（图2G）。在WT的该节间，束内形成层和束间形成层开始形成连续的维管形成层；维管束是分离的，维管束之间的细胞只有轻微的分化（图2G）。而在myb31-7突变体的第5节间中，次生木质部中发生了纤维细胞和导管的分化，使其形成了连续的木质部环（图2G），myb31-7突变体的第5和第10节间木质部宽度大于WT，表明木质部发育得到促进（图2G）。一致地，myb31-7突变体的第10节间茎直径大于WT（图2F）。然而，突变体近基部的茎直径较小（图2F）。与WT相比，myb31-7突变体的第15节间次生木质部中细胞层数较少（补充图S3）。为了检查木质部细胞层数减少是否是由形成层活动的影响引起的，我们比较了突变体和WT的形成层区域。myb31-7突变体的维管形成层区域更难以区分，因为形成层细胞没有典型的扁平形状，形成层细胞层数约为WT的一半（图2I和L）。我们进一步在光学显微镜和扫描电子显微镜（SEM）下观察了切向切片中的形成层区域，结果显示，myb31-7突变体中的梭形始端和单列射线始端比WT中的更大，并且突变体的某些梭形始端内部形成了类似壁的结构，导致梭形形状的丧失（图2J和K）。
我们进一步在SEM下观察了茎横切面的木质部细胞（图2H）。在myb31-7突变体中，导管和纤维细胞均较大（图2M），而分离的木质部细胞测量显示，myb31-7突变体中的导管和纤维细胞的长度比WT短（27.6%至31.6%）（补充图S4），表明PagMYB31正向调控木质部细胞在纵向上的扩展，但负向调控木质部细胞在径向上的扩展。myb31-7突变体的木质部纤维细胞显示出较WT更厚的细胞壁（图2H），且myb31-7突变体中纤维细胞的壁厚比WT大约大48.5%（图2N）。在myb31-7突变体中，导管和射线细胞的壁也较WT更厚，分别厚约54.1%和52.39%（图2N）。在7个月大的myb31-7突变体和WT中，确定了木材成分，myb31-7突变体木材中的纤维素和木聚糖含量均高于WT木材，而木质素含量无显著差异（表1）。此外，我们使用纳米压痕（NI）技术测量了纤维细胞的微观力学性能。两个重要的木材细胞微观力学性能指标------弹性模量（Er）和硬度（H）值在myb31-7突变体中显著高于WT（图2O），表明突变体中纤维细胞的机械强度增加。
| Lines | Glucose | Xylose | Lignin |
|---|---|---|---|
| WT1 | 54.29 ± 0.80 | 15.62 ± 0.24 | 21.4 ± 0.30 |
| myb31-7 | 56.05 ± 0.12* | 19.10 ± 0.07*** | 22.1 ± 1.49 |
| OE-17 | 48.59 ± 0.43*** | 6.84 ± 0.05*** | 20.3 ± 1.19 |
| WT2 | 58.19 ± 0.74 | 16.82 ± 0.32 | 20.9 ± 1.130 |
| SRDX-19 | 52.42 ± 0.71*** | 12.54 ± 0.36*** | 22.0 ± 1.24 |
1号突变体与myb31-7表现出相同的表型，例如更少的形成层细胞层数，促进了木质部发育，但木质部细胞层数减少，木质部细胞变大，导管和纤维细胞的壁变厚（补充图S2和S3）。这些细胞学观察表明，PagMYB31突变导致形成层活性下降，但促进了木质部细胞扩展和次生细胞壁的形成。
PagMYB31或嵌合PagMYB31:SRDX在杨树84K品种中过表达的效果与PagMYB31突变的效果相反
我们还生成了PagMYB31过表达（PagMYB31-OE）和PagMYB31:SRDX的转基因株系。将植物特异的乙烯响应元件结合因子（ERF）相关的两亲性抑制（EAR）基序抑制域（SRDX）融合到转录因子的C端，可以将激活因子转化为抑制因子，或增强抑制因子的抑制能力（Mitsuda等人，2011）。与野生型（WT）相比，转基因植物的生长减少。在SRDX转基因植物中，生长减少比在过表达转基因植物中更为严重，SRDX-19的高度减少了67.5%（图3A和D；补充图S5A和S6，A和D）。在20株过表达转基因植物中，OE-17具有最高的转基因过表达（图3B和C），且该株系的高度显著减少了24.6%（图3A和D）。
图3. Flag:PagMYB31在杨树84K品种中的过表达抑制了木质部发育和次生细胞壁增厚。 A) WT植株和PagMYB31-OE转基因系5和17（OE-5和OE-17）。植株为1个月大。 B) Western blotting检测OE-17、OE-5和WT分化木质部中的PagMYB31蛋白。Actin用作内参照。 C) RT-qPCR分析WT、OE-5和OE-17分化木质部中PagMYB31的表达。 D) 1个月大植株的高度。 E, G) 在光学显微镜下对第10节间茎横切面的细胞学观察（E）和在SEM下对第12节间茎横切面的观察（G）。 F, H, I) 测量第10节间茎横切面的木质部宽度（F），第12节间导管和纤维细胞的壁厚（H）以及导管和纤维细胞的腔面积（I）。 J) WT、OE-5和OE-17形成层区域的放大图像。 K) 形成层细胞层数。误差条表示3个生物重复的标准差（C），6次独立测量的标准差（D, F, K），以及50次独立测量的标准差（H, I）。使用ANOVA进行多组比较，随后进行Dunnett事后配对比较以检验转基因植株与WT之间的统计显著性差异（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001）。
对第10节间茎横切面的细胞学观察显示，OE和SRDX转基因植株的木质部比WT狭窄，SRDX转基因植株的差异更为显著（图3，E和F；补充图S5，B和C，以及S6，E和F）。在表征的4个OE系中，OE-17的韧皮部帽最小，韧皮纤维细胞最少（图3E；补充图S5B）。在SRDX转基因植株中，韧皮部帽甚至更小，并且在SRDX-11的第10节间中，韧皮纤维的次生细胞壁尚未形成（补充图S6E）。SRDX转基因植株中更严重的表型可能是由于其转基因表达水平高于OE转基因植株（图3C；补充图S6，B和C），而SRDX转基因植株的第10节间茎直径与WT相同（补充图S6G）。
我们在SEM下测量了茎横切面中的木质部细胞壁厚度。在OE-17和OE-5的纤维细胞中，分别观察到58.5%和17.7%的壁厚显著减少，在导管中分别观察到40.6%和9.1%的壁厚显著减少（图3，G和H）。我们还观察到，OE-17中的导管比WT中的导管更小，细胞腔面积也较小（图3I）。SEM观察显示，SRDX-11和SRDX-19表现出与OE转基因植株相似的表型，具有更小且壁更薄的导管和纤维细胞（补充图S6，H至J）。我们还计算了形成层区的细胞层数，并观察到OE-17、OE-19和OE-5的细胞层数显著增加（图3，J和K；补充图S5，D和E，以及S6，K和L）。木材成分分析显示，OE-17和SRDX-19中的纤维素和木聚糖含量均减少，这与myb31-7突变体中的变化相反。两种转基因植株的木质素含量无显著变化（表1）。
转录组分析表明，PagMYB31是次生细胞壁形成的负调控因子
为了理解PagMYB31扰动的影响，我们对从2个月大植株茎第7节间以下的木质部侧面刮取的分化木质部进行了高通量转录组分析。RNA-seq数据的基因表达比较显示，在突变体和OE转基因植株的分化木质部中，与WT相比，共有1,892个差异表达基因（DEGs）（补充数据集S1）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）分析显示，顶富集的KEGG通路和GO术语均与细胞壁形成有关（补充图S7，A和B）。我们检查了在次生细胞壁形成过程中编码木质素、纤维素和半纤维素生物合成关键酶的基因表达（图4；补充数据集S1）。编码单木酚生物合成的11种酶（苯丙氨酸解氨酶[PAL]、肉桂酸4-羟化酶、对香豆酸CoA连接酶、羟基肉桂酰基转移酶[HCT]、对香豆酰CoA 3-羟化酶、咖啡酰CoA O-甲基转移酶、咖啡酸3-O-甲基转移酶[COMT]、肉桂酰CoA还原酶、咖啡酰莽草酸酯酶、卷柏醛5-羟化酶[CAld5H]和肉桂醇脱氢酶[CAD]）的17个基因在突变体的分化木质部中上调，而在OE转基因植株的分化木质部中下调（图4A）。在突变体分化木质部中上调的漆酶基因中，有5个（PagLAC4、21、14、40和49）是AtLAC4的推测直系同源基因，2个（PagLAC7和11）是AtLAC17的推测直系同源基因，2个（PagLAC16和22）是AtLAC11的推测直系同源基因，而AtLAC4、AtLAC17和AtLAC11已被确定为木质素聚合的关键酶编码基因（Berthet等人，2011；Zhao等人，2013），这表明突变体中的单木酚聚合增强。此外，编码纤维素和木聚糖生物合成关键酶的基因表现出与木质素生物合成酶基因相同的表达模式变化，包括PagCesA4、7/17、8/18（纤维素生物合成）、PagGT43A、B、C、IRX10-1（木聚糖主链生物合成）、PARVUS-1、-2、-L-2、GT8D1、2、FRA1和8（还原端生物合成）、GUX1a和2（添加葡萄糖醛酸[GlcA]）、GXM1、3、4和IRX15-L（向木聚糖的葡萄糖醛酸残基添加4-O-甲基基团）（图4，B和C）。对选定基因的RT-qPCR分析确认了它们在突变体中的上调以及在OE/SRDX转基因植株中的下调（补充图S7C）。基因表达分析显示，在次生细胞壁形成过程中，突变体中纤维素、半纤维素（木聚糖）和木质素的生物合成增强，而在OE和SRDX转基因植株中受到抑制。
图4. 在myb31-7突变体、Flag:MYB31和MYB31:SRDX转基因杨树84K品种分化木质部中的转录组分析。 热图显示了在WT、myb31-7突变体、PagMYB31-OE和PagMYB31:SRDX OE（SRDX）转基因植物分化木质部中木质素生物合成途径基因(A)、纤维素合酶（CesA）基因(B)、木聚糖生物合成酶基因(C)和转录因子（MYB和NAC）基因(D)的基因表达模式。橙色和蓝色分别表示较高和较低的基因表达水平。 E) 使用snRNA-seq的UMAP表示与形成层和木质部相关的聚类。 F) 从形成层分化到木质部的拟时间轨迹。 G) 小提琴图比较了在WT和myb31-7植物的木质部聚类1和20中的基因表达水平。小提琴的高度表示基因表达水平，小提琴的宽度表示在该聚类中表达的细胞比例。 H) UMAP可视化展示了空间转录组学中识别的细胞群，使用不同颜色表示不同的细胞群。 I) 这些细胞群被映射到来自第9节间苏木精-伊红染色切片的图像上。 4CL，p-香豆酸CoA连接酶；C3H，p-香豆酰-CoA 3-羟化酶；C4H，肉桂酸4-羟化酶；CAD，肉桂醇脱氢酶；CAld5H，卷柏醛5-羟化酶；CCoAOMT，咖啡酰-CoA O-甲基转移酶；CCR，肉桂酰-CoA还原酶；COMT，咖啡酸3-O-甲基转移酶；CSE，咖啡酰莽草酸酯酶；HCT，羟基肉桂酰基转移酶；LAC，漆酶；PAL，苯丙氨酸解氨酶。
我们研究了在myb31-7突变体和OE转基因植物分化木质部中已被鉴定为参与木材形成的转录因子（TFs）编码基因的表达（Luo和Li，2022）（图4D）。在次生细胞壁生物合成TRN顶层的NAC基因中，4个PagSND基因（SND1-A1/A2和B1/B2）和5个PagVND基因（VND6-A2，B1/B2和C1/C2）在PagMYB31-OE转基因植物中下调。然而，在这9个基因中，只有PagVND6-A2、B1和C1在myb31-7突变体中显著上调。对于第二层基因，PagMYB21/2和20/3是AtMYB46和83的直系同源基因，它们的表达水平在OE转基因植物中均下调，而只有PagMYB3和20在myb31-7突变体中上调。PagMYB74，被确定为杨树84K品种SND1s的额外靶标（Chen等人，2019），在突变体的分化木质部中上调，在OE转基因植物中显著下调。许多其他MYB基因表现出相同的表达变化模式，其中PagMYB90、92、10、221、125、161和199已被确定为杨树84K品种木材形成中的功能基因（Luo和Li，2022）。
我们还分别使用从混合的分化木质部和韧皮部中分离出的细胞核进行了myb31-7突变体和WT的单核RNA-seq（snRNA-seq）分析。对WT和myb31-7突变体的转录组进行无监督聚类分析产生了21个聚类，这些聚类是使用现有标记基因鉴定的（补充图S8，A和B；补充数据集S2）。聚类1、2、19和20归属于正在进行次生细胞壁增厚的细胞（补充图S8）。拟时间轨迹分析显示，聚类1处于次生细胞壁增厚过程的后期，而聚类20处于早期（图4，E和F）。我们观察到许多细胞壁代谢基因，包括PagCesA7、CesA17、CesA18、PAL1、CAD1、COMT2、HCT1、CAld5H1和GUX1a，在myb31-7突变体的聚类20中上调，而仅PagPAL3和PagCAld5H2在myb31-7突变体的聚类1中上调（图4G）。同时，更多的TF基因在myb31-7突变体的聚类1中上调，而不是在聚类20中上调（图4G）。例如，3个基因PagSND1-A2、VND6-C1和MYB3在myb31-7突变体的聚类1中上调，而仅PagSND1-A1在myb31-7突变体的聚类20中上调（图4G）。此外，还对第9节间茎横切片进行了空间转录组学分析（图4，H和I；补充图S9和S10）。在这项分析中，在WT的999个点检测到40,395个基因，在myb31-7突变体的1,667个点检测到45,406个基因（补充数据集S2）。通过线性回归和UMAP可视化对空间转录组学中的点进行分类，这些点被划分为6个聚类（图4，H和I）。大多数TF和细胞壁代谢基因表现出与RNA-seq中相同的表达变化。例如，4个编码调控次生细胞壁生物合成的TF基因（PagMYB3、20、74和VND6-C1）以及PagCesA4、7、IRX10-1和15-L在突变体中均上调（补充图S9）。这些TF基因在myb31-7突变体的分化木质部中的上调以及在OE转基因植物中的下调表明，调控木材形成的转录调控网络在突变体的分化木质部中增强，而在OE转基因植物中被关闭。
PagMYB31通过直接抑制调控次生细胞壁生物合成的关键TF基因来调控次生细胞壁形成
为了研究PagMYB31的扰动如何影响次生细胞壁的生物合成，我们通过结合染色质免疫沉淀（ChIP）-seq和RNA-seq（来自突变体和OE转基因植物）的方法识别PagMYB31的直接靶标。ChIP在Flag:PagMYB31-OE转基因系OE-5和OE-17中使用抗Flag抗体进行，然后对免疫沉淀的DNA片段进行测序。通过整合ChIP-seq和RNA-seq数据，我们共识别了252个PagMYB31直接靶标，这些靶标在myb31-7突变体的分化木质部中上调，而在OE转基因植物中下调。其中，根据GO注释，有52个基因对应74个ChIP峰，与次生生长相关（补充数据集S3）。ChIP-qPCR用于验证PagMYB31与这些46个基因启动子的相互作用，结果验证了PagMYB31可以结合31个基因的启动子（补充图S11，图5A）。在这31个基因中，XYLEM CYSTEINE PROTEASE2（PagXCP2）编码一种参与木质部发育过程中程序性细胞死亡（PCD）的半胱氨酸蛋白酶。
图5. PagMYB31通过直接抑制调控次生细胞壁（SCW）形成的转录因子（TF）基因来调控SCW的生物合成。 A) 通过ChIP-qPCR检测PagMYB31与8个调控SCW生物合成的TF基因启动子的相互作用。ChIP在WT和Flag:PagMYB31-OE转基因系OE-17中进行。qPCR引物设计在ChIP峰区域内，并在PagVND6-A2、B1、C1、MYB3/20、21和74的启动子中识别出SMRE位点。 B) PagMYB31与其靶标的酵母单杂交（Y1H）实验。共转化体（GAL4:MYB31和Promoter:HIS3）被稀释（1, 10-1和10-2）并在补充一定浓度3-AT的SD/-Leu-Trp-His培养基上生长。GLA4:53 + 53p:HIS3用作阳性对照，GAL4 + Promoter:HIS3为阴性对照。 C) 基于效应子-报告基因的激活/抑制实验表明，PagMYB31抑制了PagSND1-A2、MYB21和20/3的启动子活性。Rluc的活性用作内参干扰。在A)和C)中，误差条代表3个生物重复的标准差，星号表示通过学生t检验的显著性差异（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001）。
为了验证ChIP结果，我们选择了11个基因（PagMYB21、20/3、SND1-A2、MYB158、NAC127、CAld5H2、AUX1、XCP2、TBL33和TBL38）进行酵母单杂交（Y1H）和效应子-报告基因实验。在Y1H实验中（补充图S12；图5B），携带这些11个基因的启动子的诱饵酵母菌株在补充有3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）的培养基上无法生长。当PagMYB31转入诱饵菌株时，酵母能够在补充有3-AT的培养基上生长，表明PagMYB31能够激活这些启动子。在效应子-报告基因实验中（补充图S13；图5C），效应子构建体（35S:PagMYB31）与这11个报告基因构建体中的每一个共转化到烟草（Nicotiana benthamiana）叶片中，并测定荧光素酶（LUC）活性以检查PagMYB31对每个启动子的激活/抑制作用。实验表明，与仅转化报告基因构建体的对照相比，每个共转化中的LUC活性均降低，表明PagMYB31的瞬时过表达抑制了这些11个基因的表达。Y1H和效应子-报告基因实验均支持了ChIP结果以及PagMYB31的抑制活性。
通过ChIP-seq/qPCR，我们共鉴定了8个调控SCW生物合成的TF基因作为PagMYB31的候选直接靶标（补充数据集S3；图5A），其中包括1个PagSND1成员（SND1-A2）、3个PagVND6成员（VND6-A2、B1和C1）和4个PagMYB成员（MYB3/20、21和74）。Y1H实验也检测到PagMYB31与这8个基因中的7个启动子的相互作用（图5B）。我们选择了PagSND1-A2、MYB3/20和21进行效应子-报告基因实验，结果显示PagMYB31显著抑制了它们的启动子活性（图5C）。在这8个基因中，除PagSND1-A2和MYB21外，其余6个基因在myb31-7突变体的分化木质部中上调（图4D），而PagSND1-A2在snRNA-seq中在myb31-7突变体的聚类1中上调（图4G）。尽管ChIP/qPCR显示PagMYB31也可以结合PagVND6-B2的启动子（补充图S11），但PagVND6-B2在myb31-7突变体的分化木质部中的表达没有显著变化。这些结果表明，PagMYB31直接且负向调控PagSND1-A2、MYB3/20、74、VND6-A2、B1和C1，并且myb31-7突变体中增强的SCW生物合成可能是由于这7个TF基因的上调所引起的。
PagMYB31正向调控形成层活性
myb31突变体显示形成层细胞层数较WT少，而OE转基因植物的形成层细胞层数增加（图2，I和L，图3，J和K；补充图S2，B和C，补充图S5，D和E），表明PagMYB31正向调控形成层活性。为了检查形成层细胞中的基因表达，刮取韧皮部一侧的组织并用于RNA-seq分析。虽然来自韧皮部一侧的组织是韧皮部和形成层的混合物，但在剥离树皮时，大部分形成层细胞附着在韧皮部一侧而非木质部一侧，因此我们可以基于RNA-seq数据分析形成层特异性基因的表达（补充数据集S4）。
我们研究了已知在杨树84K品种形成层中发挥作用的蛋白质编码基因，包括PagWOX4、VCM1/2和MYB199（Moyle等人，2002；Tang等人，2020；Zheng等人，2021）。PttWOX4在杨树84K品种中特异性表达于形成层区域（Kucukoglu等人，2017）。在myb31-7突变体中，PagWOX4a/b的转录本丰度显著低于WT，其中PagWOX4b的转录本丰度特别低（比WT低1.48倍，Padj < 0.05）（补充数据集S4；图6A）。两种与维管形成层相关的MADS-box蛋白VCM1和VCM2通过直接激活PIN5来调控形成层活性（Zheng等人，2021）。PagVCM2和PagPIN5在myb31-7突变体的韧皮部-形成层中显著下调（图6A）。PaMYB199由生长素诱导，编码一个形成层细胞增殖的负调控因子（Tang等人，2020）。PagMYB199在myb31-7突变体中下调（图6A）。RT-qPCR验证了PagWOX4、VCM2、PIN5和MYB199在突变体中的下调（图6B）。
图6. PagMYB31直接调控参与形成层增殖的基因的表达。 A) 热图显示了参与形成层细胞增殖的基因在WT、myb31-7突变体、PagMYB31-OE和PagMYB31:SRDX OE（SRDX）转基因植物韧皮部-形成层中的表达水平变化。 B) RT-qPCR验证了myb31-7突变体中PagWOX4、VMC2、MYB199和PIN5的下调，以及PagMYB72和196的上调。特异性引物设计用于定量PagWOX4a + 4b和PagWOX4b的转录本丰度。 C) UMAP可视化（左）显示了表示形成层细胞的聚类7和13，以及小提琴图可视化（右）显示了PagWOX4、CLE47和VCM2在myb31-7突变体形成层聚类中的下调。小提琴的高度表示基因表达水平，小提琴的宽度表示在该聚类中表达的细胞比例。 D) ChIP-qPCR显示了PagMYB31与PagWOX4、CLE47、MYB199、VCM2和MYB72启动子的结合。 E) PagMYB31与PagWOX4、CLE47、MYB199、VCM2和MYB72启动子的酵母单杂交（Y1H）实验。共转化体（GAL4:MYB31和Promoter:HIS3）被稀释（1, 10^-1, 和10^-2）并在补充3-AT的SD/-Leu-Trp-His培养基上生长。GLA4:53 + 53p:HIS3用作阳性对照，GAL4 + Promoter:HIS3为阴性对照。 F) 基于效应子-报告基因的实验显示，PagMYB31激活了PagWOX4、VCM2和CLE47的启动子活性，但抑制了PagMYB72的启动子活性。 G) 基于效应子-报告基因的转激活/抑制实验显示，PagMYB72抑制了PagWOX4b、VCM2和PIN5的启动子活性。在B)、D)、F)和G)中，误差条代表3个生物重复的标准差，星号表示通过学生t检验的显著性差异（**P < 0.01；***P < 0.001）。
在snRNA-seq分析中，根据PagWOX4在这两个聚类中的上调，聚类7和13被确定为形成层细胞（补充图S8）。我们观察到，PagWOX4b和CLE47在myb31-7突变体的聚类13中下调，PagWOX4b和VCM2在myb31-7突变体的聚类7中下调（图6C），这与RNA-seq结果一致。空间转录组分析中也检测到了形成层区域中PagWOX4的下调（补充图S10A）。结果表明，PagMYB31突变影响了与形成层增殖相关的基因的表达。
结合韧皮部-形成层中的ChIP-seq和RNA-seq识别了PagMYB31的几个直接靶标，包括PagWOX4、VCM2、MYB199、CLE47和MYB72，并通过ChIP-qPCR进行了验证（补充数据集S3；图6D）。Y1H实验也支持PagMYB31与这5个基因的启动子结合（图6E）。进一步的效应子-报告基因实验显示，PagMYB31可以激活PagWOX4b、CLE47和VCM2的启动子活性（图6F），表明PagMYB31直接且正向调控这3个基因的表达。虽然我们未检测到PagMYB31直接调控CLE44基因，但我们观察到PagCLE44D在韧皮部-形成层中上调，表明CLE肽在PagMYB31介导的形成层活动调控中可能起作用。
在95个特异于维管形成层（VCS）的TF基因（Dai等人，2023）中，PagMYB72（VCS60）和PagMYB196（VCS74）是RNA-seq分析中在myb31的韧皮部-形成层中上调的唯一两个基因（图6，A和B），空间转录组分析也显示PagMYB72在myb31-7突变体形成层区域上调（补充图S10A）。在这两个基因中，PagMYB72通过ChIP-seq被识别为PagMYB31的靶标（补充数据集S3）。ChIP-qPCR证实PagMYB31可以结合PagMYB72的启动子，但不能结合PagMYB196的启动子（图6D）。我们进行了效应子-报告基因实验，发现PagMYB72显著抑制了PagWOX4b、VCM2和MYB199的启动子活性（图6G）。由于在效应子-报告基因实验中，PagMYB31可以抑制PagMYB72的表达（图6F），我们推测PagMYB31可能通过PagMYB72调控PagWOX4、VCM2和MYB199的表达。
PagMYB31调控细胞扩展和生长
细胞学观察显示，与WT相比，myb31突变体的分化木质部中的纤维细胞和导管较大，myb31-7突变体的形成层中的梭形始端和射线始端也明显较大。我们研究了编码与细胞壁扩展相关的细胞壁修饰酶的差异表达基因（DEGs），包括EXPA/B、木葡聚糖转糖基酶/水解酶（XET/XEH）、PME、PL、EGase和MAN（Luo和Li，2022）。RNA-seq分析显示，突变体中有大量细胞壁修饰酶基因表现出差异表达，包括韧皮部-形成层中的10个基因和分化木质部中的29个基因（补充数据集S1和S4）。在韧皮部-形成层中的10个DEGs中，PagXTH16下调，而其他9个基因均上调（图7A），并且一致的空间转录组分析显示，这9个基因中的3个（PagEXPB3、PL3和EXPA4c）在myb31-7突变体的形成层区域上调（补充图S10B）。在分化木质部的29个DEGs中，RNA-seq分析显示21个基因上调（图7B），而空间转录组分析显示，这21个基因中的8个在myb31-7突变体的木质部区域相较于WT中上调（补充图S10C）。
图7. PagMYB31调控形成层和木质部细胞扩展。 A) 热图显示了在韧皮部-形成层（A）和分化木质部（B）中，细胞壁修饰酶基因（包括膨胀素(EXPA)基因、XTH基因和PL基因）的表达情况。 C) 小提琴图可视化比较了在WT和myb31-7植物的形成层和木质部聚类中，细胞壁修饰酶基因的表达水平。小提琴的高度表示基因表达水平，小提琴的宽度表示在该聚类中表达的细胞比例。 D) ChIP-qPCR检测PagMYB31与5个细胞壁修饰酶基因启动子的结合。误差条表示3个生物重复的标准差，星号表示通过学生t检验的显著性差异（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001）。 E) PagMYB31与PagEXPB3和PagXTH10启动子的酵母单杂交（Y1H）实验。共转化体（GAL4:MYB31和Promoter:HIS3）被稀释（1, 10^-1, 和10^-2）并在补充3-AT的SD/-Leu-Trp-His培养基上生长。GLA4:53 + 53p:HIS3用作阳性对照，GAL4 + Promoter:HIS3为阴性对照。
使用snRNA-seq数据，我们比较了这些细胞壁修饰酶基因在代表形成层细胞的聚类13和7以及代表木质部细胞的聚类1和20中的基因表达情况。我们观察到，只有PagEXPB3和PagEXPA4c在myb31-7突变体的聚类7中显著上调。两个基因PagEXPB3和PagXTH28b在myb31-7突变体的聚类1中显著上调，PagMAN6b在聚类20中显著上调（图7C）。在RNA-seq分析中，myb31-7突变体的分化木质部中下调的8个基因中，有5个基因（PagEXPA1、PLL12、XTH5、15和33）在snRNA-seq分析中在myb31-7突变体的聚类1中下调（图7C）。
在PagMYB31通过ChIP-seq的直接靶标中，通过RNA-seq分析发现了myb31-7突变体中差异表达的12个编码细胞壁修饰酶的基因（补充数据集S1和S4）。我们选择了5个基因PagEXPB3、XTH10、EXPA15a、XTH30b和PL3进行ChIP-qPCR实验，并证实了在它们的启动子中抗PagMYB31抗体免疫沉淀的富集DNA片段（图7D）。对两个选定基因PagEXPB3和PagXTH10进行的Y1H实验支持了ChIP结果（图7E）。在12个PagMYB31靶标中，包括PagEXPB3和PL3在内的2个基因在myb31-7突变体的韧皮部-形成层和分化木质部中均上调。结果表明，更多的细胞壁修饰酶基因参与了木质部细胞的扩展。由PagMYB31突变引起的细胞壁修饰酶基因上调表明这些酶在PagMYB31介导的形成层细胞和木质部细胞扩展中发挥作用。PagEXPB3和PL3可能参与了形成层区域和分化木质部中的细胞扩展。
PagMYB31介导的转录调控网络（TRN）
为了构建PagMYB31介导的TRN，我们选择了6个被鉴定为PagMYB31靶标的TF基因，并进行了ChIP-seq。这6个TF基因与3×Flag标签融合，并通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）瞬时转化到杨树84K品种植物中。ChIP-seq分析显示，这6个TF能够结合至少19个细胞壁代谢基因的启动子，并通过ChIP-qPCR验证了这些结合（补充图S14）。例如，PagSND1-A2直接调控了10个基因，包括3个单木酚生物合成基因、2个木质素聚合基因、2个细胞壁修饰基因和3个MYB基因。PagMYB20直接调控了4个基因，分别是PagCAD1、HCT1、LAC14和LAC21。结合RNA-seq、ChIP-seq、Y1H和效应子-报告基因实验，我们构建了一个由PagMYB31介导的TRN，其中包括58个TF-DNA相互作用（图8；补充数据集S5）。该TRN显示PagMYB31直接调控细胞扩展、程序性细胞死亡（PCD）和次生细胞壁生物合成，而在形成层中，PagMYB31直接和间接调控PagWOX4。PagMYB31不仅通过PagMYB3间接抑制了PagCAld5H2，还对PagCAld5H2产生了前馈效应。在myb31-7突变体的分化木质部和形成层中上调的27个细胞壁修饰酶基因中，PagMYB31仅直接调控了其中的5个。其余基因中，PagXTH8由PagMYB31的靶标PagNAC127直接调控。
图8. PagMYB31介导的转录调控网络（TRN）调控木材形成的不同发育阶段，包括形成层细胞增殖、木质部细胞扩展和次生细胞壁（SCW）生物合成。 在形成层中，PagMYB31直接调控PagWOX4、VCM2、MYB199和CLE47。PagMYB72是PagMYB31的靶标，PagMYB72直接抑制PagWOX4、PagVCM2和PagPIN5的表达。PagMYB31还通过抑制细胞壁修饰酶基因（PagEXPB3和PL3）的表达来抑制形成层活性。在木质部发育过程中，PagMYB31通过直接抑制细胞壁修饰酶基因（PagEXPB3、EXP15a、XTH10、XTH30b和PL3）的表达来抑制细胞扩展。PagMYB31可以结合调控SCW生物合成的转录因子（TF）基因的启动子（包括4个SND1基因、6个VND基因、MYB3/20、2/21和74），但只有PagSND1-A2、MYB3/20、74、PagVND6-A2、B1和C1在myb31-7突变体的分化木质部中上调。图中粉色和紫色线条上的数字分别表示myb31-7突变体的形成层和分化木质部中PagMYB31直接靶标基因的log2倍变化。
讨论
PagMYB31通过直接抑制木材形成调控因子的表达来负向调控SCW生物合成
在本研究中，转录组分析显示，SCW生物合成程序在myb31突变体中被增强，而在PagMYB31-OE转基因植物中被抑制，表明PagMYB31负向调控SCW的生物合成。ChIP和Y1H实验显示，PagMYB31直接结合了4个PagSDN1基因、4个PagVND6基因和5个MYB基因（PagMYB2/21, 3/20和74）的启动子，这些基因在MYB31和MYB31:SRDX转基因植物的分化木质部中均下调。然而，在myb31突变体中，仅PagMYB3/20, 74, PagVND6-A2, B1, C1和SND1-A2显著上调，而其他直接靶标基因（3个PagSND1基因，MYB2/21, VND6-A1, B2和C2）未显著上调。这可能是因为用于PagMYB31和PagMYB31:SRDX过表达的CaMV 35S启动子强度足以抑制所有靶基因。在与次生生长相关的52个PagMYB31靶基因中，PagMYB3在ChIP DNA中富集度最高，并且其启动子中被检测到的峰值数也多于其他PagMYB31靶基因（补充数据集S3；图5A）。我们在PagMYB20和21的启动子中鉴定了2个结合位点，并且2个位点的富集水平不同（图5A）。PtrMYB2/21和3/20在激活其靶基因的能力上存在差异，这可能是由于PagMYBs与其靶基因启动子中的次生壁MYB响应元件（SMREs）结合亲和力的差异所致（McCarthy等人，2010；Zhong等人，2013）。结果表明，PagMYB31对不同结合基序/基因的结合/抑制能力不同，这可能解释了在myb31突变体中某些PagMYB31靶基因的上调。通过整合RNA-seq和ChIP-seq，我们证明PagMYB31主要通过直接抑制PagMYB3/20, 74, VND6-A2, B1, C1和SND1-A2的表达来抑制SCW增厚。
在所有已被鉴定为木材形成过程中重要调控因子的MYB基因中，大多数是转录激活因子，少数是转录抑制因子（Wei和Wei，2024）。在酵母转激活/抑制实验中，我们检测到PagMYB31的激活活性非常低，但未检测到其抑制活性（补充图S15），而效应子-报告基因实验显示，PagMYB31能够激活其直接靶标PagWOX4, VCM2和CLE47的启动子活性，这些靶标在ChIP和Y1H实验中已被鉴定为PagMYB31的直接靶标。然而，效应子-报告基因实验显示，PagMYB31抑制了其他靶标基因的启动子活性，与此同时，这些靶标在myb31突变体中上调，在PagMYB31-OE转基因植物中被抑制。PagMYB31和PagMYB31:SRDX转基因植物的纤维细胞和导管中的SCW厚度均减少。添加SRDX结构域可以将激活因子转化为抑制因子或增强抑制因子的抑制活性。在MYB31和MYB31:SRDX转基因植物中表现出的相同表型支持了PagMYB31的抑制功能。这些结果表明，PagMYB31可能在不同的发育阶段具有转激活和抑制能力，并且这些能力可能需要不同的辅因子。
PagMYB31在协调木质部细胞分化和壁厚化中起作用
在MYB31p:GUS转基因植物中，GUS染色显示PagMYB31的表达模式比在木质部细胞壁增厚过程中表达的SCW调控因子更广泛（McCarthy等人，2010；Ohtani等人，2011）。PagMYB31在形成层区域内以及在木质部细胞扩展和壁厚化过程中连续表达，表明PagMYB31可能是PagSND1s、VND6s和MYB3/20的上游调控因子。PagMYB31突变引起了木质部中的各种表型，包括更薄的细胞壁、更大的纤维细胞和更大的导管。导管、纤维细胞和髓细胞的增大表明PagMYB31负向调控细胞扩展。然而，木质部细胞的纵向长度与径向长度显示出相反的变化。
木质部细胞扩展发生在壁厚化之前，并决定了最终的细胞形状和大小。这一过程涉及初生细胞壁的修饰，需依赖膨胀素、XET/XEH和PME的活性（Rose和Bennett，1999；Mellerowicz和Sundberg，2008）。膨胀素被认为能破坏纤维素微纤丝与交联糖苷如木葡聚糖或木聚糖之间的氢键，从而松弛细胞壁（McQueen-Mason和Cosgrove，1994；Yennawar等人，2006），而XET可能影响木葡聚糖的重新排列（Nishikubo等人，2011）。我们观察到，许多细胞壁修饰基因在myb31突变体的分化木质部中上调，包括膨胀素基因PagEXPA4a/b、EXPA17、EXPA15a和EXPB3；XET基因XTH9、XTH10、XTH28a/b和XTH30a/b；PL基因PLL18、PL1、PL2和PL3，表明这些基因参与了木质部细胞扩展。葡聚糖酶基因PtrCel9A1/PtrKOR1、PtrCel9A6、PtrGH9B4和PtrGH9C3的上调支持了葡聚糖酶在细胞扩展中的作用（Yu等人，2013，2018）。我们还观察到，PagEXPA1、EXPA15b、XTH5、XTH15、XTH16、XTH33、PLL12和PME3在myb31突变体的分化木质部中下调。在杂交银白杨中，PttPME1可以抑制扩展木细胞的侵入性和共质体生长（Siedlecka等人，2008）。PagPME3的下调可能影响导管和纤维细胞的增大。许多细胞壁修饰酶基因在次生木质部中高度
表达，表明这些酶在细胞壁扩展中具有协同功能或在不同类型的细胞中发挥作用（Rose和Bennett，1999；Gray-Mitsumune等人，2004）。一些细胞壁修饰酶基因的过表达对纤维细胞和导管之间的细胞扩展产生了不同的影响。例如，PttEXPA1-OE导致纤维细胞直径增加和导管长度增加（Gray-Mitsumune等人，2008），而XTH基因PtxtXET16-34的过表达促进了导管生长但未促进纤维细胞扩展（Nishikubo等人，2011）。随着CRISPR技术在树木中的成功应用，这些细胞壁修饰酶基因可以被敲除，以研究这些酶在特定类型细胞的扩展中的作用，以及研究哪些细胞壁修饰酶参与纵向和径向方向的细胞扩展。
ChIP-seq和RNA-seq分析显示，PagMYB31可以结合PagEXPB3、XTH10、EXPA15a、XTH30b和PL3的启动子，并且其突变导致这5个基因上调。PagMYB31不能直接调控PagXTH8，但ChIP实验表明，PagMYB31的3个靶标（PagMYB3、MYB158和NAC127）可以直接调控PagXTH8，表明PagMYB31及其靶标转录因子在调控与细胞扩展相关的基因方面可能具有协同作用。PagMYB31还可以直接抑制PagXCP2，该基因编码一个在程序性细胞死亡（PCD）期间参与液泡自溶和液泡膜破裂的蛋白质（Funk等人，2002；Avci等人，2008）。在拟南芥中，XCP2由VND7直接激活，这表明PagMYB31可以通过与PagVNDs的拮抗作用抑制导管PCD。结果显示，PagMYB31可能在协调木质部细胞扩展和SCW增厚中起重要作用。PagMYB31功能的丧失导致细胞扩展增加、SCW沉积增强以及导管中PCD的促进。这种细胞分化的紊乱可能是导管变形的原因（图2G）。
PagMYB31调控形成层细胞增殖和扩展/生长
维管形成层的活性决定了树木的横向生长。PagWOX4是调控形成层活性的重要激素和肽信号通路下游的调节因子。在银白杨×青杨杂交种中敲低PagWOX4a/b导致形成层活性降低，这与WOX4在其他杨树84K品种物种中的扰动效应相同（Kucukoglu等，2017；Tang等，2022）。韧皮部-形成层的RNA-seq显示，PagWOX4在myb31-7突变体中显著下调，表明PagMYB31突变通过抑制PagWOX4的表达导致形成层细胞层数减少。
在12个已被鉴定为形成层活性调节因子的TFs中（包括4个HD ZIP III蛋白和2个MADS-box蛋白VCM1/2）（Du等，2009，2011；Robischon等，2011；Zhu等，2013，2018；Hou等，2020；Zheng等，2021），我们观察到除了PagWOX4b外，另有2个TF基因PagVCM2和PagMYB199在myb31-7突变体中下调。这两个基因参与了形成层中的生长素信号传导。生长素在韧皮部、形成层到木质部之间形成浓度梯度，其峰值位于形成层区域。PtoARF7的过表达通过直接调控WOX4来提高形成层活性（Hu等，2022），而生长素抑制PagMYB199的表达，后者负向调控维管形成层活性（Tang等，2020），表明生长素在形成层细胞增殖中的作用。在杨树84K品种中，VCM1和VCM2通过直接调控PIN5来调节生长素的细胞内稳态（Zheng等，2021）。我们还观察到PagPIN5和PagPIN6的下调，这与VCM激活PIN基因的结果一致。然而，VCM1过表达的杨树84K品种表现出更少的形成层和木质部细胞层，表明VCM1负向调控形成层的增殖活性。突变体韧皮部-形成层中PagVCM2的下调与形成层活性的降低不一致。同样，PagMYB199的下调与形成层细胞增殖的负向调控不一致。通过ChIP和转录组分析，我们发现PagMYB31直接调控了PagMYB72，而PagMYB72可以抑制PagWOX4、PagVCM2和PagMYB199的表达，这表明这些基因的下调可能是由myb31突变体中PagMYB72的上调引起的。MYB31-MYB72-WOX4模块以与MYB31-MYB72-VCM2/MYB199模块相反的方向调节形成层活性，表明PagMYB31既正向也负向调节形成层活性。PagMYB31可能在维持形成层活性的稳态中起着重要作用。
我们还观察到myb31-7突变体韧皮部-形成层中2个CLAVATA3/ESR（CLE）相关蛋白基因PagCLE47和PagCLE44的下调（补充数据集S4）。PttCLE47在形成层中表达并促进形成层增殖（Kucukoglu等，2020）。CLE44主要在韧皮部合成并移动到形成层以调节WOX4活性（Hirakawa等，2008）；因此，PagCLE44和PagCLE47分别在韧皮部和形成层中的下调，以及它们在myb31-7突变体中的下调，表明TDIF/PXY信号传导被抑制，这可能在抑制PagWOX4表达中起作用。与PagWOX4下调的抑制效应相比，MYB72-VCM2/PIN5/MYB199模块促进形成层活性的效应较弱。我们推测形成层活性的降低主要是由PagWOX4的下调引起的。在snRNA-seq分析中，PagWOX4b在形成层的2个聚类7和13中下调，而PagCLE47和PagVCM2分别在聚类13和聚类7中下调，这表明PagMYB31在形成层发育的不同细胞或不同发育阶段调节TDIF和生长素信号传导。
在本研究中，通过基因扰动（突变和过表达）揭示了PagMYB31在杨树84K品种木材形成过程中的作用，并通过基因表达分析和靶标识别研究了其作用机制。通过snRNA-seq和空间转录组分析鉴定的差异表达基因数量远少于RNA-seq分析鉴定的数量。这是由于snRNA-seq和空间转录组分析中单个细胞的基因表达水平较低，尤其是TF基因的表达水平较低。然而，对于RNA-seq分析中未出现差异表达的基因，一些在snRNA-seq分析中表现出差异表达，例如PagSND1-A2和PagbHLH186在myb31-7突变体的聚类1中上调（图4G），这表明这些基因的产物在SCW增厚的早期阶段发挥作用，并支持PagSND1-A2是PagMYB31的直接靶标。snRNA-seq和空间转录组分析在研究细胞命运转换方面优于传统转录组分析（Rodriguez-Villalon和Brady，2019）。
我们发现PagMYB31是调控木材形成过程中形成层增殖、木质部细胞扩展、SCW增厚和PCD的协调因子。它在木材形成中具有双重功能，正向调控形成层增殖，负向调控木质部细胞发育（细胞扩展和SCW增厚）。在协调形成层增殖和木质部分化以及协调细胞扩展和壁厚化方面，已经鉴定出一些具有双重功能的TFs。例如，WOX4在拟南芥中可能也调节木质部分化，因为在wox4突变体中木质部网络被严重干扰（Zhang等，2019）。PagMYB199在维管形成层和发育中的木质部中表达，并且负向调控形成层增殖和SCW增厚（Tang等，2020）。然而，myb31-7突变体中PagMYB199在分化木质部中的上调和在韧皮部-形成层中的下调与PagMYB199的负向功能不一致。PagMYB199是受PagMYB31扰动影响的基因之一，而PagMYB31下游基因的贡献可能不同。许多与形成层活性维持、细胞扩展和SCW生物合成相关的基因是PagMYB31的直接靶标，表明PagMYB31在调控这些过程中的协调作用。PagMYB31还可能抑制形成层细胞扩展，因为PagMYB31的突变导致梭形始端和射线始端增大，表明PagMYB31可以抑制形成层细胞分化。PagMYB31激活了几个形成层特异性的靶标基因，同时也抑制了调控SCW生物合成的TFs基因的表达，正如效应子-报告基因实验、ChIP和Y1H所示。在最近的一项研究中，4类A-ARFs在番茄（Solanum lycopersicum）中被鉴定为果实启动的负调节因子和果实生长的正调节因子，通过时空调控不同的靶标基因（Hu等，2023）。我们的结果表明，PagMYB31通过直接抑制细胞壁修饰酶基因和木材形成调控基因分别负向调控细胞扩展和SCW增厚，同时它通过调控PagWOX4的表达调控形成层活性。PagMYB31的活性在协调木材形成的连续发育步骤中是必需的。
材料与方法
植物材料和生长环境
银白杨 × 青杨 "84K"和烟草 (Nicotiana benthamiana) 植物种植在泥炭苔 (Sphagnum) 中，并在长日照条件下 (白天 25°C，夜间 23°C) 的植物生长室中培养。无菌的银白杨 × 青杨植物通过插条在添加了 30 g/L 蔗糖、5 g/L 琼脂、0.05 mg/L 吲哚丁酸和 0.02 mg/L 萘乙酸的 1/2 MS 培养基 (pH 5.8 至 6.0) 上繁殖。
基因组组装与注释
DNA 文库使用 SMRTbell Template Prep Kit 1.0 准备，并在 PacBio Sequel II (PacBio, CA, USA) 上进行测序。使用 HiCanu (Koren et al. 2017) 组装高质量长读序列 (HiFi 读数)。"minlength"、"coverage" 和 "genomesize" 参数分别设置为 300、50 和 900 Mb，其他参数设置为默认值。使用 assembly-stats 工具 (GitHub - sanger-pathogens/assembly-stats: Get assembly statistics from FASTA and FASTQ files) 确定基因组的组装统计数据。
注释使用 MAKER (Cantarel et al. 2008) 进行。将转录序列 (Huang et al. 2020) 提供给 MAKER 作为 EST 证据。Trinity 按照默认参数执行成对读数组装。蛋白质证据来自 8 个物种，包括北美黑杨 (Populus trichocarpa) (Tuskan et al. 2006)、银白杨 (P. alba) (Liu et al. 2019)、欧洲山杨 (Populus tremula) (Ingvarsson 和 Bernhardsson 2020)、灌木柳树 (Salix suchowensis 和 Salix purpurea) (Hirakawa et al. 2008) (Phytozome v13)、拟南芥 (Arabidopsis) (Berardini et al. 2015)、葡萄 (Vitis vinifera) (Jaillon et al. 2007) 和水稻 (Oryza sativa) (Ouyang et al. 2007)。对于 ab initio 预测，使用上述转录序列训练 SNAP、AUGUSTUS 和 GeneMark-ES 的基因预测模型，并在 MAKER 运行中使用。最后，使用 EVM (EvidenceModeler) (Haas et al. 2008) 合并转录、同源和 ab initio 基因集，形成综合的非冗余基因集。重复元素使用 RepeatModeler (Flynn et al. 2020) 和 RepeatMasker (Tarailo-Graovac 和 Chen 2009) 识别。
RT-qPCR 分析
收集包括叶片、根、木质部和韧皮部-形成层在内的不同组织，并立即在液氮中冷冻。在去皮后，使用单刃剃刀分别从木质部和树皮侧刮取分化木质部和韧皮部-形成层。使用 CTAB 方法 (Lorenz et al. 2010) 提取总 RNA；使用含有 gDNA Eraser 的 PrimeScript RT Reagent Kit (TaKaRa, 大连, 中国) 将 150 ng 总 RNA 逆转录为 cDNA。在 Roche Light Cycler 480 II 上使用 Green Premix Ex Tag II (TaKaRa, 大连, 中国) 进行 qPCR。基因表达水平相对于参考基因 PagACTIN 的表达水平通过 2−ΔCT 计算确定。每次测量进行 3 次重复，并在 3 个生物重复中重复。使用的引物列在补充数据集 S6 中。
GUS 检测
GUS 检测按照先前报道的方法进行 (Zhou et al. 2019)。将1个月大的树的茎横切片 (50 μm) 先放置在预冷的 90% (v/v) 丙酮中 20 分钟，以防止 GUS 信号扩散，然后用洗涤缓冲液 (20 mM NaHPO4, pH 7.2, 1 mM K3Fe(CN)6, 1 mM K4Fe(CN)6, 和 Triton X-100) 洗涤 3 次，每次 2 分钟。样品在含有 1 mM X-Gluc 的染色液中在 37°C 下孵育过夜 (应用真空确保样品沉底)。样品用 70% (v/v) 乙醇清洗，并在奥林巴斯 DP74 数码相机 (奥林巴斯公司, 东京, 日本) 下观察。
RNA-seq
RNA-seq 文库构建和测序按照先前研究进行 (Huang et al. 2022)。基因对齐和注释使用本研究中的银白杨 × 青杨基因组 v.3.1 进行。差异表达基因 (DEGs) 使用 DESeq2 软件分析，调整后的 P 值小于 0.05。GO 富集和 KEGG 分析在 omicshare 网站 (OmicShare 基迪奥生物信息云平台) 上进行。
亚细胞定位
PagMYB31 的编码区克隆到 PHG (WEIDI, 上海, 中国) 中，生成 2 × 35S-PagMYB31:GFP。构建体通过农杆菌 GV3101 瞬时表达在烟草叶片中，信号使用共聚焦显微镜 (LSM 510, Zeiss) 捕获。激发波长和发射波长分别为 488 和 492 到 543 nm。
载体构建和植物转化
PagMYB31 的全长编码区通过 PCR 从银白杨 × 青杨木质部 cDNA 中扩增，并通过 Exnase II 介导的重组 (ClonExpressII One Step Cloning Kit, Vazyme Biotech Co., Ltd, 南京, 江苏, 中国) 克隆到 pBI121-35S-SRDX (Wang et al. 2021) 中，生成 pBI121-35S-PagMYB31:SRDX。对于标记的 PagMYB31 的过表达 (OE)，从 pCAMBIA1307-Flag:HA (Li et al. 2015) 中扩增 3 × flag 并克隆到 pBI121-2 × 35S-miR408 中，以生成 pBI121-2 × 35S-3 × flag。PagMYB31 被克隆到该载体中，生成 pBI121-2 × 35S-3 × Flag:PagMYB31。PagMYB31 的启动子 (2.0 kb) 从基因组 DNA 中扩增，并通过 Exnase II 插入到 pBI121 载体中，生成 pBI121-PagMYB31p-GUS 以进行基因表达分析。PagMYB31 敲除突变体 (myb31) 通过 CRISPRCas9 系统生成 (Ma et al. 2015)。使用 CRISPR-P2.0 (CRISPR-P v2.0) 设计 sgRNA 序列。载体构建中使用的引物列在补充数据集 S6 中。构建体转化入农杆菌 GV3101。对于银白杨 × 青杨的转化，受伤的叶片用作外植体 (Zhou et al. 2019) 以进行转基因 (PagMYB31:SRDX, 3 × Flag:PagMYB31, 和 PagMYB31p:GUS) 的过表达，愈伤组织用作外植体 (Chai et al. 2014) 以生成敲除突变体。
组织学分析
使用振动切片机（Leica VT1000S，德国Nussloch）从1.5个月大的银白杨×青杨的第5、第10和第15节间取出50微米厚的茎横切片，使用0.05%（w/v）的甲苯胺蓝O（TBO）染色，并在奥林巴斯DP74数码相机（Olympus Corp.，日本东京）下观察。使用ImageJ软件测量3株独立植物的木质部宽度。将myb31-7突变体和野生型（WT）的第10节间的去皮茎切成1厘米长的小块，并按之前描述的方法（Huang et al. 2022）进行软化以分离木质部细胞。材料用TBO染色，并在光学显微镜（Olympus BX51）下观察，每个品系的3株植物的50个细胞被测量。
扫描电子显微镜（SEM）分析
从1.5个月大的银白杨×青杨树84K品种木中取出50微米厚的茎横切片，并在2.5%（w/v）的戊二醛中固定过夜。经过磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液冲洗和梯度脱水后，进行关键点干燥约2小时。样品在10 mA电流下镀金120秒，并在Thermo Fisher Quanta FEG 450扫描电子显微镜下观察。使用ImageJ软件在至少3株独立植物的50个细胞中测量细胞大小和壁厚。
木材成分分析
从7个月大的植物的第13节间以下的茎组织被收集并在55°C下干燥至恒重。木材被磨成40至60目。化学成分根据之前的研究（Lu et al. 2021）进行测定，每个样品进行了3次独立测量。
纳米压痕分析（NI分析）
从7个月大的树木中收集直径超过1厘米的茎部分，并去除树皮。自然干燥后，用金刚石刀片抛光一个约1毫米面积的45°斜面，以获得超光滑的表面（Ultracut，Leica，德国）。测试前，抛光的样品放置在NI样品室中至少4小时，以达到与样品室条件的平衡。纳米压痕测试在配备3面金字塔形金刚石压头的纳米机械测试仪（TI 950 TriboIndenter，Hysitron Inc.，美国）上进行（Li et al. 2023）。压痕以3段负荷梯度（加载/保持/卸载在5/2/5秒内）进行，峰值力为40 μN。每个样品选择3个不同位置进行测试，并确定WT和突变体中每个细胞的约20个有效值，以获得弹性模量（Er）和硬度（H），如补充图S16所示。
抗体生产和蛋白质印迹（Western Blotting）
使用引物（补充数据集S6）扩增PagMYB31的全长编码序列，并克隆到pET32a载体中（Novagene，美国）。使用IPTG（1 mg/mL）诱导蛋白表达，重组蛋白通过Ni-NTA-Beads-6FF纯化，并用于小鼠单克隆抗体生产（上海Abmart公司，中国）。
将2克分化木质部在液氮中研磨成粉末。将粉末放入2 mL预冷的裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，20 mM KCl，2 mM EDTA，pH 8.0，2.5 mM MgCl2，250 mM蔗糖，25% [v/v]甘油，5 mM DTT）中。混合物通过miracloth过滤，并在4°C下以1,500 × g离心10分钟。将沉淀转移到新的管中，并悬浮在20 mL预冷的NRBT缓冲液（20 mm Tris-HCl，pH 7.5，2.5 mm MgCl2，25% [v/v]甘油，0.2% [v/v] Triton X-100）中。离心后，沉淀物用预冷的NRBT缓冲液清洗4次。使用抗PagMYB31抗体（1:750稀释，过夜杂交）或抗FLAG抗体（肽序列DYKDDDDK）（CW0287，CWBIO，1:1,000稀释）进行4小时的Western Blotting。用二抗（山羊抗小鼠IgG，CW010，CWBIO，1:1,000稀释）杂交2小时后，使用Immobilon Western-HRP底物Luminol试剂（Millipore）检测信号。
免疫组织化学（IHC）分析
IHC分析根据之前的研究进行，并进行了一些修改（Tang et al. 2022）。将组织培养的WT和myb31-7植物的基部节间茎切成20微米厚的切片，并使用振动切片机（Leica VT1000S，德国Nussloch）切割，然后用丙酮固定。将封闭液（PBS中含有0.5% [v/v]正常山羊血清和1% [w/v] BSA）应用于切片1.5小时。然后将切片孵育在含有抗PagMYB31抗体（1:200稀释）的PBS缓冲液中1小时，用PBS冲洗10分钟，并转移到含有山羊抗小鼠IgG（H + L）/HRP-偶联抗体（A0216，碧云天，中国）（1:2,000稀释）的PBS缓冲液中孵育2小时。然后用BCIP/NBT染色，并在配备有数码相机的奥林巴斯DP74显微镜（Olympus Corp.，日本东京）下观察。
单细胞核RNA测序（snRNA-seq）分析
去皮后，使用单刃剃刀从木质部和树皮侧刮取分化的木质部和韧皮部。两个样本等量混合，并根据之前的参考文献（Conde et al. 2021; Sunaga-Franze et al. 2021）分离细胞核。snRNA-seq文库构建和测序按照之前的描述进行（Li et al. 2021）。从WT样本中获得了总共10,516个细胞核，平均测序深度为每个细胞43,792个读长，从myb31-7样本中获得了9,553个细胞核，平均测序深度为每个细胞47,652个读长（补充数据集S2）。生物信息学分析使用Omicsmart，一个实时互动在线数据分析平台（Omicsmart-账户总览）。使用P. alba × P. glandulosa V3.1基因组来比对snRNA-seq读长，并通过cellranger识别基因表达水平。进一步的分析使用Seurat软件进行（Butler et al. 2018）。使用Seurat函数FindClusters和resolution = 0.5进行群集识别，并通过UMAP进行可视化（Milošević et al. 2022）。使用FindAllMarker识别群集标记基因（群集富集基因），设置为"min.pct = 0.25"和"log2fc.threshold = 0.36"（Satija et al. 2015）。
空间转录组分析
从2个月大的树木的第9节间取出的5毫米长的茎碎片被嵌入冷的最佳切割温度化合物中并进行冷冻切片。根据制造商的说明使用10× Visium平台构建cDNA文库，并使用10× Genomics平台进行文库测序。我们使用我们组装的V3.1基因组来比对测序数据，并使用官方的10× Genomics软件Space Ranger进行数据比较和基因定量。同时，根据Space Ranger识别的定量结果，随后使用Seurat软件进行数据分析（Satija et al. 2015）。基于每个样本的测序数据，将每个样本中检测到的点按空间转录组RNA-seq数据分析过程进行分组和识别，并识别出点的类型。使用Seurat中的SCTransform算法对每个样本进行归一化（Zheng et al. 2017）。使用UMAP算法进行数据可视化，并通过SpatialFeaturePlot最终可视化基因表达变化（Milošević et al. 2022）。
染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析
PagMYB31的ChIP按照之前的描述进行（Liu et al. 2018），使用5 g的在1/2 MS培养基上培养的4周龄WT和3 × Flag:PagMYB31-OE转基因银白杨×青杨。6个选定TF的ChIP在瞬时转化的4周龄植物中按照之前的研究进行（Wang, Li, et al. 2020）。通过Western Blotting使用抗FLAG抗体（CW0287，CWBIO，1:1,000稀释）确保目标蛋白的表达。在交联后，分离核蛋白，并通过超声处理将DNA打断成150至200 bp的片段（Bioruptor Plus, Diagenode）。添加抗FLAG抗体（F1804，Sigma，1:200稀释）进行蛋白-DNA复合物的免疫沉淀过夜。反向交联后，纯化DNA并用于qPCR和ChIP-seq文库构建。文库在Illumina NovaSeq 6000上进行双端测序（150 bp）。进行了3个生物重复，以确保结果的可靠性。使用的引物列在补充数据集S6中。
使用BOWTIE 2 v.2.4.5（Wick et al. 2017）将测序读长比对到我们的参考基因组（银白杨×青杨基因组v.3.1）。使用MACS2（v.2.2.7.1）进行峰值调用，参数为默认值（P < 0.01）（Zhang et al. 2008）。最终的峰值使用CHIPSEEKER进行注释（Yu et al. 2015）。使用BEDTools v.2.30.0提取峰值序列（Quinlan and Hall 2010）。
酵母单杂交（Y1H）分析
每个TF基因的全长编码区被克隆到pGADT7-Rec2载体中（Clontech, USA），候选基因的启动子被扩增并通过Exnase II介导的重组插入到pHIS2载体中。使用的引物列在补充数据集S6中。诱饵和猎物构建体共转化到酵母菌株Y187中，并在缺乏亮氨酸和色氨酸的SD固体培养基上选择（SD/-Leu-Trp）。通过对共转化体在含有一定浓度3-AT的SD/-Leu-Trp-His培养基上的生长能力评估阳性菌株的生长。
效应因子-报告基因分析
PagMYB31的全长编码区被插入到pGreenII62-SK载体中（Miaoling Biol. Inc.，武汉，中国），生成效应因子构建体35S-PagMYB31。包含ChIP-seq分析中峰值序列的候选基因的启动子片段被克隆到pGreenII 0800-LUC载体中，生成报告基因构建体。所有构建体通过电转化转化入携带pSoup-p19的农杆菌GV3101中。分别携带效应因子构建体和报告基因构建体的农杆菌按1:1的比例混合，在黑暗中孵育2至3小时，并注射到6周龄的烟草叶片中。在黑暗中过夜培养后，将植物置于光照培养箱中培养2至3天，使用双LUC报告基因分析系统（Promega, GloMax 20/20 Luminometer）测量注射叶片的荧光活性。使用植物活体成像系统（PlantView100, BLT）测定LUC活性并拍摄照片。进行了3个生物重复，每个重复有3个技术重复，并获得了类似的结果。使用的引物列在补充数据集S6中。
统计分析
学生t检验用于两组比较以检查统计显著性。ANOVA用于多组比较，随后进行post hoc Dunnett配对比较以检查转基因植物与WT植物之间的统计显著性差异（*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001）。统计数据提供在补充数据集S7中。