scanpy单细胞转录组python教程（二）：单样本数据分析之数据质控

接上节（scanpy单细胞转录组python教程（一）：不同形式数据读取）。scanpy流程和R seurat流程并无太多差别，只是语言变了而已，思维不变。读取完矩阵，那么质控无非就是对于UMI、features、线粒体基因、核糖体基因比例、双细胞等等的检测而已。这里我们演示的数据是之前R里面演示过的数据。这里仅仅分析单个样本，不涉及到数据合并，去批次等等，主要是为了熟悉scanpy流程和代码，实际情况可能你不止一个样本，多样本数据分析我们后续讲到。学会基础，后面的也不再话下！

数据质控之数据分析之基，是非常重要的一个步骤，这个步骤也是比较主观的步骤，需要结合实际，可能很多情况需要在做好分群结果之后返回重新调整。这里介绍基础的质控，还有去除背景/环境RNA、去除双细胞等也是质控，后续我们也会涉及到。

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import pandas as pd
import scanpy as sc

sc.settings.verbosity = 3 
sc.logging.print_header()
sc.settings.set_figure_params(dpi=80, facecolor="white")

read data：这里演示的数据是一个10X数据，经典三个文件表达矩阵！

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adata = sc.read_10x_mtx(
    "./单样本数据/AA_scRNA/",  # the directory with the `.mtx` file
    var_names="gene_symbols",  # use gene symbols for the variable names (variables-axis index)
    cache=True,  # write a cache file for faster subsequent reading
)
adata
... writing an h5ad cache file to speedup reading next time
Out[3]:
AnnData object with n_obs × n_vars = 11967 × 33538
    var: 'gene_ids', 'feature_types'

基础过滤QC：执行最简单的过滤，每个细胞至少表达200个基因，每个基因至少有3个细胞表达。Seurat中这一步的过滤在creatseuratobj的时候就可以选：WT <- CreateSeuratObject(counts = WT, project = "WT", min.cells = 3, min.features = 200)

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#basic QC
sc.pp.filter_cells(adata, min_genes=200)#each cell expres 200 genes at least
sc.pp.filter_genes(adata, min_cells=3) #each gene must expres in 3cells at least
filtered out 1149 cells that have less than 200 genes expressed
filtered out 11516 genes that are detected in less than 3 cells

然后就是几个我们比较关心的指标了，线粒体基因表达比例，核糖体基因表达比例，血红蛋白基因表达比例。需要注意物种，人和小鼠，人的一般基因大写，小鼠小写。

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adata.var["mt"] = adata.var_names.str.startswith("MT-")#开头是MT-的基因
adata.var["ribo"] = adata.var_names.str.startswith(("RPS", "RPL"))
adata.var["hb"] = adata.var_names.str.contains(("^HB[^(P)]"))
#Calculate quality control metrics.
#in this step, QC metrics, including 'n_genes_by_counts','total_counts','pct_counts_mt','pct_counts_ribo','pct_counts_hb' & etc, are calculated.
#The funcion sc.pp.calculate_qc_metrics was employed to calculate.
#Pay attention, the parameters percent_top & log1p are optional. 
sc.pp.calculate_qc_metrics(adata, qc_vars=["mt", "ribo", "hb"], inplace=True, percent_top=[20], log1p=True)
adata
#######################################################################
AnnData object with n_obs × n_vars = 10818 × 22022
    obs: 'n_genes', 'n_genes_by_counts', 'log1p_n_genes_by_counts', 'total_counts', 'log1p_total_counts', 'pct_counts_in_top_20_genes', 'total_counts_mt', 'log1p_total_counts_mt', 'pct_counts_mt', 'total_counts_ribo', 'log1p_total_counts_ribo', 'pct_counts_ribo', 'total_counts_hb', 'log1p_total_counts_hb', 'pct_counts_hb'
    var: 'gene_ids', 'feature_types', 'n_cells', 'mt', 'ribo', 'hb', 'n_cells_by_counts', 'me

计算完成后，adata将包括这些内容：

adata.obs：

total_counts：每个细胞的总 UMI 数

n_genes_by_counts：每个细胞检测到的基因数

pct_counts_mt：线粒体基因表达占比（%）

pct_counts_ribo：核糖体基因表达占比（%）

pct_counts_hb：血红蛋白基因表达占比（%）

percent_top_20：表达量最高的 20% 基因的占比（%）

adata.var：

n_cells_by_counts：表达该基因的细胞数

mean_counts：该基因的平均表达量

pct_dropout_by_counts：未检测到该基因的细胞百分比

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#obs里面移除一些没用的列，精简数据
remove = ['total_counts_mt', 'log1p_total_counts_mt', 'total_counts_ribo', 'log1p_total_counts_ribo', 'total_counts_hb', 'log1p_total_counts_hb']
adata.obs = adata.obs[[x for x in adata.obs.columns if x not in remove]]

plot quality control metrics,小提琴图可视化，这里是看一下数据分布。

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sc.pl.violin(
    adata, #adata object
    ["n_genes_by_counts", "total_counts", "pct_counts_mt",'pct_counts_ribo', 'pct_counts_hb'], #adata.obs或者adata.var_names需要plot的值
    jitter=0.2,#抖动点宽度
    size=2,#点的大小
    multi_panel=True
)

数据QC: 数据的质控要结合自己的实际，不要盲从。这也是老生常谈的问题，比如线粒体基因比例，通常认为高线粒体基因比例代表细胞不好，具体的阈值要根据实际确定。其他的例如total_counts，也不能太高，如果同一批样本某些组中离群细胞的total_counts高，可能是因为双细胞，所以要cut一下。同样的，n_genes_by_counts，对于每个细胞检测到的基因数也需要控制，如果太低，那么这个细胞质量也不好，需要过滤。总之，需要结合自己的实际数据调整。这关系到后续的细胞分群注释。

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adata = adata[
    (adata.obs.pct_counts_mt < 20) &
    (adata.obs.pct_counts_ribo < 40) &
    (adata.obs.n_genes_by_counts < 6000) &
    (adata.obs.total_counts >= 1000) &
    (adata.obs.total_counts < 20000) &
    (adata.obs.pct_counts_hb < 0.1), :].copy()
sc.pl.violin(
    adata, #adata object
    ["n_genes_by_counts", "total_counts", "pct_counts_mt",'pct_counts_ribo', 'pct_counts_hb'], #adata.obs或者adata.var_names需要plot的值
    jitter=0.2,#抖动点宽度
    size=2,#点的大小
    multi_panel=True
)