大家好！今天来了解一篇关于对干细胞行为的可逆调控的研究------《Modularity-based mathematical modeling of ligand inter-nanocluster connectivity for unraveling reversible stem cell regulation》发表于《Nature Communications》。这项研究利用图论对细胞外基质（ECM）模拟配体簇间连接性进行数学建模，通过调节磁性纳米阻滞剂的各向异性和远程循环提升，实现对干细胞行为的可逆调控，为组织再生中细胞-材料相互作用的动态调控提供了新途径。
* 本文只做阅读笔记分享 *
一、研究背景
1 、细胞外基质（ ECM ）的重要性及相关研究现状
ECM的重塑对细胞行为的调控具有关键意义，例如骨骨折时需要通过调节干细胞的机械转导和分化来重建组织结构，肌腱中的纤维状胶原网络不断连接和断开以调节生理机械功能和病理过程。然而，目前由于缺乏对其复杂动态结构的设计和建模，尚未能实现对ECM调节细胞行为的有效调控及深入理解。在大脑组织中，虽然尝试了对网络互连性进行映射，但没有对其结构进行主动调节或建模。
2 、图论在研究中的应用潜力
图论可用于计算由互连构建块组成的材料的复杂纳米结构以及各种细胞类型的互连网络，例如Louvain算法可通过最大化模块性来确定簇的最优划分，从而有助于量化网络中簇的互连性。这为研究材料簇间连接性对细胞行为的影响提供了理论基础和分析工具。
3 、配体配置研究及现有研究的不足
近年来，研究人员开发了具有不同配体配置的材料，并探索了配体密度、间距、微图案化、多价性和聚类等参数对细胞行为的影响。例如，已发现纤维状配体之间的桥接、整合素结合配体（如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸，RGD）以及配体的形状和模式等因素均可调节细胞行为。但是，此前的研究无法调节配体的连接性，并且在动态建模以及分析配体阻断对调节配体互连性方面存在不足。
二、研究成果
1 、制备具有可调各向异性的纳米阻滞剂
1.1 纳米阻滞剂前体的合成
通过调节氯化铁（FeCI3）浓度，利用水解过程合成不同维度的β-羟基氧化铁（akaganeite）纳米棒作为纳米阻滞剂前体。较高的FeCI3浓度会导致纳米棒具有更高的各向异性，从而分别得到低、中、高各向异性的akaganeite纳米棒（不同温度下的退火过程影响纳米棒结构转变）。这些纳米棒在形成二氧化硅包膜前，先经过一系列处理，如用乙醇洗涤、离心、悬浮等操作。
1.2 纳米阻滞剂的制备与表征
在akaganeite纳米棒表面形成二氧化硅包膜，通过控制TEOS的添加量来调节纳米棒的各向异性，同时保持其投影面积相似。然后，经退火介导的还原反应使akaganeite相转变为磁铁矿相，得到磁可逆的纳米阻滞剂。利用多种表征手段，如原位透射电子显微镜（TEM）、高分辨TEM（HR-TEM）、快速傅里叶变换（FFT）分析、选区电子衍射（SAD）图案成像、X射线衍射（XRD）和振动样品磁强计（VSM）分析等，证实了纳米阻滞剂的结构和性能。
2 、构建具有可调连接性的材料
2.1 材料表面处理与配体节点构建
以玻璃盖玻片为材料，先进行一系列表面处理，包括用盐酸-甲醇溶液洗涤、硫酸处理、硫醇化等，使其表面活化并带有羟基和硫醇基团。然后，将直径为20nm的GNPs通过金-硫醇键接枝到材料表面，形成均匀分布且间距相似的配体节点，相邻GNPs间距约为205.7nm，与天然ECM中含RGD配体的纤连蛋白分子间距相当。
2.2 纳米阻滞剂的接枝与材料构建
将不同各向异性的纳米阻滞剂进行胺基官能化处理，再通过与聚合物接枝到材料表面的配体节点上。聚合物接枝过程中，利用马来酰亚胺-聚（乙二醇）-N-羟基琥珀酰亚胺（Mal-PEG-NHS）与纳米阻滞剂上的胺基反应，通过静电排斥作用使纳米阻滞剂定位在配体节点之间，从而构建出具有可调连接性的材料，且保证了各材料中配体密度和纳米阻滞剂密度相近。
3 、纳米阻滞剂各向异性对干细胞行为的影响
3.1 基于图论的建模与分析
利用图论对互连配体网络进行建模，将连接配体的GNPs视为配体节点，纳米阻滞剂阻断配体-配体边缘。通过Delaunay三角剖分建立配体节点间的边缘，再用Louvain算法将网络划分为簇，量化相邻配体纳米簇间的边缘数（#ligandinter-clusteredges）。例如，在低各向异性纳米阻滞剂（"Lowaniso."）存在时，#ligandinter-clusteredges较高，促进干细胞黏附与分化；而高各向异性纳米阻滞剂（"Highaniso."）会降低#ligandinter-clusteredges，抑制干细胞行为。
3.2 实验验证与调控机制分析
通过多种实验验证了纳米阻滞剂各向异性对干细胞行为的调控作用。在干细胞黏附实验中，将干细胞接种到不同材料表面培养48小时后，发现"Lowaniso."组干细胞黏附增强，整合素β1表达增加，黏着斑数量和肌动蛋白阳性面积增大，细胞纵横比降低；而"Highaniso."组则相反。同时，通过对干细胞机械转导和分化相关蛋白（如YAP和RUNX2）的分析，发现其表达水平与#ligandinter-clusteredges呈正相关，且抑制细胞黏附相关分子机制（如肌球蛋白II、肌动蛋白聚合和Rho相关蛋白激酶，ROCK）会消除#ligandinter-clusteredges介导的干细胞调控作用。此外，还进行了一系列对照实验，如不同配体修饰材料、不同纳米阻滞剂各向异性及线性化对比等，进一步证实了调控作用的特异性。
4 、循环调节纳米阻滞剂实现远程可逆调控
4.1 纳米阻滞剂的循环升降调控
通过在材料上方放置永久磁铁（295mT），实现对高各向异性纳米阻滞剂的循环升降调控（"E."表示升高，"NE."表示不升高）。例如，在体外实验中，将磁铁的使用和不使用在材料上方每24小时切换或保持，持续72小时，以实现对#ligandinter-clusteredges的循环调节。
4.2 对干细胞行为的影响及机制
这种循环调节可显著影响干细胞行为。在干细胞培养过程中，当纳米阻滞剂升高时，干细胞的黏附、机械转导和分化相关指标显著增强，如DAPI阳性细胞数、黏着斑数量、肌动蛋白阳性面积、YAP和RUNX2的核/质强度比增加，细胞纵横比降低；而纳米阻滞剂不升高时则相反。通过免疫染色、荧光成像和定量分析等手段证实了这一结果。其机制在于，纳米阻滞剂升高时形成纳米间隙，细胞丝状伪足可通过该间隙感知并接触下方连接的配体节点，从而增强黏附，促进机械转导和分化。例如，利用免疫金纳米颗粒（IGNP）标记整合素β1，发现低聚合物接枝密度时细胞可通过纳米间隙浸润并感知连接的配体节点，而高聚合物接枝密度则阻止细胞浸润。
5 、体内实验验证有效性与安全性
5.1 实验设计与操作
在体内实验中，将构建的材料植入小鼠皮下口袋，然后注射人骨髓间充质干细胞（hMSCs）。通过在小鼠背部固定永久磁铁，每3小时切换或保持磁铁的耦合和去耦合，持续6小时，实现对纳米阻滞剂的时间分辨调节，从而调节#ligandinter-clusteredges。
5.2 结果与安全性评估
免疫染色荧光成像和定量分析结果表明，体内调节#ligandinter-clusteredges对干细胞行为的影响与体外实验结果一致。同时，通过对植入部位周围皮下组织及主要器官（肝脏、心脏、脾脏和肾脏）的苏木精-伊红（H&E）染色分析，评估了材料的局部和全身毒性，结果显示材料无明显细胞毒性，表明该方法在体内具有安全有效的调节干细胞行为的潜力。
三、研究结论与展望
1 、研究成果总结
本研究利用图论对互连配体GNP节点的#inter-clusteredges进行数学建模，通过改变均匀排列且具有相同投影面积和表面密度的纳米阻滞剂的各向异性，实现了对#ligandinter-clusteredges的独立调节。增加纳米阻滞剂的各向异性会降低#ligandinter-clusteredges，从而抑制干细胞行为；而通过磁线性化和循环远程控制纳米阻滞剂的升高，可分别增加配体互连数和提供纳米间隙，促进干细胞的黏附、机械转导和分化，且在体内实验中也验证了其有效性和安全性。
2 、未来研究方向
未来将致力于将数学建模概念扩展到更复杂的三维环境，进一步研究细胞与材料相互作用的机制。通过设计更复杂的远程可调节纳米阻滞剂结构，有望应用于分析更多ECM模拟功能几何结构，精确调节细胞-材料相互作用，从而推动再生疗法的发展，为生物材料应用开辟更广阔的前景。
四、一起来做做题吧
1、以下关于细胞外基质（ECM）重塑的说法，正确的是？
A. ECM 重塑仅在病理状态下发生，对生理功能无影响。
B. ECM 的连接性变化对组织和器官功能的影响已被完全理解。
C. 目前缺乏有效设计和建模 ECM 复杂动态结构的方法来调节干细胞行为。
D. ECM 重塑过程中，其网络结构不会发生可逆变化。
2、图论在研究材料簇间连接性对细胞行为影响中的作用不包括以下哪项？
A. 计算由互连构建块组成的材料的复杂纳米结构。
B. 确定细胞类型的互连网络中簇的最优划分。
C. 直接改变细胞行为，无需考虑其他因素。
D. 量化网络中簇的互连性。
3、在制备纳米阻滞剂时，调节 akaganeite 纳米棒各向异性的关键因素是什么？
A. 正硅酸乙酯（TEOS）的添加量。
B. 氯化铁的浓度。
C. 退火温度。
D. 聚合物接枝的方式。
4、在构建材料时，纳米阻滞剂与配体节点在材料表面的定位是基于什么原理？
A. 共价键结合。
B. 氢键作用。
C. 静电排斥。
D. 范德华力。
5、基于图论建模分析，高各向异性纳米阻滞剂对# ligand inter-cluster edges 有何影响？
A. 增加# ligand inter-cluster edges，促进干细胞行为。
B. 降低# ligand inter-cluster edges，抑制干细胞行为。
C. 不影响# ligand inter-cluster edges，对干细胞行为无作用。
D. 随机改变# ligand inter-cluster edges，使干细胞行为不稳定。
6、循环调节纳米阻滞剂促进干细胞黏附的机制主要涉及以下哪个细胞结构？
A. 细胞核。
B. 线粒体。
C. 丝状伪足。
D. 内质网。
7、在体内实验中，评估材料安全性的主要方法是什么？
A. 观察小鼠的行为变化。
B. 检测植入材料的物理性质变化。
C. 对植入部位周围组织及主要器官进行 H&E 染色分析。
D. 测量干细胞在体内的增殖速率。
参考文献：
Kim, C., et al. Modularity-based mathematical modeling of ligand inter-nanocluster connectivity for unraveling reversible stem cell regulation. Nat Commun 15, 10665 (2024).