高级生化大纲

一，蛋白质化学：

蛋白质分离是生物化学和分子生物学研究中的一项基本技术，用于根据蛋白质的物理和化学特性将其从混合物中分离出来。

1. 离心分离法

离心分离法利用离心力来分离不同质量或密度的颗粒和分子。

差速离心：通过逐渐增加离心力，首先沉淀下大颗粒，然后是小颗粒。
速率区域离心：利用颗粒在离心力作用下沉降速度的差异进行分离。
平衡密度梯度离心：在离心管中形成密度梯度，颗粒根据其密度在梯度中达到平衡位置。
蔗糖密度梯度离心：使用蔗糖溶液形成密度梯度，用于分离细胞器或其他颗粒。

2. 液相色谱法

液相色谱法是一种柱层析技术，通过不同的相互作用力来分离蛋白质。

离子交换色谱：基于蛋白质表面电荷与固定相上的相反电荷之间的相互作用。分为阳离子交换（正电荷蛋白质吸附）和阴离子交换（负电荷蛋白质吸附）。
分子筛色谱：根据蛋白质的分子大小进行分离，小分子通过固定相，大分子被排除在外。
亲和层析：利用蛋白质与特定配体（如抗体、激素或底物类似物）之间的高亲和力进行分离。

3. 电泳分离法

电泳分离法根据蛋白质的电荷和/或大小进行分离。

SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS是一种去污剂，使蛋白质带负电荷并掩盖其大小差异，从而根据大小进行分离。
2D凝胶电泳：结合等电聚焦（根据等电点分离）和SDS-PAGE（根据大小分离），用于分离蛋白质的复杂混合物。

4. 高度特异性的酶和抗体测定

这些方法用于检测和纯化单个蛋白质。

免疫印迹：在电泳分离后，将蛋白质转移到膜上，然后用特异性抗体检测目标蛋白质。
免疫沉淀：利用抗体与目标蛋白质的特异性结合，通过沉淀抗体-蛋白质复合物来纯化蛋白质。

5. 蛋白质的三维结构测定

这些技术用于确定蛋白质的三维结构。

X射线晶体学：通过测量蛋白质晶体对X射线的衍射模式来确定其三维结构。
低温电子显微镜：在低温下使用电子显微镜观察蛋白质的二维图像，然后通过计算方法重建三维结构。
核磁共振波谱：利用核磁共振技术测量蛋白质中原子核的磁共振频率，以确定其三维结构。

6. 质谱法

质谱法是一种用于确定蛋白质分子量和序列的方法。

质谱：通过电离蛋白质并根据其质荷比（m/z）分离离子，然后检测和分析这些离子，以确定蛋白质的分子量和序列。

7. 放射性同位素

放射性同位素在生物分子检测中仍然有其应用，尤其是在追踪代谢途径和研究蛋白质合成方面。

这些方法各有优势和局限性，通常需要根据实验目的和蛋白质的特性来选择最合适的分离技术。

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二，蛋白质结构与功能

多肽的形成和稳定性受到多种分子间力的影响，对这些力的详细解释以及它们如何影响多肽和相关生物学过程的描述：

1. 共价键（Covalent Bonds）

肽键（Peptide Bonds）：连接氨基酸残基的酰胺键，具有部分双键性质，是多肽链的主要结构单元。肽键的典型距离约为1.5 Å，键解离自由能约为356 kJ/mole。
二硫键（Disulfide Bonds）：由两个半胱氨酸残基的硫原子形成，增强多肽链的稳定性。典型距离约为2.2 Å，键解离自由能约为167 kJ/mole。

2. 离子键（Ionic Bonds）

盐桥（Salt Bridges）：由带相反电荷的氨基酸残基（如赖氨酸和天冬氨酸）形成，有助于多肽链的折叠和稳定。典型距离约为2.8 Å，键解离自由能取决于盐桥的埋藏程度，可能在12.5-17 kJ/mole之间。

3. 氢键（Hydrogen Bonds）

氢键：由氢原子与电负性原子（如氧或氮）之间的吸引形成，对多肽链的二级结构（如α螺旋和β折叠）至关重要。典型距离约为3.0 Å，键解离自由能在水环境中为2-6 kJ/mole，如果供体或受体带电，则可能更高。

4. 范德华力（Van der Waals Interactions）

范德华力：非极性氨基酸残基之间的弱吸引力，对多肽链的三维结构稳定性有贡献。作用距离较短，典型距离约为3.5 Å，键解离自由能约为4 kJ/mole，且随着距离的增加迅速减小。

5. 疏水相互作用（Hydrophobic Interactions）

疏水相互作用：非极性氨基酸残基倾向于避免与水接触，这种趋势推动它们聚集在一起，有助于多肽链的折叠。这种力在多肽链的内部区域尤为显著，对蛋白质的稳定性和功能至关重要。

6. 长程静电相互作用（Long-range Electrostatic Interactions）

长程静电相互作用：依赖于介质的介电常数，在水中被屏蔽，具有1/r的依赖性。这种力在非极性区域可能非常强，但在水环境中非常弱。

这些力共同作用，决定了多肽链的折叠、稳定性和功能。例如，氢键和二硫键在稳定蛋白质的二级结构中起关键作用，而离子键和疏水相互作用则有助于蛋白质的三级结构形成。范德华力虽然较弱，但在蛋白质内部的稳定性中也发挥着重要作用。长程静电相互作用在调节蛋白质的溶解性和相互作用中也扮演着角色。

在生物学过程中，这些力的平衡对于蛋白质的正确折叠、稳定性和功能至关重要。例如，错误折叠的蛋白质可能导致功能丧失或疾病。通过理解这些力，科学家可以设计药物来干预蛋白质的折叠过程，治疗相关疾病。

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三，核酸的结构与功能

根据您提供的图片内容，以下是siRNA（小干扰RNA）和miRNA（微RNA）的详细介绍，以及它们之间的异同点分析：

miRNA（微RNA）

miRNA是一类内源性的小型非编码RNA分子，通常由18-25个核苷酸组成。它们在调控基因表达中发挥重要作用，特别是在转录后调控中。

miRNA的生成过程：

初级转录本（pri-miRNA）：由RNA聚合酶II和III转录产生，具有发夹环结构。
前体miRNA（pre-miRNA）：在细胞核内，由Drosha和DGCR8酶处理pri-miRNA，形成具有茎环结构的约70个核苷酸长的pre-miRNA。
核输出：pre-miRNA通过Exportin5和Ran-GTPase输出到细胞质。
成熟miRNA：在细胞质中，Dicer酶进一步切割pre-miRNA，形成成熟的双链miRNA。
RNA诱导的沉默复合体（RISC）：成熟的miRNA单链被整合到RISC中，其中miRNA的引导链与目标mRNA结合。

miRNA的作用机制：

miRNA与目标mRNA不完全互补配对，主要通过抑制mRNA的翻译来调控基因表达。
miRNA的2-7位核苷酸（种子序列）对于特异性识别目标mRNA至关重要。

siRNA（小干扰RNA）

siRNA是一类外源性的小型双链RNA分子，通常由21-23个核苷酸组成。它们在RNA干扰（RNAi）途径中发挥作用，用于沉默特定基因。

siRNA的生成过程：

双链RNA（dsRNA）：可以是外源性引入的，也可以是内源性产生的。
Dicer酶切割：Dicer酶将双链RNA切割成21-23个碱基对的siRNA片段。
RISC复合体：siRNA被整合到RISC中，单链siRNA引导RISC识别并切割含有互补序列的mRNA。

siRNA的作用机制：

siRNA与目标mRNA完全互补配对，导致mRNA的切割和降解，从而抑制基因表达。

miRNA与siRNA的异同点分析：

来源不同 ：
- miRNA来自基因组内编码的较长的初级转录本（pri-miRNA）。
- siRNA可以来自外源性双链RNA或内源性双链RNA。
作用结果不同 ：
- miRNA的"种子序列"位于5'端的2-7位核苷酸，与目标mRNA不完全配对，主要导致翻译抑制。
- siRNA与目标mRNA完全配对，导致mRNA的降解。
功能相似性 ：
- 两者都通过RISC复合体发挥作用，调控基因表达。
应用差异 ：
- miRNA在生物体内广泛存在，参与多种生物学过程。
- siRNA常用于实验室研究中，作为基因沉默的工具。

通过这些机制，miRNA和siRNA在调控基因表达、参与细胞分化、发育以及疾病发生等方面发挥着重要作用。

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四，DNA复制、转录：

DNA修复途径是细胞维护基因组稳定性和完整性的关键机制。以下是各主要DNA修复途径的详细解释与分析：

1. 直接修复机制

直接修复机制无需替换整个碱基或核苷酸，而是通过直接修复受损的碱基来恢复DNA的正常结构。

MGMT（甲基鸟嘌呤甲基转移酶）：该酶能够直接将6号位置的甲基（CH₃，O⁶-甲基鸟嘌呤）移除，恢复鸟嘌呤的正常结构。
光裂合酶：存在于细菌中，能够修复由紫外线引起的嘧啶二聚体，直接将受损的DNA或核苷酸还原，不需要另一股作为修复模板。

2. 碱基切除修复（BER）

碱基切除修复用于清除并修复异常或不应存在的碱基，防止在DNA复制过程中引发点突变。

该机制通过识别并切除受损碱基，随后通过DNA聚合酶和DNA连接酶来填补缺失的碱基。BER主要针对单个碱基的损伤，如氧化损伤、脱胺等。

3. 核苷酸切除修复（NER）

核苷酸切除修复主要修复影响大片区域染色体结构的DNA损伤，如嘧啶二聚体、DNA附加物和DNA交互连结等。

NER分为两种类型：

全基因组NER（GG-NER）：通过XPC-HR23B双合体识别全基因组范围内的DNA损伤，启动修复路径。
转录合并修复（TCR）：当RNA聚合酶在转录过程中遇到无法辨识的核苷酸损伤而停滞时，激活的修复机制。TCR能迅速招募NER相关修复蛋白，优先修复转录活跃区域的DNA损伤。

4. 错误配对修复（MMR）

错误配对修复负责校正DNA复制过程中发生的嘌呤-嘧啶错误配对，减少突变率。

MMR通过识别并切除错误配对的碱基，然后利用正确的模板链进行修复，确保基因组的准确复制。

5. 单股DNA断裂修复（SSBR）

单股DNA断裂修复机制与碱基切除修复使用相似的蛋白质，因此有时将其归入BER路径内。

该修复机制主要处理由于各种内外源因素引起的单链DNA断裂，恢复DNA的连续性和完整性。

6. 同源性重组（HR）

同源性重组修复依赖于细胞内的同源染色体或姊妹染色分体作为修复模板，以恢复DNA双股断裂。

HR在细胞周期的S期和G2期更为活跃，因为此时姊妹染色分体可作为高保真模板，减少修复过程中引入的错误。

7. 非同源性末端接合（NHEJ）

非同源性末端接合无需模板，直接将双股断裂的DNA末端连接起来。

虽然NHEJ修复速度快，但由于缺乏模板，其修复过程可能导致序列的插入或缺失，增加基因突变的风险。NHEJ在复杂基因组中较为活跃，也在免疫系统的V(D)J重组过程中发挥重要作用。

总结

不同的DNA修复途径各有其特定的修复目标和机制，协同作用以维护基因组的稳定性和细胞的正常功能。直接修复和BER主要处理小范围的碱基损伤，而NER则处理更大范围的结构损伤。MMR和SSBR则负责纠正复制错误和单链断裂。对于最为严重的双链断裂，HR和NHEJ提供了高保真和快速修复的选择，分别适应不同的细胞周期阶段和生物学需求。

Sources:
https://zh.wikipedia.org/wiki/DNA修復

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五，生物大分子相分离：

以下是每个实验的详细解释：

1. 相分离实验（Phase Separation Assays）

相分离实验用于研究生物大分子（如蛋白质和RNA）在特定条件下的相行为。实验步骤如下：

荧光标记：使用荧光染料标记蛋白质或RNA。
相分离诱导：通过改变浓度、温度、pH值、盐和溶质、RNA/DNA/配体的序列/结构等条件，诱导相分离。
液滴形成：观察到荧光标记的生物分子形成液滴。
液滴特性分析：分析液滴的数量、大小和形态。
溶解：使用解聚酶、RNA酶或1,6-己二醇（1,6-HD）等试剂溶解液滴。
多色标记：使用不同颜色的荧光标记来研究混合物的相容性、不相容性或多相结构。

2. FRAP（荧光恢复后光漂白）

FRAP用于测量荧光分子在光漂白后的恢复动力学，反映分子的流动性。

光漂白：使用激光照射特定区域，使荧光分子失去荧光。
恢复观察：监测漂白区域荧光的恢复。
恢复动力学：根据荧光恢复的速度，可以推断出分子的流动性和交换速率。

3. 液滴融合（Droplet Fusion）

液滴融合实验用于研究液滴之间的融合特性。

自由融合：液滴在没有外力作用下自然融合。
光镊：使用光镊技术操纵液滴，增加融合频率。
剪切应力：通过施加剪切应力促进液滴融合。
融合动力学：观察融合过程，分析融合的速率和效率。

4. 基于沉降的LLPS测定（Sedimentation-based LLPS Assay）

LLPS（液-液相分离）测定用于研究蛋白质或蛋白质复合物的相分离行为。

混合复合物：制备蛋白质或蛋白质复合物的混合溶液。
离心：通过离心分离上清液（S）和沉淀物（P）。
洗涤：洗涤沉淀物以去除未结合的分子。
SDS-PAGE分析：使用SDS-PAGE分析上清液和沉淀物中的蛋白质分布。

5. 微流变学（Microrheology）

微流变学用于测量软物质（如生物大分子溶液）的流变性质。

荧光标记：使用荧光标记的微珠作为探针。
追踪运动：追踪微珠在溶液中的运动。
扩散分析：分析微珠的均方位移与时间的关系，区分自由扩散和受限/粘弹性扩散。

6. 表面张力（Surface Tension）

表面张力测量用于研究液滴的表面特性。

直角成像：使用显微镜观察液滴的形态。
表面润湿：测量液滴在不同表面上的接触角。
表面张力拟合：根据液滴的高度和半径，拟合表面张力。

这些实验方法为研究生物大分子的相行为、流动性、融合特性以及流变性质提供了有力的工具。通过这些实验，可以深入理解生物大分子在细胞内的行为，以及它们如何参与细胞功能和疾病过程。

根据您提供的图片内容，以下是细胞过程中液液相分离（LLPS）的详细解释，参考RNA颗粒、信号传导、细胞粘附等生物学过程，并考虑LLPS的调控因素：

1. 液液相分离的预测与特征确定

预测：利用生物信息学工具预测蛋白质中可能参与相分离的区域。
2D/3D介质：在二维或三维介质中进行实验，以确定蛋白质的相分离特性。

2. 细胞内无膜细胞器（MLOs）的详细成像

分子扩散与交换：研究分子在MLOs中的扩散和交换特性，如融合、荧光恢复后光漂白（FRAP）等。
大小与形态：观察MLOs的大小和形态，以及它们在细胞内的时空分布。

3. MLOs的组成与功能

识别MLOs的组分：区分MLOs的支架蛋白和客户蛋白。
体外重建：在体外条件下重建MLOs，研究其形成和功能。

4. MLOs的功能

组成型：在细胞中持续存在的MLOs。
信号控制：响应特定信号而形成的MLOs。
应激诱导：在细胞应激条件下形成的MLOs。

5. 相分离的驱动力

多价性：来自串联结构域、低复杂度序列（LCDs）和客户蛋白的多价性。
相分离的介导：确定介导相分离的关键因素。

6. 相分离的调控

翻译后修饰（PTM）：如磷酸化、泛素化等，可以影响蛋白质的相分离行为。
pH值：细胞内pH值的变化可以影响蛋白质的电荷状态，进而影响相分离。
氧化还原状态：细胞内的氧化还原平衡可以调节蛋白质的相分离。
反馈循环：细胞内的反馈机制可以调节相分离过程，维持细胞内环境的稳定。

7. 相分离与生物功能的联系

遗传操作：通过敲除或突变关键组分，研究其对相分离的影响。
凝聚体的破坏：使用1,6-己二醇（1,6-HD）等试剂破坏凝聚体，观察细胞功能的变化。
功能恢复：通过嫁接（grafting）技术恢复功能，验证相分离在细胞功能中的作用。

8. 相分离的实验验证

体外和体内实验：通过体外和体内实验验证相分离的特征。
相图：构建相图，展示不同条件下相分离的状态。

9. 光遗传学工具的应用

光控凝聚体：使用光遗传学工具，如光敏蛋白，实现对凝聚体形成和解聚的精确控制。

通过这些步骤，研究人员可以深入理解液液相分离在细胞生物学过程中的作用，以及如何通过调控相分离来影响细胞功能。这对于研究RNA颗粒、信号传导、细胞粘附等生物学过程具有重要意义。

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六，糖生物学概论：

10种糖链修饰就有10种糖基转移酶

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七，生物正交化学与糖链标记技术

1，click chemistry：

最后一章节：

第一代可能不适合于用来做动物活体实验，

一价铜离子催化

Click反应概述

Click反应是一种高效的化学偶联反应，广泛应用于生物标记、药物合成和材料科学等领域。以下是对第一代、第二代和第三代Click反应的详细解释和分析：

第一代Click反应：CuAAC (Copper-catalyzed Azide-Alkyne 1,3-dipolar Cycloaddition)

反应机制：

叠氮化合物（Azide）与末端炔（Terminal Alkyne）在Cu(I)催化下进行1,3-偶极环加成反应，生成1,4-二取代1,2,3-三唑。

优点：

高产率、高区域选择性、广泛的底物适用性。
反应条件温和（室温、常压）。

缺点：

需要Cu(I)催化剂，可能对生物体系有毒。
在体内易产生活性氧（ROS），具有细胞毒性。

应用场景：

体外细胞实验（成像、蛋白质组学等）。

改进：

使用配体稳定Cu(I)，加速反应，降低Cu的毒性。

第二代Click反应：SPAAC (Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition)

反应机制：

利用环辛炔（Cyclic Alkyne）中的环张力，与叠氮化合物在无铜条件下迅速发生2+3环加成反应。

优点：

无铜催化，避免了Cu(I)的细胞毒性问题。
快速反应，适用于活体成像。

缺点：

需要特定的环辛炔底物，底物合成可能较复杂。

应用场景：

活体动物成像。

第三代Click反应：IEDDA (Inverse Electron-Demand Diels-Alder Cycloaddition)

反应机制：

四嗪（Tetrazine）与反式环辛烯（TCO）进行逆电子需求型Diels-Alder反应，生成稳定的四嗪-环辛烯加合物。

优点：

高生物相容性，无需催化剂，快速反应。
反应条件温和，适用于低浓度蛋白质修饰。

缺点：

需要特定的四嗪和TCO底物。

应用场景：

蛋白质修饰、活体成像。

比对分析

特性	CuAAC	SPAAC	IEDDA
催化剂	Cu(I)	无	无
底物	叠氮和末端炔	叠氮和环辛炔	四嗪和TCO
反应条件	室温、常压	室温、常压	室温、常压
细胞毒性	有	无	无
应用场景	体外实验	活体成像	蛋白质修饰、活体成像