TWAS / FUSION - 技术栈

FUSION 是一套用于执行转录组范围和调控组范围关联研究（TWAS 和 RWAS）的工具。它通过构建功能/分子表型的遗传成分的预测模型，并使用 GWAS 汇总统计数据预测和测试该成分与疾病的关联，目标是识别 GWAS 表型与仅在参考数据中测量的功能表型之间的关联。

1.主要功能与特点

TWAS 方法：基于基因表达的预测模型，识别基因表达与疾病之间的关联。
RWAS 方法：基于染色质可及性等调控组学数据，识别调控变异与疾病之间的关联。
预计算模型：提供来自多个研究的预计算预测模型，方便用户进行分析。
支持多种数据类型：包括单组织基因表达、多组织基因表达（如 GTEx v8）、跨组织表达（如 sCCA 方法）、肿瘤/正常组织表达（如 TCGA 数据）等。
灵活的分析流程：用户可以使用预计算的模型，也可以自行计算预测模型。

2.安装与依赖

软件包下载 ：从 GitHub 下载 FUSION 软件包。
LD 参考数据 ：下载 1000 Genomes LD 参考数据。
依赖库 ：
- R 包：optparse、RColorBrewer、plink2R。
- 如果计算自己的权重，还需要 glmnet、methods，以及 GCTA 和 PLINK2。
- 如果使用 BSLMM，需要安装 GEMMA。

3.典型分析流程

准备 GWAS 汇总统计数据：需符合 LD-score 格式，包含 SNP、A1、A2 和 Z 分数等字段。
准备表达权重文件：从预计算的权重文件中选择，或自行计算权重。
运行 FUSION 分析 ：使用 FUSION.assoc_test.R 脚本，指定 GWAS 数据、权重文件、参考 LD 数据等参数。
结果输出 ：生成包含基因-疾病关联统计量（如 TWAS Z 分数和 P 值）的输出文件。
典型分析流程是使用 FUSION 工具进行转录组范围关联研究（TWAS）的标准步骤。以下是一个详细的典型分析流程，以使用 PGC（精神病基因组学联盟）精神分裂症（SCZ）GWAS 汇总统计数据和 GTEx 全血数据为例：

3.1 安装 FUSION 软件

从 GitHub 下载 FUSION 软件包：

bash 复制代码

wget https://github.com/gusevlab/fusion_twas/archive/master.zip
unzip master.zip
cd fusion_twas-master

下载并解压 1000 Genomes LD 参考数据：
其主要目的是：
提供 SNP 之间的连锁不平衡信息，用于基因表达预测和 GWAS 数据的匹配。
支持 IMPG 算法填补缺失的 GWAS 统计信息。
提高分析的统计效能，确保 TWAS 分析的准确性和可靠性。
bash 复制代码
```
wget https://data.broadinstitute.org/alkesgroup/FUSION/LDREF.tar.bz2
tar xjvf LDREF.tar.bz2
```
下载并安装 plink2R 库：
目的：能够在 R 中有效地读取和处理 PLINK 文件，进而进行后续的遗传分析。
bash 复制代码
```
wget https://github.com/gabraham/plink2R/archive/master.zip
unzip master.zip
```

在 R 中安装必要的库：

R 复制代码

install.packages(c('optparse', 'RColorBrewer'))
install.packages('plink2R-master/plink2R/', repos = NULL)

3.2 准备 GWAS 汇总统计数据

下载 PGC 精神分裂症 GWAS 汇总统计数据：

bash 复制代码

wget https://data.broadinstitute.org/alkesgroup/FUSION/SUM/PGC2.SCZ.sumstats

3.3 准备表达权重文件

创建权重目录并下载 GTEx 全血表达权重：

bash 复制代码

mkdir WEIGHTS
cd WEIGHTS
wget https://data.broadinstitute.org/alkesgroup/FUSION/WGT/GTEx.Whole_Blood.tar.bz2
tar xjf GTEx.Whole_Blood.tar.bz2

3.4. 运行 FUSION 分析

3.4.1 检查输入文件

确保 GWAS 汇总统计数据符合 LD-score 格式：
- 包含 SNP（SNP 标识符）、A1（效应等位基因）、A2（其他等位基因）、Z（Z 分数）等字段。
确保权重文件路径正确，权重文件格式为 *.RDat。

3.4.2 运行 FUSION 分析脚本

在 FUSION 目录下运行以下命令，对第 22 号染色体进行分析：
bash 复制代码
```
Rscript FUSION.assoc_test.R \
--sumstats PGC2.SCZ.sumstats \
--weights ./WEIGHTS/GTEx.Whole_Blood.pos \
--weights_dir ./WEIGHTS/ \
--ref_ld_chr ./LDREF/1000G.EUR. \
--chr 22 \
--out PGC2.SCZ.22.dat
```
参数说明：
- --sumstats：GWAS 汇总统计数据文件路径。
- --weights：权重文件列表文件路径。
- --weights_dir：权重文件所在目录。
- --ref_ld_chr：按染色体分的 LD 参考数据文件前缀。
- --chr：分析的染色体编号。
- --out：输出文件路径。

3.5 分析结果解释

3.5.1 输出文件

输出文件 PGC2.SCZ.22.dat 包含以下内容：
- FILE：权重文件路径。
- ID：基因标识符。
- CHR：染色体编号。
- P0 和 P1：基因的起始和结束位置。
- HSQ：基因的遗传力。
- BEST.GWAS.ID 和 BEST.GWAS.Z：该基因所在区域中 GWAS 最显著的 SNP 及其 Z 分数。
- EQTL.ID 和 EQTL.Z：该基因所在区域中最佳 eQTL 的 SNP 及其 Z 分数。
- TWAS.Z 和 TWAS.P：TWAS Z 分数和 P 值，是主要的统计量。

3.5.2 结果解释

TWAS Z 分数：表示基因表达与疾病之间的关联强度。如果 Z 分数显著（例如 P 值小于阈值），则表明基因表达与疾病之间存在显著关联。
TWAS P 值：表示关联的显著性水平。例如，P 值小于 5e-8 表示基因表达与疾病之间的关联在全基因组水平上显著。
遗传力（HSQ）：表示基因表达的遗传力，即基因表达的遗传变异对表型变异的贡献比例。

3.6 后处理分析

3.6.1 提取显著关联

提取第 22 号染色体上转录组范围显著的关联：
bash 复制代码
```
cat PGC2.SCZ.22.dat | awk 'NR == 1 || $NF < 0.05/2058' > PGC2.SCZ.22.top
```

3.6.2 进行联合/条件检验

使用 FUSION.post_process.R 脚本进行联合和条件检验：
bash 复制代码
```
Rscript FUSION.post_process.R \
--sumstats PGC2.SCZ.sumstats \
--input PGC2.SCZ.22.top \
--out PGC2.SCZ.22.top.analysis \
--ref_ld_chr ./LDREF/1000G.EUR. \
--chr 22 \
--plot --locus_win 100000
```
参数说明：
- --input：TWAS 分析结果文件。
- --out：输出文件路径。
- --plot：生成可视化图表。
- --locus_win：定义基因所在区域的窗口大小（以碱基对为单位）。

3.6.3 结果解释

联合检验：识别在同一区域内多个基因表达与疾病的联合关联。
条件检验：识别在控制其他基因表达后，某个基因表达与疾病的独立关联。
可视化图表：包括曼哈顿图、散点图等，展示 GWAS 信号与预测基因表达的关系。

3.7 进一步分析

3.7.1 细映射（Fine-mapping）

使用 FOCUS 方法对多个 TWAS 关联进行细映射，识别因果基因。

3.7.2 估计基因表达介导的遗传力

使用 MESC 工具估计疾病遗传力中由基因表达介导的部分。

3.7.3 条件显著性检验（Permutation Test）

使用 --perm 参数进行置换检验，评估 TWAS 关联是否由随机共定位引起。

3.7.4 多参考面板的联合检验（Omnibus Test）

使用 --omnibus 参数对来自多个参考面板的预测结果进行联合检验。

3.7.5 共定位分析（Colocalization Analysis）

使用 --coloc_P 参数与 COLOC 软件接口进行共定位分析。

4.输出结果解读

TWAS Z 分数：表示基因表达与疾病关联的统计量，是主要关注指标。
TWAS P 值：表示关联的显著性。
其他指标：包括基因的遗传力（heritability）、最佳 GWAS SNP、最佳 eQTL 等信息。

5.预计算模型下载

单组织基因表达：如 NTR 外周血、YFS 全血等。
GTEx v8 多组织表达：提供多种组织的基因表达权重，分为"显著遗传力基因"和"所有基因"两种版本。
跨组织表达（sCCA）：基于 GTEx 数据的稀疏典型相关分析（sCCA）生成的跨组织特征权重。
TCGA 肿瘤/正常表达：基于 TCGA 数据的肿瘤 RNA-seq 数据生成的种系基因表达模型。
多情境（CONTENT）表达：基于 GTEx 组织和 CLUES 单细胞数据的情境特异性权重。

6.自定义权重计算

输入数据：需要 PLINK 格式的基因型数据（bed/bim/fam 文件）和基因表达数据。
运行脚本 ：使用 FUSION.compute_weights.R 脚本，指定输入文件、临时文件路径、输出路径等参数。
支持的模型：包括 BLUP、BSLMM、LASSO、Elastic Net 和 top1 等。

7.后处理分析

联合/条件检验 ：使用 FUSION.post_process.R 脚本，对 TWAS 结果进行联合检验和条件分析，识别独立的关联信号。
可视化：生成曼哈顿图、散点图等，展示 GWAS 信号与预测基因表达的关系。
其他分析：如多参考面板的联合检验（omnibus test）、与 COLOC 软件的接口进行共定位分析等。

8.常见问题解答（FAQ）

数据匹配：确保 GWAS 数据、权重文件和参考 LD 数据的 SNP 一致。
LD 参考面板：可以使用自己的 LD 参考面板，但需要与权重文件的 SNP 匹配。
结果验证：推荐通过外部研究进行验证，或使用基因风险评分进行聚合分析。
效应方向解释：TWAS 效应方向表示基因表达与疾病表型的遗传协方差关系。