2025.06.20【pacbio】|使用Snakemake构建可重复的PacBio全基因组甲基化分析流程

文章目录

- 引言
- 准备工作
- - [1. 软件依赖](#1. 软件依赖)
  - [2. 数据与文件](#2. 数据与文件)
  - - [a. 样本信息文件 `samples.tsv`](#a. 样本信息文件 samples.tsv)
    - [b. 配置文件 `config.yaml`](#b. 配置文件 config.yaml)
- Snakemake流程详解
- - [`rule all`: 终极目标](#rule all: 终极目标)
  - [`rule reference_index`: 创建基因组索引](#rule reference_index: 创建基因组索引)
  - [`rule extract_kinetics` (可选但推荐)](#rule extract_kinetics (可选但推荐))
  - [`rule align_to_reference`: 序列比对](#rule align_to_reference: 序列比对)
  - [`rule detect_modifications`: 检测DNA修饰](#rule detect_modifications: 检测DNA修饰)
  - [`rule find_motifs` & `reprocess_motifs`: 寻找并重处理修饰基序](#rule find_motifs & reprocess_motifs: 寻找并重处理修饰基序)
  - 覆盖度分析系列规则
  - [`rule collect_results`: 结果汇总](#rule collect_results: 结果汇总)
- 如何运行流程
- 结果解读
- 总结与展望

引言

随着三代测序技术，特别是PacBio SMRT测序的成熟，我们不再仅仅满足于读取DNA的ATCG序列。PacBio测序能够直接检测DNA分子上的化学修饰，如甲基化，为表观遗传学研究打开了新的大门。DNA甲基化在基因表达调控、基因组印记、胚胎发育等众多生命活动中扮演着至关重要的角色。

然而，一个完整的甲基化分析项目涉及多个步骤、多种软件和大量数据，手动操作不仅繁琐、耗时，而且容易出错，难以保证结果的可重复性。为了解决这一痛点，我们引入了强大的工作流管理工具------Snakemake。

本文将详细介绍如何利用您提供的一个功能完善的Snakefile，构建一个从PacBio原始数据到最终甲基化报告的全自动化、可重复的分析流程。

准备工作

在开始之前，请确保已经准备好以下软件和数据。

1. 软件依赖

本流程依赖于一系列生物信息学软件。推荐使用conda来管理这些软件环境，以避免版本冲突。

Snakemake : 工作流管理系统。 (conda install -c bioconda snakemake)
PacBio SMRT Tools : PacBio官方分析工具套件，核心工具包括pbmm2 (比对), ipdSummary (检测修饰), motifMaker (寻找基序)。
Samtools : 处理SAM/BAM文件的常用工具。(conda install -c bioconda samtools)
Bedtools : 处理基因组区间文件的工具集。(conda install -c bioconda bedtools)
R: 用于数据处理和可视化，特别是绘制覆盖度图。

2. 数据与文件

您需要准备以下文件，并按照指定的目录结构放置：

复制代码

.
├── raw_data/
│   ├── sample1.subreads.bam  # 您的PacBio原始BAM文件
│   └── sample2.subreads.bam
├── reference/
│   └── hg38.fasta            # 参考基因组FASTA文件
└── workflow/
    ├── Snakefile             # 我们即将详细解析的主角
    ├── config.yaml           # 流程配置文件
    ├── samples.tsv           # 样本信息文件
    └── scripts/
        └── reads_depth.R     # 绘制覆盖度的R脚本

a. 样本信息文件 `samples.tsv`

这是一个制表符分隔的文件，用于定义样本ID和对应的原始BAM文件路径。

tsv 复制代码

sample_id	bam_path
sample1	/path/to/raw_data/sample1.subreads.bam
sample2	/path/to/raw_data/sample2.subreads.bam

b. 配置文件 `config.yaml`

这是流程的"控制中心"，您可以在此调整所有关键参数，而无需修改Snakefile本身。

yaml 复制代码

# 工作目录
workdir: "/path/to/your/project"

# 参考基因组
reference:
  genome: "/path/to/reference/hg38.fasta"

# 软件路径 (如果不在环境变量中)
software:
  pbmm2: "pbmm2"
  smrtlink: "/path/to/smrtlink/smrtcmds/bin" # SMRT Link工具目录

# 线程数
threads: 16

# 甲基化分析参数
methylation:
  pvalue: 0.001
  modifications: "m6A,m4C" # m5C需要特定模型
  chemistry: "S/P2-C2/5.0"
  motif_min_score: 30
  significant_coverage: 10
  significant_fraction: 0.3

# 覆盖度分析参数
coverage:
  bin_size: 100000
  max_depth: 300

Snakemake流程详解

下面，我们将逐一解析Snakefile中的每一个rule，揭示其在整个分析流程中的作用。

`rule all`: 终极目标

这是流程的入口点，它定义了我们希望最终生成的全部文件。当您运行Snakemake时，它会反向推导，执行所有必要的步骤来创建这些目标文件。

`rule reference_index`: 创建基因组索引

目的: 为参考基因组创建索引，这是后续比对步骤所必需的。

samtools faidx: 创建.fai索引，用于快速访问基因组序列。
pbmm2 index: 为pbmm2比对工具创建专门的.mmi索引。

python 复制代码

# rule reference_index in Snakefile
rule reference_index:
    input:
        ref = config["reference"]["genome"]
    output:
        fai = config["reference"]["genome"] + ".fai",
        mmi = config["reference"]["genome"] + ".mmi"
    threads: config["threads"]
    shell:
        """
        samtools faidx {input.ref}
        {config[software][pbmm2]} index --preset SUBREAD {input.ref} {output.mmi}
        """

`rule extract_kinetics` (可选但推荐)

目的: 从原始BAM文件中提取并处理动力学信息(kinetics)。这是识别碱基修饰的基础。

ccs-kinetics-bystrandify: 一个用于处理动力学信息的工具，确保信息与链对应。
pbindex: 为生成的BAM文件创建.pbi索引。

python 复制代码

# rule extract_kinetics in Snakefile
rule extract_kinetics:
    input:
        bam = lambda wildcards: samples.loc[wildcards.sample, "bam_path"]
    output:
        bam = "{sample}.kinetics.bam",
        bai = "{sample}.kinetics.bam.pbi"
    threads: config["threads"]
    shell:
        """
        ccs-kinetics-bystrandify -j {threads} {input.bam} {output.bam}
        pbindex {output.bam}
        """

`rule align_to_reference`: 序列比对

目的: 将包含了动力学信息的PacBio reads比对到参考基因组。

pbmm2 align: 使用--preset SUBREAD模式进行比对，并进行排序。
samtools view | awk | samtools view: 这是一个巧妙的处理，用于在BAM头文件中添加PL:PACBIO等信息。某些下游SMRT tools需要这些信息来识别数据来源。

python 复制代码

# rule align_to_reference in Snakefile
rule align_to_reference:
    input:
        bam = "{sample}.kinetics.bam",
        mmi = config["reference"]["genome"] + ".mmi"
    output:
        bam = "{sample}.kinetics.align.bam",
        bai = "{sample}.kinetics.align.bam.pbi"
    threads: config["threads"]
    shell:
        """
        {config[software][pbmm2]} align --preset SUBREAD --sort --sample {wildcards.sample} \
        -j {threads} -J {threads} {input.mmi} {input.bam} {output.bam}
        pbindex {output.bam}
        
        # 确保BAM文件包含化学反应信息
        samtools view -h {output.bam} | \
        awk '{{if($0 ~ /^@/) {{if($0 !~ /^@RG/) print $0; else print $0"\\tPL:PACBIO\\tPM:SEQUEL\\tCM:S/P2-C2/5.0"}} else print $0}}' | \
        samtools view -bS - > {wildcards.sample}.temp.bam
        mv {wildcards.sample}.temp.bam {output.bam}
        pbindex {output.bam}
        """

`rule detect_modifications`: 检测DNA修饰

目的: 这是流程的核心。基于比对后BAM文件中的IPD（脉冲间期）信息，识别出被修饰的碱基位点。

ipdSummary: SMRT Link中的工具，用于统计IPD信息，并通过统计检验（p-value）识别m6A, m4C等修饰。
输出 :
- .gff: 记录每个修饰位点的详细信息。
- .csv: CSV格式的修饰位点列表。
- .bigwig: 可在基因组浏览器（如IGV）中可视化修饰信号。

python 复制代码

# rule detect_modifications in Snakefile
rule detect_modifications:
    # ... (inputs, outputs, threads, params)
    shell:
        """
        mkdir -p 02.align/methylome/{wildcards.sample}
        {config[software][smrtlink]}/ipdSummary \
        {input.bam} --reference {input.ref} --gff {output.gff} --csv {output.csv} \
        --bigwig {output.bigwig} --pvalue {params.pvalue} --numWorkers {threads} \
        --identify {params.mods} --methylFraction --identify-only \
        --chemistry {params.chemistry}
        """

`rule find_motifs` & `reprocess_motifs`: 寻找并重处理修饰基序

目的: 甲基化修饰通常发生在特定的序列模式（motif）中。这两步旨在找出这些motif。

motifMaker find: 从basemods.gff文件中发现与修饰相关的motif。
motifMaker reprocess: 利用发现的motif信息，重新注释GFF文件，使其包含motif信息。

python 复制代码

# rule find_motifs & reprocess_motifs in Snakefile
rule find_motifs:
    # ...
    shell:
        """
        {config[software][smrtlink]}/motifMaker find \
        -f {input.ref} -g {input.gff} -o {output.csv} \
        -j {threads} --minScore {params.min_score}
        """

rule reprocess_motifs:
    # ...
    shell:
        """
        {config[software][smrtlink]}/motifMaker reprocess \
        -f {input.ref} -g {input.gff} -m {input.csv} -o {output.gff}
        """

覆盖度分析系列规则

目的: 评估测序深度在全基因组的分布情况。

prepare_coverage_regions: 使用bedtools makewindows将基因组切分为固定大小的窗口（bins）。
calculate_coverage: 使用samtools bedcov计算每个窗口内的read覆盖数。
plot_coverage: 调用R脚本，将覆盖度数据绘制成直观的PDF和PNG图表。

`rule collect_results`: 结果汇总

目的 : 将散落在中间目录的、最重要的结果文件，统一收集到一个result目录中，方便查看和交付。

使用Python的shutil和os模块进行文件复制和软链接创建。
对齐的BAM文件由于体积较大，采用创建软链接（os.symlink）的方式，节约磁盘空间。

如何运行流程

一切准备就绪后，只需在workflow目录下执行一条命令：

bash 复制代码

# 进入工作流目录
cd workflow

# 预演，检查流程是否能正确构建DAG（有向无环图）
snakemake -np

# 在本地执行，使用8个核心
snakemake --cores 8

# 如果您有集群环境，还可以提交到集群
# snakemake --cluster "qsub -q xxx" --jobs 100

Snakemake会自动分析依赖关系，从头开始或从中断的地方继续执行所有必要的步骤。

结果解读

流程运行结束后，所有精华都汇集在result目录中：

result/02.Modification/{sample}/:
- *.significant.bed.xls: 核心结果。高可信度的甲基化位点，包含染色体、位置、深度、链、修饰类型(m6A/m4C)和甲基化比例。
- motifs.csv: 核心结果。鉴定出的甲基化修饰基序。
- *.basemods.gff: 完整的GFF格式结果，可导入IGV进行可视化。
- *.kinetics.align.bam: 最终比对文件，可与GFF一同在IGV中查看，验证单个read的甲基化状态。
result/02.Modification/{sample}/mapping_stat/:
- *.png/.pdf: 全基因组测序深度分布图。

总结与展望

通过本文介绍的Snakemake流程，您可以实现PacBio甲基化数据分析的"一键化"运行。其优势在于：

自动化: 无需手动执行每一步。
可重复性: 相同的输入和配置保证得到相同的结果。
可扩展性: 轻松增减样本，或在现有流程基础上添加新的分析步骤（如差异甲基化分析）。
清晰的参数管理 : 所有参数集中在config.yaml中，一目了然。

希望这篇详细的指南能帮助您在表观遗传学的研究道路上走得更远。

2025.06.20【pacbio】|使用Snakemake构建可重复的PacBio全基因组甲基化分析流程

文章目录

引言

准备工作

1. 软件依赖

2. 数据与文件

a. 样本信息文件 samples.tsv

b. 配置文件 config.yaml

Snakemake流程详解

rule all: 终极目标

rule reference_index: 创建基因组索引

rule extract_kinetics (可选但推荐)

rule align_to_reference: 序列比对

rule detect_modifications: 检测DNA修饰

rule find_motifs & reprocess_motifs: 寻找并重处理修饰基序

覆盖度分析系列规则

rule collect_results: 结果汇总

如何运行流程

结果解读

总结与展望

a. 样本信息文件 `samples.tsv`

b. 配置文件 `config.yaml`

`rule all`: 终极目标

`rule reference_index`: 创建基因组索引

`rule extract_kinetics` (可选但推荐)

`rule align_to_reference`: 序列比对

`rule detect_modifications`: 检测DNA修饰

`rule find_motifs` & `reprocess_motifs`: 寻找并重处理修饰基序

`rule collect_results`: 结果汇总