RSEM v1.3.3安装与使用--生信工具086

RSEM 完整使用文档

软件简介
编译与安装
使用教程
多数据库参考基因组构建（RefSeq / Ensembl / GENCODE）
非常规物种参考库构建
表达定量计算
结果可视化
实操案例
测序数据模拟
Trinity 转录本--基因映射文件生成
差异表达分析
pRSEM 先验增强版 RSEM
作者、致谢与开源协议

1. 软件简介

RSEM 是一款基于 RNA-Seq 数据，精准定量 ** 基因与可变剪接异构体（isoform）** 表达量的工具包。

核心特性

友好命令行交互，支持多线程 EM 算法并行计算
兼容单端 / 双端测序、质量值、可变长度读段、RSPD 分布估算
输出表达量后验均值与 95% 置信区间
支持生成转录本坐标 / 基因组坐标的 BAM、Wiggle 文件
结果可直接导入 UCSC Genome Browser、IGV 可视化
专属脚本输出 PDF 格式转录本覆盖度图谱，支持唯一读段（黑色）/ 多重比对读段（红色）分层展示
支持测序模型训练与可视化、内置 RNA-Seq 数据模拟器

2. 编译与安装

基础编译

复制代码

make

Cygwin 环境编译

复制代码

make cygwin=true

编译内置差异分析工具 EBSeq

复制代码

make ebseq

简易安装

方式 1：直接将 RSEM 目录写入环境变量 PATH方式 2：一键安装至系统目录

复制代码

make install

默认安装路径：/usr/local/bin
自定义安装目录：通过 DESTDIR 与 prefix 指定

make install DESTDIR=/home/my_name prefix=/software

本例安装路径：/home/my_name/software/bin

⚠️ 注意make install 不会安装 EBSeq 配套脚本 （rsem-generate-ngvector / rsem-run-ebseq / rsem-control-fdr），但差异分析矩阵工具 rsem-generate-data-matrix 会正常安装。

依赖环境

必须：C++、Perl、R
GFF3 注释解析：额外需要 Python
序列比对：提前安装 Bowtie / Bowtie2 / STAR / HISAT2

3. 使用教程

RSEM 分析分为两大核心步骤：

rsem-prepare-reference：构建转录本参考库
rsem-calculate-expression：比对 + 表达定量

3.1 参考序列准备

输入 1：基因组序列 + GTF/GFF3 注释文件（推荐）
输入 2：直接提供转录本序列

补充说明：UCSC Table Browser 导出的 GTF 缺少转录本 - 基因对应关系 ；若使用 UCSC Genes 注释，需额外下载 knownIsoforms.txt 补全关联信息。

查看帮助文档：

复制代码

rsem-prepare-reference --help

4. 主流数据库参考库构建

4.1 RefSeq 注释（人 / 鼠通用）

下载基因组 + GFF3 注释

ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/vertebrate_mammalian/Homo_sapiens/all_assembly_versions/GCF_000001405.31_GRCh38.p5/GCF_000001405.31_GRCh38.p5_genomic.fna.gz
ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/refseq/vertebrate_mammalian/Homo_sapiens/all_assembly_versions/GCF_000001405.31_GRCh38.p5/GCF_000001405.31_GRCh38.p5_genomic.gff.gz
提取一级组装序列（去除冗余补丁 / 单倍型）

rsem-refseq-extract-primary-assembly GCF_000001405.31_GRCh38.p5_genomic.fna GCF_000001405.31_GRCh38.p5_genomic.primary_assembly.fna
构建 RSEM 参考 + Bowtie 索引

rsem-prepare-reference --gff3 GCF_000001405.31_GRCh38.p5_genomic.gff
--trusted-sources BestRefSeq,Curated\ Genomic
--bowtie
GCF_000001405.31_GRCh38.p5_genomic.primary_assembly.fna
ref/human_refseq

--trusted-sources：仅解析高可信 RefSeq 注释来源
--gff3-RNA-patterns：可限定提取 mRNA、rRNA 等 RNA 类型
建议定量时加 --append-names，优化基因名可读性

4.2 Ensembl 注释

下载数据

ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-83/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz
ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-83/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.83.gtf.gz
构建参考库

rsem-prepare-reference --gtf Homo_sapiens.GRCh38.83.gtf
--bowtie
Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa
ref/human_ensembl

若强行使用 GFF3 格式，需加参数：--gff3-RNA-patterns transcript

4.3 GENCODE 注释（人 / 鼠专用）

下载数据

ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_human/release_24/GRCh38.primary_assembly.genome.fa.gz
ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_human/release_24/gencode.v24.annotation.gtf.gz
构建参考库

rsem-prepare-reference --gtf gencode.v24.annotation.gtf
--bowtie
GRCh38.primary_assembly.genome.fa
ref/human_gencode

5. 非常规物种参考库构建

适用于病毒、小众物种：仅有基因注释、无独立转录本注释。添加 --gff3-genes-as-transcripts，将单个基因视作 1 条转录本。

复制代码

rsem-prepare-reference --gff3 virus.gff \
               --gff3-genes-as-transcripts \
               --bowtie \
               virus.genome.fa \
               ref/virus

6. 表达定量计算

查看帮助：

复制代码

rsem-calculate-expression --help

6.1 单端数据定量

单端数据需手动指定片段长度分布，保证定量准确度：

--fragment-length-mean：片段平均长度
--fragment-length-sd：片段长度标准差

6.2 更换比对软件

Bowtie2：--bowtie2
STAR：--star
HISAT2：--hisat2-hca

6.3 外部比对 BAM/ SAM 导入

先用 RSEM 生成的 reference_name.idx.fa 构建索引
比对输出 SAM/BAM/CRAM
加 --alignments 参数直接输入比对文件

6.4 比对文件合法性校验

复制代码

rsem-sam-validator input.bam
convert-sam-for-rsem --help

⚠️ RSEM 不支持含插入缺失的空位比对。

7. 结果可视化

7.1 BAM 文件输出

默认：生成转录本坐标 BAM
--output-genome-bam：额外生成基因组坐标 BAM
自带 SAMtools，自动排序 + 生成索引

7.2 转录本 BAM 转基因组 BAM

复制代码

rsem-tbam2gbam reference_name unsorted_transcript_bam_input genome_bam_output

7.3 生成 Wiggle 覆盖度文件

复制代码

rsem-bam2wig sorted_bam_input wig_output wiggle_name [--no-fractional-weight]

7.4 IGV 加载转录本坐标文件

导入自定义基因组：选用 reference_name.idx.fa
加载 wiggle/BAM 文件
大文件需用 igvtools 转换为 tdf 格式

7.5 转录本覆盖度 PDF 绘图

复制代码

rsem-plot-transcript-wiggles --help

7.6 测序模型可视化

输出片段分布、测序错误、比对统计等图表

复制代码

rsem-plot-model sample_name output_plot_file

8. 完整实操案例

以小鼠单端数据、限定片段长度、输出置信区间 + 基因组 BAM 为例：

复制代码

# 1. 构建参考
rsem-prepare-reference --gtf mm9.gtf --transcript-to-gene-map knownIsoforms.txt --bowtie --bowtie-path /sw/bowtie /data/mm9 /ref/mouse_0

# 2. 表达定量
rsem-calculate-expression --bowtie-path /sw/bowtie --phred64-quals --fragment-length-mean 150.0 --fragment-length-sd 35.0 -p 8 --output-genome-bam --calc-ci --ci-memory 1024 /data/mmliver.fq /ref/mouse_0 mmliver_single_quals

# 3. 生成wiggle文件
rsem-bam2wig mmliver_single_quals.sorted.bam mmliver_single_quals.sorted.wig mmliver_single_quals

# 4. 批量基因覆盖度绘图
rsem-plot-transcript-wiggles --gene-list --show-unique mmliver_single_quals gene_ids.txt output.pdf 

# 5. 模型统计绘图
rsem-plot-model mmliver_single_quals mmliver_single_quals.models.pdf

9. RNA-Seq 数据模拟

基于真实样本训练的模型，模拟测序读段，用于算法测试。

复制代码

rsem-simulate-reads reference_name estimated_model_file estimated_isoform_results theta0 N output_name [-q]

参数说明

theta0：背景噪音读段比例
N：模拟总读段数
输出：模拟 FASTQ/FASTA + 模拟定量结果

模拟命令示例

复制代码

rsem-simulate-reads /ref/mouse_0 mmliver_single_quals.stat/mmliver_single_quals.model mmliver_single_quals.isoforms.results 0.2 50000000 simulated_reads

10. Trinity 组装转录本映射文件

无参转录组专用，快速生成 transcript-to-gene-map：

复制代码

extract-transcript-to-gene-map-from-trinity trinity_fasta_file map_file

11. 差异表达分析

工具优势

edgeR / DESeq 不考虑多比对模糊性 ；RSEM 内置 EBSeq 经验贝叶斯模型，适配可变剪接、无参组装转录组差异分析。

前置编译

复制代码

make ebseq

核心流程

无参转录组先运行：rsem-generate-ngvector
批量表达矩阵提取

rsem-generate-data-matrix sampleA.genes.results sampleB.genes.results > output_name.counts.matrix
批量差异检验 + FDR 校正

rsem-run-ebseq --help
rsem-control-fdr --help

12. pRSEM 先验增强版 RSEM

简介

pRSEM 整合 ChIP-seq 等表观数据，优化多重比对读段分配，提升定量准确性。

编译

复制代码

make pRSEM

依赖系统

Linux 平台
Perl ≥5.8.8 / Python ≥2.7.3 / R ≥3.3.1
依赖 R 包：data.table、GenomicRanges、ShortRead、SPP、IDR

核心运行命令

复制代码

rsem-prepare-reference --gtf mm9.gtf \
                       --star \
                       --star-path /sw/STAR \
                       -p 8 \
                       --prep-pRSEM \
                       --bowtie-path /sw/bowtie \
                       --mappability-bigwig-file /data/mm9.bigWig \
                       /data/mm9 \
                       /ref/mouse_0

rsem-calculate-expression --star \
                          --star-path /sw/STAR \
                          --calc-pme \
                          --run-pRSEM \
                          --chipseq-target-read-files /data/mmliver_PolIIRep1.fq.gz,/data/mmliver_PolIIRep2.fq.gz \
                          --chipseq-control-read-files /data/mmliver_ChIPseqCtrl.fq.gz \
                          --bowtie-path /sw/bowtie \
                          -p 8 \
                          /data/mmliver.fq \
                          /ref/mouse_0 \
                          mmliver_single_quals