抗人HE4单克隆抗体的纯化实验流程与参数解析

一、背景

人附睾蛋白4（HE4）是卵巢癌早期诊断的重要标志物。高亲和力、高特异性的抗HE4单克隆抗体是免疫层析试剂盒的核心原料。本文基于文献报道，复现并解析抗HE4单抗的纯化全过程。

二、实验材料

腹水来源：BALB/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞（3F7、3E5、5F10）后收集
纯化介质：Protein A Sepharose（GE Healthcare）
缓冲液：结合缓冲液（PBS, pH 7.4）、洗脱缓冲液（0.1 M甘氨酸-HCl, pH 2.7）、中和液（1 M Tris-HCl, pH 9.0）
检测设备：SDS-PAGE电泳仪、紫外分光光度计

三、纯化步骤

腹水预处理：腹水5000 rpm离心10 min，取上清，用0.45 μm滤膜过滤。
柱平衡：Protein A柱用5倍柱体积的PBS平衡，流速1 mL/min。
上样：腹水样品以0.5 mL/min流速上样，使抗体与蛋白A结合。
洗涤：用10倍柱体积的PBS洗去未结合蛋白，至A280基线平稳。
洗脱：用甘氨酸-HCl洗脱，收集出现峰值的流出液，立即加入中和液调节pH至7.4。
换液浓缩：用超滤管（30 kDa cutoff）将抗体置换到PBS中，并测定浓度。

四、纯度鉴定（SDS-PAGE）

取纯化前后样品进行还原性SDS-PAGE（12%分离胶）。结果如图1所示：

泳道1：Marker
泳道2：纯化前腹水（多条杂带）
泳道3：纯化后3F7抗体（55 kDa重链、20 kDa轻链，无杂带）

ImageJ灰度分析显示纯度>94%，符合诊断试剂要求。

图1 SDS-PAGE电泳结果，标注抗体轻链和重链位置

五、亲和力与表位分析

采用生物传感器（BLI）测定亲和力，结果如下：

3F7：KD = 252 pM
3E5：KD = 89 pM
5F10：KD = 104 pM

ELISA相加实验表明，3F7与5F10识别不同表位（AI>10%），而3F7与3E5表位重叠（AI<10%）。因此后续侧向层析试剂盒选用3F7（包被）和5F10（标记）配对。

六、讨论与注意事项

洗脱液pH低于3.0时可能对抗体活性有影响，建议快速中和并置于冰上。
若纯度不足，可增加一步离子交换层析（如DEAE）进行精纯。
纯化后抗体应分装冻存于-80℃，避免反复冻融。

七、总结

本文详细记录了从腹水中纯化抗HE4单抗的实验参数和结果，可供从事诊断抗体开发的实验人员参考。

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来源： $1$ DOI :10.13406/j.cnki.cyxb.003933