近十年，液体活检技术因其无创性、便捷性和可重复性等优势，在疾病诊断、治疗检测和预后评估等领域持续展现出巨大潜力。其中，**cfDNA（细胞游离DNA，cell-free DNA）**作为液体活检的重要组成部分，为疾病的早期诊断和精准治疗提供了新的视角。cfDNA是指存在于血液等体液中的游离DNA片段，携带了来自肿瘤细胞、胎儿细胞等多种来源的遗传信息。全基因组甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS）作为DNA甲基化研究的金标准1-2，通过重亚硫酸盐Bisulfite处理，描绘全基因组单碱基分辨率的DNA甲基化图谱。
表观生物提供cfWGBS测序服务（cfDNA全基因组甲基化测序），为深入解析疾病发生发展机制、寻找新型生物标志物和指导个性化治疗方案提供了强大的工具。
技术原理
图1. WGBS技术流程3
**步骤：**①从目标样本中提DNA；②将提取的DNA用亚硫酸盐进行处理。在这个过程中，未甲基化的胞嘧啶（C）会被转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶（mC）则保持不变；③将亚硫酸盐转化后的DNA片段化，并在片段两端连接测序接头，构建DNA文库；④构建好且质检合格的DNA文库进行高通量测序；⑤序列比对和数据分析：将测序得到的reads与参考基因组进行比对，并根据C和T的比例来确定每个胞嘧啶的甲基化水平
技术应用
1.绘制全基因组单碱基分辨率甲基化图谱
2.研究胚胎发育、衰老等生理活动发展的表观遗传机制
3.研究疾病相关甲基化分子标志物，如肿瘤早期诊断
技术优势
1.精准鉴定CpG富集位点 ，达到单碱基分辨率
2.覆盖全基因组，获得的甲基化信息更完整，是DNA甲基化研究的金标准
3.无创性，相较传统的组织活检，cfWGBS仅需采集血液样本
送样要求
样本类型：
1.血浆/血清，1~4ml/样本
2.cfDNA，≥15ng
**样本物种：**仅限人、大小鼠，其他物种需评估
分析内容
1.基因组比对统计
- 整体甲基化水平评估
2.1平均甲基化水平
2.2甲基化分布图
- 甲基化位点统计及样本间比较
3.1 甲基化水平相关性分析
3.2 甲基化水平主成分分析(PCA)
3.3 甲基化水平聚类分析
- 差异甲基化分析
4.1 差异甲基化区域注释
4.2 差异甲基化区域长度分布
4.3 差异甲基化区域甲基化水平分布
4.4 差异甲基化区域甲基化水平聚类热图
4.5 差异甲基化区域可视化
4.6 差异甲基化区域相关基因GO、KEGG富集分析
实测数据
图1. 甲基化位点水平分布图
图2. 基因元件甲基化图
图3. TSS平均甲基化图
图4. DMR类型分布图
图5. KEGG分析条形图
研究案例
案例一：
Nat Commun：多模态cfDNA甲基化组分析助力食管鳞癌及癌前病变的早期检测 4
这项研究使用WGBS技术对来自非转移性食管鳞癌（ESCC）患者、癌前病变患者以及健康对照的460份cfDNA样本进行分析，旨在开发一种名为扩展多模态分析（EMMA）的新方法，用于ESCC的早期检测。研究人员首先通过WGBS数据识别了ESCC相关的差异甲基化区域（DMR）并构建了ESCC-cfMeth评分模型，并在训练集和验证集中均取得了良好区分性能。
图7. 研究总概
此外，他们还开发了一种基于WGBS数据识别cfDNA中拷贝数变异（CNV）的方法，发现ESCC患者cfDNA的CNV显著高于健康对照，并与肿瘤进展和晚期疾病呈正相关。
图8. a)从组织和cfDNA中检索WGBS数据中的CNV；b）WGBS数据可以成功识别出WGS数据中发现的大部分扩增和缺失；c）ESCC患者和健康对照（HC）cfDNA中CNV事件发生率的比较；d）训练集、外部验证集和癌前病变验证集中，HC、低级别上皮内瘤变（LGIEN）、高级别上皮内瘤变（HGIEN）以及不同分期和分级的ESCC中CNV 阳性率的比较。结果显示，ESCC和上皮内瘤变（IEN）患者的CNV阳性率显著高于HC，并且随着肿瘤分期和分级的升高而增加
通过分析cfDNA片段大小分布，他们发现ESCC患者cfDNA中短片段比例更高，并在特定区域的片段大小比率（FSR）显著升高。
图9. 在发现队列中发现的cfDNA的片段大小
最后，他们将DMRs、CNV和FSR信息整合到EMMA模型中，进一步提高了早期ESCC和癌前病变的检出率，同时保持了高特异性。研究还发现，cfDNA甲基化标记物与ESCC的分子亚型和肿瘤微环境相关，具有潜在的临床应用价值。
图10. ESCC-cfmeth评分、DMR+CNV模型和EMMA模型对IEN、I、II、III期ESCC的检出率
图11. 探究了cfDNA甲基化标志物在ESCC中的生物学意义，特别是与分子亚型和TME的关系
案例二：
Cancer Cell：cfDNA 多种检测方法在多癌种早期检测中的评估 5
这项研究评估了多种基于cfDNA的多癌种早期检测(MCED)方法，发现WGBS分析表现最佳。研究人员利用来自CCGA研究的2800名参与者的数据，训练了10种机器学习分类器，比较了WGBS、靶向测序和全基因组测序三种方法在检测癌症信号方面的性能。结果显示，在98%特异性下，WGBS分类器表现出最高的灵敏度，并且拥有最低的临床检测限（LOD）。与使用配对白细胞背景去除的SNV分类器相当。
图12. 研究概括
图13. 不同分类器在癌症信号检测中的性能
图14. 各肿瘤信号检测分类器的临床LOD
此外，WGBS在预测癌症信号来源方面也优于其他方法。研究还发现，循环肿瘤等位基因分数（cTAF）是影响分类器性能的主要因素，比癌症类型和临床分期更重要，这意味着cTAF更能反映肿瘤生物学特性。基于这些发现，研究人员开发并验证了基于靶向甲基化分析的MCED测试，最终促成了Galleri® MCED测试的诞生。
图15. 联合检测癌症样本验证集的原型分析预测癌症信号起源的准确性
案例三：
NPJ Precis Oncol：儿童和成人实体瘤中普遍存在的微小差异甲基化区域的综合分析 6
这篇文章研究了儿童实体瘤中普遍存在的DNA甲基化变化，并探讨了其作为生物标志物的潜力。研究人员对来自11种不同儿童癌症亚型的31个肿瘤组织、13个正常组织和20个血浆cfDNA样本进行了WGBS。
通过将癌症患者的cfDNA WGBS数据与健康对照组进行比较，研究人员鉴定了大量的DMR。平均而言，cfDNA中约25%的DMR与肿瘤组织中的DMRs重叠。
图16. 匹配的血浆和组织之间重叠的DMR
分析显示，cfDNA中低甲基化mDMR的平均甲基化水平与肿瘤组织中的相似，均显著低于健康对照组。然而，高甲基化mDMR在cfDNA和肿瘤组织中的甲基化水平都意外地低于预期，这表明高甲基化区域在cfDNA中可能不太稳定，这对生物标志物开发策略具有重要意义。
图17. 儿童肿瘤样本血浆中mDMR的cfDNA甲基化分析
研究人员利用WGBS数据分析了cfDNA中的CNVs。与肿瘤组织中发现的许多已知CNV不同，cfDNA中的CNVs信号很弱，仅在少数样本中与组织样本一致。相比之下，cfDNA甲基化模式更能反映肿瘤组织的甲基化状态，这表明cfDNA甲基化检测比CNV检测更灵敏。
图18. cfDNA中CNV的检测结果
总之，这项研究表明，WGBS可用于检测cfDNA中的DNA甲基化变化，这些变化反映了儿童实体瘤的特征。cfDNA甲基化分析比CNV分析更灵敏，可能成为一种有前景的液体活检方法，用于儿童癌症的早期检测和微小残留病灶监测。