在生命科学进入"空间组学"时代的今天，如何在高分辨率下同时看清数十种蛋白质在组织原位中的表达与空间关系，成为解析疾病机制的关键瓶颈。PCF（PhenoCycler-Fusion）技术 ------又称CODEX（CO-Detection by indEXing）------通过DNA条形码标记抗体、迭代荧光成像的策略，突破了传统免疫荧光仅能同时检测几个靶标的限制，实现了单细胞分辨率下 最多 10 0+蛋白的原位同时检测 。自2018年Garry Nolan团队在Cell上发表奠基性论文以来，PCF已在小鼠模型的各类组织与疾病研究中大放异彩。
本文系统梳理了18篇应用 PCF 技术的小鼠模型顶刊文献，涵盖免疫、肿瘤、再生、感染、衰老等多个领域，按时间线展示这项技术如何持续推动我们对组织微环境空间架构的深层理解。
开创之作： PCF(CODEX)技术的诞生与脾脏免疫微环境解析
Deep Profiling of Mouse Splenic Architecture with CODEX Multiplexed Imaging.
Goltsev Y, Samusik N, et al.Cell, 2018
研究目的：系统解析正常与自身免疫性疾病状态下小鼠脾脏的免疫微环境空间架构。
小鼠模型：正常BALB/c小鼠 与 MRL/lpr狼疮模型小鼠（系统性自身免疫病）。
样本与 P CF(CODEX)参数：脾脏冰冻切片，24-plex抗体panel。
关键发现：建立了PCF(CODEX)技术体系, 开发了适用于高密度淋巴组织中的单细胞抗原定量算法管线, 揭示了"细胞邻域"（cellular neighborhood）对免疫细胞蛋白质受体表达的深远影响。研究系统比较了正常脾脏与MRL/lpr狼疮脾脏中细胞类型的空间重排，发现了疾病状态下的细胞交互网络重塑。提出了"细胞护照"（cell passport）概念，可精确定义组织中的每种细胞类型。
骨骼肌再生与衰老的空间细胞图谱
A single cell spatial temporal atlas of skeletal muscle reveals cellular neighborhoods that orchestrate regeneration and become disrupted in aging.
Wang YX, Holbrook CA, et al. bioRxiv, 2022
研究目的：构建骨骼肌再生与衰老过程中的单细胞时空图谱，解析多种细胞类型在肌肉修复中的空间协同作用。
小鼠模型：C57BL/6小鼠，心脏毒素（cardiotoxin）诱导的肌肉损伤模型 和 自然衰老模型。
样本与 P CF(CODEX)参数：骨骼肌冰冻切片，32-plex抗体 panel ，结合神经网络与机器学习分析。
关键发现：在单细胞分辨率下鉴定出34种细胞类型，绘制了免疫细胞、成纤维/成血管细胞、血管、神经和肌肉干细胞及肌纤维的空间生态图谱。空间伪时间（spatial pseudotime）分析揭示了肌肉修复过程中有序形成的多细胞"邻域"结构，免疫细胞在其中扮演节点性协调角色。巨噬细胞耗竭实验证实：缺失巨噬细胞导致异常的细胞邻域形成，阻碍肌肉修复。在衰老肌肉中，细胞邻域被慢性炎症状态和自身免疫反应所破坏，在去神经支配区域尤为显著。
胰腺癌免疫微环境与三联疗法
Activating Immune Recognition in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma via Autophagy Inhibition, MEK Blockade, and CD40 Agonism
Jiang H, Courau T, et al. Gastroenterology, 2022
研究目的：探索MEK抑制、自噬抑制与CD40激动剂三联疗法对"免疫冷"胰腺癌微环境的重编程效果。
小鼠模型：C57BL/6J小鼠 原位植入KPC来源的6694C2/FC1245胰腺癌细胞。
样本与 P CF(CODEX)参数：胰腺肿瘤冰冻切片，23-plex抗体 panel ，结合 CyTOF质谱流式。
关键发现： MEK+自噬共抑制通过STING/type I IFN通路激活肿瘤细胞，进而将肿瘤相关巨噬细胞（TAM）极化为M1型免疫原性表。CD40激动剂进一步放大这一效应；三联疗法（cobimetinib + mefloquine + aCD40）在"冷"肿瘤模型中成功激活细胞毒性T细胞应答。 PCF(CODEX)空间分析揭示了治疗后免疫细胞在肿瘤微环境中的空间再分布，为胰腺癌免疫治疗提供了新的联合用药策略。
力学驱动的植入物异物反应
Allometrically scaling tissue forces drive pathological foreign-body responses to implants via Rac2-activated myeloid cells.
Padmanabhan J, Chen K, et al. Nature Biomedical Engineering, 2023.
研究目的：解释为何小鼠模型无法复制人类植入物周围的严重异物反应（FBR），并鉴定关键力学传导机制。
小鼠模型：C57BL/6小鼠，振动硅胶植入物模型模拟人体级别组织力学应力。
样本与 P CF(CODEX)参数：植入体周围组织冰冻切片，21-plex抗体 panel。
关键发现：异物反应的严重程度由植入体表面的组织力（tissue forces）驱动，根据异速生长规律随体型增大指数级增加。在人体和小鼠中，病理性FBR均由RAC2机械传导信号介导，与植入物化学性质无关。通过振动植入物在小鼠中施加人体级别组织力，成功在小鼠中复制了人类级别的FBR（分子、细胞和组织水平）。药理学或遗传学抑制Rac2可显著减少FBR。
COX2抑制增强放疗免疫应答
Adjuvant COX inhibition augments STING signaling and cytolytic T cell infiltration in irradiated 4T1 tumors.
Ridnour LA, Cheng RYS, et al. JCI Insigh t, 2024
研究目的：探索放疗联合NSAID（COX抑制剂）对三阴性乳腺癌抗肿瘤免疫的增强效应。
小鼠模型：BALB/c小鼠植入 4T1三阴性乳腺癌（TNBC）原位肿瘤。
样本与 P CF(CODEX)参数：肿瘤冰冻切片，31-plex抗体 panel。
关键发现：临床队列显示，COX2高表达的TNBC患者放疗疗效显著较差。放疗+吲哚美辛（indomethacin）联合治疗显著减少原发肿瘤生长和肺转。PCF(CODEX)空间分析显示联合治疗后CD8+和CD4+ T细胞密度增加，肿瘤免疫表型从"免疫荒漠"转向"炎症型" 。机制涉及cGAS/STING1和type I IFN通路的局部上调 。联合治疗改善了中位生存期。
ApoE调控肺部巨噬细胞环境适应
Apolipoprotein E controls Dectin-1-dependent development of monocyte-derived alveolar macrophages upon pulmonary β-glucan-induced inflammatory adaptation.
Schlitzer A, et al. Nature Immunology, 2024
研究目的：阐明环境暴露如何通过ApoE信号调控肺部单核细胞来源的肺泡巨噬细胞分化与功能适应。
小鼠模型：C57BL/6J小鼠，鼻内β-葡聚糖（β-glucan）暴露模型。
样本与 P CF(CODEX)参数：肺组织冰冻切片，17-plex抗体 panel ，结合单细胞转录组和流式细胞术。
关键发现：单次低剂量鼻内β-glucan刺激诱导产生ApoE+CD11b+单核来源肺泡巨噬细胞（MoAMs），可持续存在21天。 PCF(CODEX)高维成像在肺组织原位确认了ApoE+CD11b+ AMs的蛋白质共表达表型（CD11b/ApoE/GPNMB）。ApoE+CD11b+ AMs表现为高糖酵解、高吞噬活性、高IL-6分泌。骨髓细胞特异性ApoE敲除阻断了Ly6c+单核细胞向ApoE+CD11b+ AM的分化。这些细胞在嗜肺军团菌感染和博来霉素诱导肺纤维化模型中均表现出保护性效应。
胰腺癌中单核细胞 -巨噬细胞的时空演变
Timing and location dictate monocyte fate and their transition to tumor-associated macrophages.
Dunsmore G, Guo W, et al. Science Immunology, 2024
研究目的：解析胰腺癌中单核细胞向肿瘤相关巨噬细胞（TAM）分化的时间与空间规律。
小鼠模型：Ms4a3Cre x RosatdTomato单核细胞命运示踪小鼠 + KPC原位胰腺癌模型。
样本与 P CF(CODEX)参数：胰腺肿瘤组织冰冻切片，21-plex抗体 panel ，结合单细胞转录组、 Infinity Flow（270种表面蛋白筛选）和谱系示踪。
关键发现：约90%的胰腺癌TAMs来自循环单核细胞（GMP来源），胚胎来源的TAMs保留组织驻留巨噬细胞特征。单核细胞首先分化为短暂的中间态TAM1（CCR2+CD64+），进而生成两群长寿命终末分化TAMs：TAM2（CD73+）和TAM3（CD36+CD11c+）。TAM2和TAM3在肿瘤内占据不同的空间位置，具有不同的功能特征。人类PDAC样本中存在平行的TAM亚群，且与预后相关。通过时间戳（time-stamping）实验精确追踪了不同肿瘤阶段的单核细胞贡献。
NKp46+ ILC1放大狼疮肾炎器官损伤
Amplification of autoimmune organ damage by NKp46-activated ILC1s.
Biniaris-Georgallis SI, Aschman T, et al. Nature, 2024
研究目的：解析系统性红斑狼疮肾炎中炎症信号的层级放大机制，鉴定组织特异性炎症枢纽。
小鼠模型：NZB/W F1雌性狼疮肾炎小鼠，结合poly(I:C)加速发病。
样本与 P CF(CODEX)参数：肾脏冰冻切片，28-plex抗体 panel ，结合单细胞转录组学和抗体阻断实验。
关键发现：肾脏组织驻留的NKp46+ ILC1s是狼疮肾炎中炎症放大的关键枢纽。NKp46信号在特定ILC1亚群中驱动非常规的免疫调节转录程序，包括表达髓系生长因子CSF2 。CSF2促进单核细胞来源巨噬细胞的群体扩增，巨噬细胞进入上皮细胞区域导致上皮损伤。NKp46受体阻断抗体（mNCR1.15）或NKp46基因敲除均能消除上皮细胞损伤。人类狼疮肾炎中存在相同的细胞和分子模式。
视黄酸驱动真皮纤维化与再生修复
Multi-omic analysis reveals retinoic acid molecular drivers for dermal fibrosis and regenerative repair in the skin.
Griffin M, Guo JL, et al. Cell Stem Cell, 2025
研究目的：鉴定驱动皮肤纤维化的关键成纤维细胞亚群和信号通路，并寻找预防和逆转纤维化的治疗靶点。
小鼠模型：C57BL/6小鼠 博来霉素（bleomycin）诱导皮肤纤维化模型。
样本与 P CF(CODEX)参数：皮肤组织，39-plex抗体 panel ，整合单细胞转录组（ scRNA-seq）、单细胞表观组（scATAC-seq）、空间转录组（Visium）的多组学分析。
关键发现：通过机器学习量化294种纤维特征，精确界定了纤维化进展和消退的时间窗口（d12为纤维化高峰，d35完全消退）。鉴定出Cyp26b1+成纤维细胞亚群是纤维化的核心驱动群体。该亚群在不同组学层面得以验证：scRNA-seq → scATAC-seq → Visium空间转录组 → PCF(CODEX)空间蛋白定位。CYP26B1小分子抑制剂talarozole可预防和逆转博来霉素诱导的皮肤纤维化。
胰岛驻留巨噬细胞的抗氧化程序保护β细胞
An islet-resident macrophage antioxidant program preserves β cell physiology.
Grosjean A, Jalon A, et al. Science Immunology, 2025
研究目的：解析胰岛驻留巨噬细胞（IRMs）的异质性、起源及其在胰岛β细胞生理中的支持功能。
小鼠模型：C57BL/6J健康小鼠、Ms4a3Cre/+RosatdTom单核细胞示踪小鼠、Ms4a3CreERT2可诱导示踪小鼠。
样本与 P CF(CODEX)参数：胰腺冰冻切片，15-plex抗体 panel ，结合单细胞转录组学和 3D共聚焦成像。
关键发现：PCF(CODEX)分析在胰腺中鉴定出5个巨噬细胞亚群，其中IRMs为CD169−MHCII+，高度富集于胰岛内部。CD206+巨噬细胞位于胰岛边界（基膜外），与IRMs属于不同群体。成年小鼠中约一半IRMs来自循环单核细胞，但周转率极低（成年期~1%/10天）。scRNA-seq揭示4个IRM细胞状态，其中SLC7A11+CD9high IRMs具有增强的抗氧化防御、线粒体活性和铁-脂代谢程序。Slc7a11+ IRMs维持β细胞氧化还原稳态和胰岛素分泌。
内皮细胞 TGFβ信号驱动肺间质巨噬细胞发育
Endothelial-driven TGFβ signaling supports lung interstitial macrophage development from monocytes.
Peng W, Vanneste D, et al. Science Immunology , 2025
研究目的：解析肺间质巨噬细胞（IMs）从单核细胞分化的微环境信号及其在肺稳态维持中的功能。
小鼠模型：C57BL/6小鼠，髓系特异性Tgfbr2敲除小鼠、内皮特异性Tgfb1敲除小鼠。
样本与 P CF(CODEX)参数：肺组织冰冻切片，28-plex抗体 panel ，结合单细胞转录组学、骨髓嵌合体和谱系示踪。
关键发现：vWF+血管内皮细胞产生的Tgfβ1是塑造IM核心身份的微环境信号。髓系Tgfβ受体信号破坏导致单核细胞无法完全分化为功能性IMs，在血管周围积累未成熟单核细胞。IM-Tgfβ信号缺失触发年龄相关的肺力学异常、过度充气和胶原沉积。内皮特异性Tgfb1缺失表型与髓系Tgfbr2缺失一致，阐明了内皮-IM轴维持肺组织完整性的机制。
瘤周巨噬细胞招募嗜酸性粒细胞抗肿瘤
Peritumoral macrophages recruit eosinophils to promote antitumor immune responses in breast cancer.
Saglimbeni J, Esteva E, et al. PNAS, 2025
研究目的：鉴定乳腺组织巨噬细胞（MTMs）在乳腺癌进展和抗肿瘤免疫中的定位与功能。
小鼠模型：雌性 MMTV-PyMT自发乳腺癌转基因小鼠（涵盖9-21周龄的多个疾病阶段）。
样本与 P CF(CODEX)参数：乳腺肿瘤冰冻切片，33-plex抗体 panel。
关键发现：与TAM不同，MTMs（F4/80+CD206+）位于肿瘤周围基质，Lyve-1进一步细分MTM亚群 。MTMs与嗜酸性粒细胞（eosinophils）在瘤周区域共定位。MTM耗竭加速了肿瘤发生（自发模型和原位移植模型均验证）。Treg耗竭诱导的抗肿瘤免疫应答中，MTMs呈替代激活状态并表达嗜酸性粒细胞趋化因子（eotaxins）。MTMs表达IL-33受体，IL-33可诱导MTM激活和嗜酸性粒细胞募集。
GAS6-AXL信号驱动口腔黏膜无疤痕再生
Growth arrest specific-6 and angiotoxin receptor-like signaling drive oral regenerative wound repair.
Griffin MF, Cook J, et al. Science Translational Medicine, 2025
研究目的：解析口腔黏膜无疤痕再生的分子机制，并探索在皮肤中模拟这一再生过程的可能性。
小鼠模型：C57BL/6小鼠，口腔黏膜+面部皮肤配对创伤模型（2.5mm打孔）。
样本与 P CF(CODEX)参数：伤口组织冰冻切片，41-plex抗体 panel ，结合 scRNA-seq和功能实验。
关键发现： scRNA-seq鉴定出9个成纤维细胞亚群，口腔中以Fibroblast 2（Lum+Aebp1+）为主导，皮肤中以Fibroblast 1（Prrx1+Enpp2+）为主导。口腔成纤维细胞通过GAS6-AXL信号抑制纤维化相关的力学信号传导（FAK通路）。AXL抑制或敲低使口腔伤口变为纤维化愈合。在面部皮肤中外源GAS6刺激AXL可使伤口以再生方式愈合（胶原排列和沉积均改善）。 罕见的人口腔疤痕中GAS6和AXL表达降低，FAK增加。
15-PGDH抑制促进关节软骨再生
Inhibition of 15-hydroxy prostaglandin dehydrogenase promotes cartilage regeneration.
Singla M, Wang YX, et al. Science, 2025
研究目的：探索15-PGDH抑制对老年和创伤后骨关节炎中软骨再生的效果与机制。
小鼠模型：老年小鼠（>24月龄）自然退变模型 和 年轻小鼠胫骨压缩ACL断裂创伤后骨关节炎（PTOA）模型。
样本与 P CF(CODEX)参数：膝关节软骨 冰冻切片 ， 26-plex抗体 panel ，结合 scRNA-seq。
关键发现：15-PGDH在老年和损伤关节软骨中表达显著增加。系统性（腹腔注射）或局部（关节腔注射）给予15-PGDH小分子抑制剂SW033291（PGDHi）均能诱导软骨再生。PCF(CODEX)鉴定了软骨中的主要软骨细胞亚群。PGDHi减少了表达15-PGDH的肥大样软骨细胞，增加了ECM合成型关节软骨细胞。再生软骨为透明软骨（articular cartilage）而非纤维软骨，表达COL-2、Aggrecan和Lubricin。再生机制是已有软骨细胞的基因重编程，而非干细胞增殖。
胚胎起源决定成纤维细胞疤痕潜能
Fibroblasts of disparate developmental origins harbor anatomically variant scarring potential.
Griffin MF, Li DJ, et al. Cell, 2026
研究目的：揭示不同胚胎起源的成纤维细胞为何在创伤后产生显著不同的疤痕结局。
小鼠模型：C57BL/6小鼠，面部/头皮/腹部/背部四处皮肤创伤模型。
样本与 P CF(CODEX)参数：伤口皮肤冰冻切片，41-plex抗体 panel ，结合 scRNA-seq和成纤维细胞移植实验。
关键发现：神经嵴来源的面部成纤维细胞相比中胚层来源的背侧成纤维细胞，创伤后疤痕显著更少。面部成纤维细胞高表达ROBO2和EID1。ROBO2和EID1通过抑制EP300组蛋白乙酰转移酶，使染色质处于转录沉默状态，抑制促纤维化基因表达。小分子或转基因抑制EP300使背部伤口以面部样模式愈合（减少疤痕），SLIT2-ROBO2-EID1-EP300通路的操作成功将疤痕易感的背侧伤口转化为面部样低疤痕愈合。
CD153+CD4+ T细胞-成纤维细胞交互驱动干燥综合征
A CD4+ T cell-fibroblast crosstalk exacerbates autoimmunity in a mouse model of primary Sjögren disease.
Otsuka K, Kondo H, et al. Nature Communications, 2026
研究目的：鉴定原发性干燥综合征中致病性CD4+ T细胞亚群及其与非免疫细胞（成纤维细胞）的交互作用。
小鼠模型：原发性干燥综合征（pSjD）模型小鼠。
样本与 P CF(CODEX)参数：唾液腺 FFPE切片，22-plex抗体 panel。
关键发现：scRNA-seq首次鉴定了疾病特异性CD153+CD4+ T细胞亚群。CD153+CD4+ T细胞与CD30+组织驻留成纤维细胞在病变组织中相互作用。CD153-CD30轴促进成纤维细胞增殖和趋化因子分泌，进一步驱动免疫细胞浸润，形成正反馈回路。该轴驱动三级淋巴结构（TLS）形成。敲除CD4+ T细胞的CD153或中和成纤维细胞来源的趋化因子均可减少淋巴细胞浸润，阻止自身免疫病理。 CD153-CD30轴与人类患者疾病严重程度正相关。
黏膜疫苗提供广谱呼吸道保护
Mucosal vaccination in mice provides protection from diverse respiratory threats.
Zhang H, Floyd K, et al. Science, 2026
研究目的：开发可提供广谱、持久呼吸道保护的鼻内黏膜疫苗。
小鼠模型：C57BL/6小鼠，鼻内TLR4/TLR7/8配体+OVA疫苗。后续用SARS-CoV-2、SARS、SCH014冠状病毒、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌等攻击。
样本与 P CF(CODEX)参数：肺组织 FFPE切片，24-plex抗体 panel。
关键发现：鼻内GLA-3M-052-LS+OVA疫苗提供至少3个月的广谱保护，覆盖病毒（多种冠状病毒）、细菌（金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌）和过敏原。保护由OVA特异性CD4+和CD8+记忆T细胞介导，这些细胞在肺中持续存在并重塑肺泡巨噬细胞。疫苗接种通过表观基因组重塑重编程肺泡巨噬细胞，增强其抗原呈递和抗病毒能力。感染后，接种小鼠快速产生病原体特异性T细胞和抗体应答，并形成异位淋巴结构（ectopic lymphoid structures） 。
慢性髓系白血病骨髓微环境的时空单细胞图谱
High-dimensional spatiotemporal single-cell atlas and 3D imaging of the bone marrow microenvironment during CML progression.
Li L, Rottmann I, et al. Blood, 2026
研究目的：构建慢性髓系白血病（CML）进展过程中骨髓微环境的时空单细胞图谱。
小鼠模型：C57BL/6免疫健全小鼠，静脉注射BCR::ABL1-GFP转导的lin−Sca-1+c-kit+骨髓细胞建立急变期CML模型，在诱导后7天、14天和21天采集股骨。
样本与 P CF(CODEX)参数：股骨冰冻切片，54-plex抗体 panel 。共成像 55个ROI（2-3个/骨），分析共2,033,725个单细胞，鉴定41种细胞类型。整合3D光片显微镜。
关键发现：CML进展中骨髓微环境全面重塑：髓系和祖细胞扩增、PD-L1+白血病细胞增加、CD4+/CD8+ T细胞上PD-1上调、B细胞/浆细胞/骨细胞严重丢失。晚期CML出现未成熟、缺乏周细胞的血管大量扩增，破坏HSPC血管微环境。空间分析揭示白血病特异性细胞邻域，富含PD-1+CD8+ T细胞的局部免疫耗竭区域。巨核细胞（MKs）在CML中数量增加但形态异常（结构缺陷、CD34+未成熟表型），这些特征也存在于CML患者骨髓活检中。通过激光捕获显微切割+RNA-seq发现CML患者MKs中细胞骨架基因表达降低。3D成像揭示了骨干骺端区域特异性的血管紊乱和MKs耗竭。AML对照实验显示血管减少和MKs减少（但剩余MKs形态正常），说明这些改变是CML特异的。
小结： 趋势与规律
1. 抗体 panel 规模持续扩大：从2018年Cell论文的24-plex到2026年Blood论文的54-plex，PCF(CODEX)在小鼠模型中的检测通量增长了2倍以上。
2. 覆盖组织与疾病类型丰富: 脾脏、骨髓、胰腺癌、乳腺癌、纤维化皮肤、疤痕、植入物、新冠肺组织、肌肉再生、软骨、狼疮肾炎、干燥综合征、胰岛。
3. 技术整合日趋多维：PCF(CODEX)正从"单一空间蛋白质组"走向多组学空间整合------与scRNA-seq、scATAC-seq、空间转录组（Visium）、流式质谱（CyTOF）、3D光片显微镜、激光捕获显微切割+bulk组学等技术多层次交叉验证。
4 . 从描述走向功能干预：早期研究以描述性空间图谱为主，近期研究越来越多地通过基因敲除/药物阻断/受体阻断抗体等进行功能性空间验证，证明PCF(CODEX)空间数据所揭示的细胞邻域和交互是功能相关的。
PCF-80（空间单细胞蛋白组旗舰产品）
Panel更大，洞察更深
PCF-80全面覆盖免疫细胞谱系、肿瘤细胞表型、T细胞功能状态、B细胞/TLS相关反应、髓系细胞异质性、免疫检查点、CAF与基质重塑、血管/淋巴管结构、细胞增殖、缺氧、代谢重编程及细胞命运调控等多个生物学维度。该panel可在组织中实现高维蛋白标志物的原位空间检测，用于系统解析组织微环境中的细胞组成、功能状态、空间邻域及细胞互作关系，为肿瘤免疫微环境、免疫治疗响应/耐药、TLS形成、TAM功能分型、CAF屏障、血管重塑和空间生物标志物挖掘等研究提供多维度空间蛋白组学分析框架。
华盈生物空间多模态研究体系
PCF空间单细胞蛋白组成像示例
