空间转录组常规分析（大白话教程）

本文的代码来自Seurat官方网站的空转教程。

1.R包和数据准备

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rm(list = ls())
library(Seurat)
library(SeuratData)
library(ggplot2)
library(patchwork)
library(dplyr)

数据来自10X官方网站，也可以从SeuratData获取。InstallData会安装R包，如果已安装，运行这句代码不会导致重复安装。

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InstallData("stxBrain")

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brain <- LoadData("stxBrain", type = "anterior1")
brain

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## An object of class Seurat 
## 31053 features across 2696 samples within 1 assay 
## Active assay: Spatial (31053 features, 0 variable features)
##  1 layer present: counts
##  1 spatial field of view present: anterior1

这个示例数据是直接Load的，正常的空转数据需要用Load10X_Spatial()读取，目录树组织形式如下：

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GSM7980860/
├── filtered_feature_bc_matrix/     # 表达矩阵文件夹
│   ├── barcodes.tsv.gz             # Spot 编号
│   ├── features.tsv.gz             # 基因信息
│   └── matrix.mtx.gz               # 稀疏表达矩阵
│
└── spatial/                        # 空间信息文件夹
    ├── tissue_positions_list.csv   # 空间坐标文件
    ├── scalefactors_json.json      # 图像缩放比例参数
    └── tissue_hires_image.png      # 高清HE染色组织切片图

查看空转的Seurat对象结构

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str(brain,max.level = 2)

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## Formal class 'Seurat' [package "SeuratObject"] with 13 slots
##   ..@ assays      :List of 1
##   ..@ meta.data   :'data.frame':	2696 obs. of  5 variables:
##   ..@ active.assay: chr "Spatial"
##   ..@ active.ident: Factor w/ 1 level "anterior1": 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ...
##   .. ..- attr(*, "names")= chr [1:2696] "AAACAAGTATCTCCCA-1" "AAACACCAATAACTGC-1" "AAACAGAGCGACTCCT-1" "AAACAGCTTTCAGAAG-1" ...
##   ..@ graphs      : list()
##   ..@ neighbors   : list()
##   ..@ reductions  : list()
##   ..@ images      :List of 1
##   ..@ project.name: chr "anterior1"
##   ..@ misc        : list()
##   ..@ version     :Classes 'package_version', 'numeric_version'  hidden list of 1
##   ..@ commands    : list()
##   ..@ tools       : list()

其中图像信息存储在了"images"部分。

2.数据预处理

受组织结构、密度的影响，加上技术性问题，同一个样本中的测序深度存在显著的异质性，需要有效的标准化处理来消除。

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plot1 <- VlnPlot(brain, features = "nCount_Spatial", pt.size = 0.1) + NoLegend()

plot2 <- SpatialFeaturePlot(brain, features = "nCount_Spatial") + theme(legend.position = "right")

wrap_plots(plot1, plot2)

SCTransform相当于经典流程里面的

NormalizeData(),FindVariableFeatures(),ScaleData()三个函数的合体，是空转流程中推荐的标准化方式。

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brain <- SCTransform(brain, assay = "Spatial", verbose = FALSE)

3.指定的基因表达量的可视化

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SpatialFeaturePlot(brain, features = c("Hpca", "Ttr"))

pt.size.factor参数可以调节点的大小

alpha表示对不同表达量的值设置不同的透明度，低表达的点会更加透明。

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p1 <- SpatialFeaturePlot(brain, features = "Ttr", pt.size.factor = 1)

p2 <- SpatialFeaturePlot(brain, features = "Ttr", alpha = c(0.1, 1))

p1 + p2

4.降维聚类和可视化

降维聚类和可视化与单细胞转录组类似。

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brain <- RunPCA(brain, assay = "SCT", verbose = FALSE)
brain <- FindNeighbors(brain, reduction = "pca", dims = 1:30)
brain <- FindClusters(brain, verbose = FALSE)
brain <- RunUMAP(brain, reduction = "pca", dims = 1:30)

调了个漂亮一点的颜色。

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library(paletteer)
my_colors <- paletteer_d("ggsci::nrc_npg")

library(RColorBrewer)
my_colors <- colorRampPalette(my_colors)(nlevels(brain))

p1 <- DimPlot(brain, reduction = "umap", label = TRUE) +
  scale_color_manual(values = my_colors, name = "Cluster")+
  coord_fixed()+
  NoLegend()
p2 <- SpatialDimPlot(brain, label = TRUE, label.size = 3) +
  scale_fill_manual(values = my_colors, name = "Cluster")

p1 + p2

可以在组织切片上面高亮特定簇(例如0、1)的细胞，看的更加清楚。

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SpatialDimPlot(brain,
               cells.highlight = CellsByIdentities(object = brain, 
                                                   idents = c(0,1)), 
               facet.highlight = TRUE, 
               ncol = 2) & 
  theme(plot.margin = unit(c(1, 1, 1, 1), "mm"))

5.识别空间高变基因

Seurat提出了两种方法来识别与组织内空间位置相关的基因。一种是差异表达分析，熟悉的FindMarkers。

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de_markers <- FindMarkers(brain, ident.1 = 5, ident.2 = 7)

SpatialFeaturePlot(object = brain, features = rownames(de_markers)[1:3], alpha = c(0.1, 1), ncol = 3)

另一种方法是FindSpatiallyVariableFeatures，用莫兰指数作为度量指标。有一些新的算法可以替代它，例如Spark-X和HEARTSVG，且听下回分解。

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#install.packages('Rfast2')
brain <- FindSpatiallyVariableFeatures(brain,
                                       features = VariableFeatures(brain)[1:1000],
                                       selection.method = "moransi")

推荐安装Rfast2这个包，可以加快FindSpatiallyVariableFeatures计算的速度。

通过该方法得到的前6个基因的组织分布如下。

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top.features <- head(SpatiallyVariableFeatures(brain, method = "moransi"), 6)

SpatialFeaturePlot(brain, features = top.features, 
                   ncol = 3, alpha = c(0.1, 1)) & 
  theme(plot.margin = unit(c(1, 1, 1, 1), "mm"))

6.提取区域子集

这里是想要根据聚类结果和脑部实际结构，近似提取前额叶皮层的子集，划定区域的工作通常需要由经验丰富的病理医生完成。

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brain_sub <- subset(brain, idents = c(1, 2, 3, 4, 6, 7))

SpatialDimPlot(brain_sub, label = T, crop = T, label.size = 3) + NoLegend() + 
  SpatialDimPlot(brain_sub, label = T, crop = F, label.size = 3)

显示坐标轴文字，来大致确定选取的坐标范围。

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theme_axis_labels <- theme(axis.text.x = element_text(size = 10), 
                           axis.text.y = element_text(size = 10),
                           axis.title.x = element_text(size = 10),
                           axis.title.y = element_text(size = 10))

SpatialDimPlot(brain_sub, label = T, label.size = 3, crop = T) + theme_axis_labels

可以用Crop函数实现矩形切割

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brain_sub[["anterior1"]] <- Crop(brain_sub[["anterior1"]],
                              x = c(150, 500),
                              y = c(0, 425))
#切完之后的图
SpatialDimPlot(brain_sub)

这里是想要排除1簇的右下角的细胞，因为他们不属于前额叶皮层。

官方代码在这里没有解释咋弄的，我来画张图你就明白了。

下面这段具体的代码不用看，直接看结果。

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# 官方示例定义的斜率和截距，仅适用于当前示例数据
m <- 0.6
b <- -550

p <- SpatialDimPlot(brain_sub)
panel <- ggplot_build(p)$layout$panel_params[[1]]
x_view <- panel$x.range
y_view <- -rev(panel$y.range)
y_line <- -(m * x_view + b)
p <- p +
  annotate("segment", x = x_view[1],y = y_line[1],
           xend = x_view[2],yend = y_line[2],color = "yellow",
           linetype = "dashed", linewidth = 1.2) +
  coord_fixed(xlim = x_view,ylim = y_view,
              expand = FALSE,clip = "on")
p

就是说画了个斜线，纵坐标在斜线以上的细胞才会被保留下来。如果是自己的数据，截距和斜率必须自己调整，不能全盘照搬。

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m <- 0.6
b <- -550

# 提取线以上的spot

cortex_coords <- GetTissueCoordinates(brain_sub, scale = "lowres") %>%
                  subset(-y >= (m * x + b))

cortex <- subset(brain_sub, 
                 cells = cortex_coords$cell)

ncol(cortex)

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## [1] 1071

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SpatialDimPlot(cortex, label = T, label.size = 3, crop = T)

再次画个斜线上去，线以下确实没有点了。说明我说的是对滴。

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library(ggplot2)
library(Seurat)

p <- SpatialDimPlot(cortex)
# 获取当前图的坐标范围
x_auto <- ggplot_build(p)$layout$panel_params[[1]]$x.range
y_view_auto <- -rev(ggplot_build(p)$layout$panel_params[[1]]$y.range) # 补充 y 的范围
y_auto <- -(m * x_auto + b)

p <- p +
  annotate("segment", x = x_auto[1], y = y_auto[1],
           xend = x_auto[2], yend = y_auto[2], color = "yellow",
           linetype = "dashed", linewidth = 1.2) +
  coord_fixed(xlim = x_auto, ylim = y_view_auto,
              expand = FALSE, clip = "on")
p

仅画出选中的群，第一张图是放大的，第二张图不放大。

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c1 <- SpatialDimPlot(cortex, images = "anterior1", crop = T, label = T)
c1

将前额叶皮层和整个切片地Seurat对象各自存为rds，以备后续分析使用。

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saveRDS(cortex,file = "cortex.rds")
saveRDS(brain,file = "brain.rds")