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2026年6月27日，湘湖实验室(农业浙江省实验室)李果研究员/顾志敏研究员、重庆妇幼医院江雯研究员、浙江大学姚远研究员团队合作在《Cell Communication and Signaling》期刊发表题为"Programmable aging function-related mitochondrial DNA 5-methylcytosine (m5C) modification with a TALE-directed methyltransferase"的高水平科研成果。该研究开发了一种名为MEE（Mitochondrial Epigenetic Editor）的新型线粒体表观遗传编辑器，实现对线粒体DNA（mtDNA）特定位点的可编程5-甲基胞嘧啶（5mC）甲基化修饰，为研究线粒体表观遗传学及衰老相关疾病提供全新技术平台。
英文标题：Programmable aging function-related mitochondrial DNA 5-methylcytosine (m5C) modification with a TALE-directed methyltransferase
译文标题：TALE导向甲基转移酶介导的衰老相关线粒体DNA 5-甲基胞嘧啶可编程修饰
发表时间：2026年6月27日
发表期刊：Cell Communication and Signaling
影响因子:IF11.6/Q1
技术平台：WGBS、RNA-seq等（易基因金牌技术）
作者单位：湘湖实验室(农业浙江省实验室)、重庆妇幼医院、浙江大学、中国农业大学等
DOI:10.1186/s12964-026-03030-8
线粒体表观遗传编辑在不改变线粒体DNA（mtDNA）序列前提下调控内源线粒体基因表达，为调控致病性线粒体基因提供了一种潜在策略。本研究开发的由线粒体靶向TALE模块与Dnmt3A和Dnmt3L甲基转移酶融合而成的线粒体表观遗传编辑器(MEE)，可以高效介导细胞线粒体DNA位点特异性5mC甲基化，且脱靶活性极低。研究证明，MEE介导的C12191（H）位点甲基化效率超过53%，并使人细胞中MT-ND5 mRNA的稳态水平降低约95%。在体内实验中，MEE使衰老相关位点C11168（H）甲基化增加了11.76%，导致靶标脑区MT-ND4表达降低，并改变小鼠血浆中t-Tau和NFL水平。
本研究结果表明，在不改变mtDNA序列的前提下，MEE能够高效抑制靶基因表达，并在体内和体外调控与衰老相关的mtDNA甲基化模式，为研究线粒体表观遗传学在衰老及相关疾病中的作用提供了强大且精确的工具。
研究方法
（1）质粒设计与构建：D3A-D3L融合蛋白、线粒体靶向序列（MTS）、TALE蛋白模块、载体构建、质粒验证
（2）细胞培养与转染：HEK293T细胞
（3）mtDNA提取、线粒体蛋白分离及Western Blot：分离HEK293T细胞的线粒体蛋白，特异性抗体（抗ND5、COX1、COX2、COXIV）孵育并检测蛋白表达水平。
（4）亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）：计算甲基化率。
（5）基因表达检测（qPCR）：计算相对表达量。
（6）全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）：WT细胞、Dnmt3A敲除细胞、Dnmt3A过表达细胞（9个样本）；以及WT细胞、GFP对照、三个MEE靶向位点实验（15个样本）。计算全基因组甲基化水平和差异甲基化。
（7）动物实验
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使用C57BL/6J小鼠，包括1、3、5、12、21月龄的梯度年龄小鼠。
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MEE由PHP.eB AAV包装，通过尾静脉注射（1011 vg/只）至4周龄小鼠体内。
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3周后取脑组织（小脑、皮层、海马、纹状体）和血液，进行后续的mtDNA甲基化、RNA-seq及血浆衰老生物标志物（IGF-1, NFL, p-Tau等）检测。
结果图形
（1）线粒体表观遗传编辑器设计
研究首先通过构建Dnmt3A敲除细胞、过表达MTS-Dnmt3A的细胞以及野生型对照三种HEK293T细胞模型来验证Dnmt3A在线粒体DNA甲基化中的功能。研究团队通过全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）分析发现，Dnmt3A敲除破坏了区域性甲基化模式并改变线粒体基因表达；而MTS-Dnmt3A过表达显著提高mtDNA甲基化水平，并引入了链特异性甲基化偏倚（图1a、b）。具体而言，在重链（H链）和轻链（L链）上均观察到甲基化峰主要位于基因-基因边界区域，且L链的CpG甲基化表现出明显偏倚。
基于上述发现，研究团队设计了线粒体表观遗传编辑技术平台MEE，通过将MTS、Dnmt3A和Dnmt3L融合到TALE DNA结合支架上，实现mtDNA位点的可编程（图1c）。为评估MEE的甲基化效率，研究选择ND2和ND5基因中的三个特定位点进行测试。结果显示MEE在转染后2天和6天分别实现MT-ND2位点1的33.7%和41.7%、MT-ND2位点2的33.3%和45.8%、MT-ND5位点的20.8%和70.8%的5mC甲基化效率（图1d）。这些结果表明MEE具有良好的位点特异性甲基化活性，且甲基化效率随时间延长而增加。
图1：线粒体DNA甲基化的链特异性分析及线粒体表观遗传编辑器（MEE）开发
（2）MEE实现高效的mtDNA甲基化
为进一步验证MEE功能，研究团队挑选了在之前Dnmt3A实验中差异显著的20个mtDNA位点，分布在MT-RNR1、MT-ND1、MT-COX1、MT-COX2、MT-ATP8、MT-COX3、tRNA、MT-ND5和MT-CYTB等基因上（图2c）。将靶向这些位点的MEE质粒转染HEK293T细胞，72小时后分选GFP阳性细胞进行BSP和qPCR/Western Blot分析。结果表明MEE介导的甲基化水平与靶基因的mRNA及蛋白水平下调显著相关（图2d-f）。而催化失活的dMEE对mRNA的降低作用较弱，表明MEE的基因沉默效应是位点占有率与Dnmt3A介导的甲基化共同作用的结果。
图2：线粒体表观遗传编辑器(MEEs)的功能验证
（3）MEE具有高度特异性
为评估MEE的特异性，研究团队选择MT-RNR1的C15634(L)、MT-ND1的C3687(H)和C3951(H)三个靶位点进行全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）和RNA测序（RNA-seq）分析。WGBS数据分析显示，与GFP转染对照相比，MEE处理组分别鉴定出786、771和771个差异5mC甲基化位点；与野生型对照相比，分别鉴定出748、730和731个差异位点（图3a-b）。在线粒体基因组中，与GFP对照相比分别检测到480、479和507个差异甲基化位点；与WT对照相比分别检测到229、201和192个差异位点，而GFP转染组仅检测到4个（图3c-d）。
RNA-seq分析显示，与野生型细胞相比，MEE处理组的下调基因数（DRGs）分别为868、547和373个，而GFP对照组为675个（图3e-h）。由于GFP对照组也观察到相当数量的基因表达变化，这些差异甲基化和基因表达变化可能受到转染相关效应的影响。综合WGBS和RNA-seq数据表明，在测试条件下MEE的脱靶活性非常有限。
图3：线粒体表观遗传编辑器(MEEs)的脱靶5mC甲基化分析
(4) 衰老小鼠表现出异常的mtDNA 5mC甲基化模式
研究团队选取1、3、5、12、21月龄的C57BL/6小鼠（对应人类0-70岁），对其脑和胸腺组织的全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）分析结果显示，年轻与衰老小鼠之间存在显著的5mC甲基化位点差异。在脑组织中，各年龄组的线粒体基因组表现出强L链CpG甲基化偏倚，保守的峰值位点主要位于基因-基因边界（图4b-c）。这些发现提示年龄相关的生物标志物变化可能与mtDNA 5mC甲基化相关，MEE可作为研究衰老表观遗传机制的有前景工具。
图4：衰老小鼠组织中链特异性线粒体DNA（mtDNA）甲基化动态变化
（5）MEEs在体内实现高效的年龄相关mtDNA甲基化
为评估MEE的体内甲基化效率和治疗潜力，研究团队靶向小鼠脑组织中MT-RNR2的C2383(H)、MT-ND2的C3933(H)和MT-ND4的C11168(H)三个衰老相关mtDNA甲基化位点。将MEE包装入PHP.eB AAV载体，对4周龄C57BL/6J小鼠静脉注射1011 vg，3周后收集脑组织和血浆（图5a-b）。GFP免疫荧光证实PHP.eB AAV在中枢神经系统的高效转导（图5c）。
WGBS和BSP分析显示，在小脑组织中C11168(H)位点的甲基化效率达到11.76%（图5d）。RNA-seq和qPCR评估显示C2383-MEE显著下调皮层中MT-RNR2表达；C3933-MEE降低海马和纹状体中MT-ND2表达；C11168-MEE抑制小脑中MT-ND4表达（图5e-g）。生化分析显示衰老相关血浆生物标志物发生改变：C2383-MEE组p-Tau变化、C3933-MEE组t-Tau变化、C11168-MEE组t-Tau和NFL变化（图5h）。通过线粒体基因组甲基化文库构建和测序分析，在所有组别的脑组织样本中未检测到额外的差异甲基化脱靶位点。这些结果证明MEE可在体内介导mtDNA甲基化，扰动衰老相关表观遗传位点，为线粒体表观基因组研究和机制研究建立了有用工具。
图5：MEE介导的体内年龄相关mtDNA 5mC甲基化
结论和启示
本研究通过开发MEE这一创新工具，成功实现在不改变mtDNA序列的前提下，对线粒体基因进行可编程的表观遗传调控。MEE在细胞和活体小鼠中均展现出高效、特异性的mtDNA 5mC甲基化编辑能力，并能有效沉默靶基因。该研究将从前的mtDNA甲基化与衰老的关联观察，推向了可进行因果验证的新阶段，为深入理解线粒体表观遗传学在衰老以及神经退行性、代谢性疾病中的作用提供了强有力的实验平台。
WGBS在本研究中的重要作用
Dnmt3A功能验证：通过WGBS比较WT、Dnmt3A-KO和MTS-Dnmt3A-OE细胞的mtDNA甲基化谱，系统揭示Dnmt3A对线粒体DNA甲基化的调控作用，发现链特异性甲基化偏倚，为MEE设计提供理论基础（图1a-b）。
MEE靶点筛选：基于WGBS数据筛选出20个甲基化效率差异最显著的位点作为MEE靶点，确保编辑器的靶向效果。
脱靶效应评估：WGBS通过比较MEE处理组与GFP/WT对照的核基因组和线粒体基因组甲基化谱，定量分析差异甲基化位点数量，得出"有限可检测脱靶活性"结论（图3a-d）。对基因编辑工具的临床转化安全性评估至关重要。
衰老甲基化图谱绘制：WGBS揭示了衰老过程中mtDNA 5mC甲基化的动态变化，发现脑组织L链CpG甲基化偏倚的年龄保守性，为识别衰老相关靶点提供依据（图4b、c）。
体内编辑验证：WGBS用于确认AAV递送MEE后的体内甲基化效率（C11168位点11.76%）和脱靶检测，支撑了MEE从细胞到动物的转化应用（图5d）。
易基因DNA甲基化整体研究方案
DNA甲基化是一种表观遗传修饰，指DNA分子在DNA甲基转移酶的作用下将甲基选择性地添加到特定碱基上的过程。主要发生在胞嘧啶的CpG位点，也可以在非CpG位点和CpG岛中发生。DNA甲基化参与调控基因表达、X染色体失活、基因印记、胚胎发育、细胞分化、肿瘤发生以及维持基因组稳定性。
参考文献：
Li G, Zhou X, Zhu G, Cheng Y, Pan Y, Guo X, Liao G, Li X, Hu X, Yao Y, Gu Z, Jiang W. Programmable aging function-related mitochondrial DNA 5-methylcytosine (m5C) modification with a TALE-directed methyltransferase. Cell Commun Signal. 2026 Jun 27.doi: 10.1186/s12964-026-03030-8.