苦皮藤基因组与苦皮藤素 V 的生物合成--Nature Communications

Biosynthesis and heterologous production of the α-agarofuran scaffold of Celangulin V from Celastrus angulatus

南蛇藤中苦皮藤素 V 的 α-沉香呋喃骨架的生物合成与异源生产

摘要

苦皮藤素 V 是来源于苦皮藤（Celastrus angulatus ）的广谱生物农药，属于二氢β沉香呋喃（DHβAF）类倍半萜，具备拒食与杀虫活性，但其生物合成通路在很大程度上仍未阐明。本研究组装得到苦皮藤染色体水平、单倍型解析的参考基因组，两套单倍型均组装为 23 条假染色体，scaffold N50 分别达到 14.31 Mb 与 14.01 Mb。基于该高质量基因组，研究鉴定到发生于约 3430 万年前的近期 β 全基因组三倍化事件（βWGT）；倍半萜合酶与 CYP71BE 家族细胞色素 P450 基因的扩张分别由全基因组复制（WGD）和串联复制驱动。本研究鉴定出CaTPS16 为 γ桉叶醇合酶，并证实 CYP71BE416 可进一步催化 γ桉叶醇生成苦皮藤素 V 生物合成的四氢呋喃环骨架 α沉香呋喃。通过共表达上述基因，我们在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）体内实现 α沉香呋喃的从头合成。该研究极大丰富了卫矛科的基因组资源，加深了我们对二氢β沉香呋喃类倍半萜四氢呋喃环的生物合成起源与进化的认识，也为该类化合物在微生物底盘中的异源生物合成奠定基础。

引言

二氢β沉香呋喃（DHβAF）骨架倍半萜是卫矛科植物的特征天然产物，已鉴定的化合物超过 500 种。该类化合物拥有由反式十氢化萘环（A 环、B 环）与四氢呋喃环（C 环）构成的三环共同骨架；依据骨架上羟基的数量、位置以及立体化学特征，可将其划分为 70 余个类别 ¹。DHβAF 类倍半萜分子结构丰富多样，具备多种生物学活性，包括抗肿瘤、逆转多药耐药、抗艾滋病、免疫抑制，以及昆虫拒食与杀虫活性 ²。目前，受原材料供给不足限制，从植物中天然提取 DHβAF 类倍半萜无法满足市场需求。据已有报道，500 余种 DHβAF 倍半萜中仅有 15 种实现化学全合成 ¹。尽管已有多种化学合成策略被用于制备该类化合物，但卫矛科植物特有的四氢呋喃环的生物合成机制仍知之甚少。

苦皮藤（Celastrus angulatus ）是卫矛科代表性物种，在中国分布广泛，既是传统抗肿瘤中药材，也可用作植物杀虫剂 ³。自 1986 年起，吴文君等人从苦皮藤根皮与叶片提取物中分离鉴定出 60 余种 DHβAF 型倍半萜⁴⁻⁶。其中，苦皮藤素 V 已在我国登记并实现商品化杀虫剂生产，该化合物作用于昆虫 VATP 酶 H 亚基，可有效防治菜青虫（鳞翅目）、东亚飞蝗（直翅目）等多种农业害虫⁷。但苦皮藤体内苦皮藤素 V 本底含量很低，植物源原料供给短缺；同时因其立体化学结构复杂，苦皮藤素 V 的化学合成至今尚未实现。合成生物学与代谢工程已经成为在微生物宿主中高效合成多种结构复杂天然产物的有力工具，例如秋水仙碱类生物碱⁸、紫杉醇前体巴卡亭 Ⅲ⁹。但开展上述异源合成工作，需要完整解析苦皮藤素 V 的生物合成通路。

DHβAF 类倍半萜的生物合成起始于法尼基焦磷酸（FPP），随后在倍半萜合酶（STS）与细胞色素 P450（CYP）的共同作用下环化生成四氢呋喃环；再经过后修饰酶催化的羟基化、酰化等一系列修饰反应，最终生成目标产物。本课题组前期对苦皮藤开展转录组分析 ¹⁰，筛选得到参与 DHβAF 倍半萜生物合成的候选基因，包括倍半萜合酶、P450 以及 BAHD 酰基转移酶编码基因。基于上述分析，我们提出苦皮藤素 V（NW41）的生物合成通路假说（图 1a），但该通路中参与苦皮藤素 V 合成的基因仍有待实验验证。近年来，比较基因组与转录组分析是解析植物生物合成通路、探究物种进化的重要手段，可为合成生物学与农学研究提供重要支撑 ¹¹。

本研究报道首个高质量、单倍型解析的染色体水平苦皮藤参考基因组，用于解析 DHβAF 倍半萜的生物合成过程。比较基因组分析表明，近期全基因组复制事件产生的倍半萜合酶复制基因，以及 CYP71BE 亚家族的基因扩张，对苦皮藤素 V 合成通路进化至关重要。本研究整合基因组数据、共表达分析与功能验证，鉴定得到 CaTPS16 为 γ桉叶醇合酶，并证实 CYP71BE416 可氧化 γ桉叶醇，催化形成四氢呋喃环骨架 α沉香呋喃。此外，将上述基因导入酵母，实现 α沉香呋喃的从头合成。本研究为解析苦皮藤素 V 生物合成通路、揭示卫矛科四氢呋喃环的进化机制提供基础理论依据。

结果

苦皮藤中苦皮藤素 V 的推测生物合成通路与基因挖掘

首先，采用液相色谱质谱联用技术（LCMS）分析苦皮藤根、叶、茎、花四种器官的化学成分（图 1b），至少可检测到 6 种 DHβAF 类倍半萜（NW31、NW32、NW35、NW41、NW49、NW61），该结果佐证了我们所提出生物合成通路的合理性。随后对 11 份组织样本（3 个发育阶段根、3 个发育阶段叶、2 个发育阶段茎、3 个发育阶段花）中的主要化合物 NW31、NW32、NW35、NW41、NW49、NW61 开展定量检测（附图 18）。定量结果表明，根组织中 DHβAF 类倍半萜的积累量显著高于叶与茎组织（附表 1）。

为系统挖掘参与苦皮藤素 V 生物合成的候选基因，本研究完成苦皮藤染色体水平基因组的测序、组装与注释。基于 78.31 Gb（测序深度 244.41×）Illumina 双端短读段开展 Kmer 分析，采用 Kmer=17 评估得到苦皮藤基因组大小约 330 Mb，杂合度 0.61%（附图 9、附表 2、附表 3）。利用约 44.07 Gb（144×）PacBio 长读段进行从头组装，经短读段纠错，并结合 43.40 Gb HiC 数据（测序深度 135×）完成 scaffold 挂载（附表 2），最终获得两套单倍型解析的基因组，每套单倍型均锚定至 23 条假染色体（图 1c、附图 10）。单倍型 A（HA）组装大小 321.88 Mb，单倍型 B（HB）组装大小 321.47 Mb，scaffold N50 分别为 14.31 Mb、14.01 Mb（附表 4、附表 5）；两套单倍型 GC 含量一致，均为 35.2%（附表 5）。Illumina 短读段比对至 HA、HB 的比对率分别高达 97.73% 与 97.74%（附表 6）。BUSCO 评估显示两套单倍型完整保守同源基因占比均为 98.9%，证明组装具备高连续性与完整性（附表 5、附表 7）。

基因预测注释得到 HA 包含 29 364 个蛋白编码基因，HB 包含 29 090 个蛋白编码基因（附表 5）；超过 97% 的基因可在 NR、InterPro、SwissProt、Pfam、EggNOG、TAIR 至少一个数据库获得功能注释支持（附表 8）。BUSCO 评估基因集完整性，HA 为 96.5%，HB 为 94.9%（附表 7）。重复序列在 HA、HB 基因组中占比分别为 74.59%（240.08 Mb）与 75.87%（243.88 Mb）（附表 9）。非编码 RNA 鉴定结果：HA 识别 2 260 条 ncRNA，HB 识别 2 278 条 ncRNA（附表 10）。

两套单倍型基因组序列一致性达 98.57%（附图 11、附表 11）；共线性分析检测到 188 个受结构变异与序列分化干扰的共线性区块，包含 13 个倒位（HA 总长 374 kb，HB 总长 488 kb）、45 个易位（HA 总长 1 317 kb，HB 总长 1 262 kb）；其中较大变异包括 23 号染色体上一段 140kb 倒位、4 号染色体上一段 56kb 易位（附图 12）。共检测到 1 291 912 个 SNP 以及 224 078 个小于 50 bp 的插入缺失（Indel）；其中仅 7 962 个 SNP（0.56%）与 10 821 个 Indel（4.83%）会造成蛋白序列改变（补充数据 1）。上述结果表明两套单倍型在基因组大小、基因组成层面高度相似，但仍存在可观的结构变异与序列多态性。同时遍历全部假染色体统计模糊碱基 N，两套单倍型均未检测到组装缺口，体现该染色体水平组装的极高连续性，可支持结构变异的精准定位。若无特殊说明，后续分析均使用单倍型 HA。

系统发育分析揭示苦皮藤发生 β 全基因组三倍化（β-WGT）事件

选取 17 个代表性植物物种开展同源基因聚类，解析苦皮藤系统发育地位。共鉴定得到 21 148 个同源基因簇，其中 8 350 个为全部物种共有，包含 682 个单拷贝同源基因簇（附图 13）。苦皮藤 26 369 个基因归属于 13 693 个同源簇，其中 11 个为物种特有同源簇（附表 12）。基于 628 个单拷贝同源基因构建高可信度系统发育树，结果显示苦皮藤与雷公藤聚为单系支，代表卫矛科；二者分化时间约 1370 万年前（8002020 万年前）。卫矛科与毛果杨、蓖麻共同构成 COM 演化支（卫矛目酢浆草目金虎尾目），该演化支的共同祖先可追溯至约 9610 万年前（878010620 万年前）（图 2a）。

基于系统发育树开展基因家族扩张与收缩分析。相较于苦皮藤雷公藤最近共同祖先，苦皮藤发生显著拷贝数变异（p <0.05）的扩张基因家族 181 个、收缩基因家族 139 个（图 2a）。KEGG 通路富集显示，扩张基因显著富集于 "代谢通路""次生代谢产物生物合成" 以及 "倍半萜与三萜生物合成" 通路（附图 14），提示扩张基因很可能与苦皮藤次生代谢、尤其倍半萜和三萜合成密切相关。

已有大量研究表明，全基因组复制（WGD）与小规模复制（SSD）是物种形成、基因组扩张与功能特化的重要进化驱动力 ¹³。为解析苦皮藤全基因组复制历史，统计苦皮藤、COM 支代表物种（雷公藤、蓖麻、毛果杨）共线性区域内旁系同源基因的 Ks（同义替换率）与 4DTv（四重简并第三密码子颠换值）。苦皮藤基因组内旁系同源基因 Ks 分布出现两个明显峰值，分别约为 2.08 与 0.20；Ks≈2.08 对应双子叶植物共有的古老 γ 全基因组三倍化事件（γWGT）；Ks≈0.20 的晚近峰值说明苦皮藤在双子叶 γWGT 之后发生过一次新近全基因组复制事件（图 2b）。全基因组共线性分析观察到苦皮藤多条染色体之间存在大片共线性区块，并伴随大规模基因组重排（图 2c）。雷公藤的 Ks 分布模式与苦皮藤高度接近；基因组共线性比对显示二者存在极强宏观共线性（图 2d），说明卫矛科祖先经历过一次共同的全基因组复制事件。苦皮藤与雷公藤物种间同源基因 Ks 峰值约 0.08，证明两物种分化发生在这次卫矛科特有全基因组复制之后，4DTv 分析进一步印证上述结论（附图 15）。

以葡萄作为参照（葡萄在双子叶 γWGT 之后未发生新近多倍化事件）开展跨物种共线性分析：78.2% 苦皮藤基因可与葡萄基因形成共线性区块，覆盖葡萄 77.1% 基因区域；其中 24% 葡萄基因对应苦皮藤 3 个同源区段，29% 对应 2 个区段，19% 对应 1 个区段（附图 16），苦皮藤与葡萄基因组呈现典型 1:3 共线性关系（图 2e）。综合证据支持卫矛科共同经历一次 β 全基因组三倍化事件（βWGT），该事件发生时间约 3430 万年前。

基因复制是物种进化的重要驱动力 ¹⁴。本研究共识别 25 542 个复制基因，分为五类：WGD 复制基因 21 284 个（83.3%）、分散复制 775 个（3.03%）、转座复制 1 526 个（5.97%）、串联复制 1 419 个（5.55%）、邻近复制 538 个（2.10%）（补充数据 2）。该结果表明，全基因组复制在苦皮藤基因组演化中占据主导地位，基因组中大部分基因来源于复制事件。

结果

参与 DHβAF 类倍半萜生物合成的特异性 TPS 基因鉴定

萜类合酶（TPS）是萜类生物合成的关键酶，在生成结构多样的萜类碳骨架过程中发挥核心作用。DHβAF 型倍半萜的生物合成起始于法尼基焦磷酸（FPP）在倍半萜合酶（STS）催化下的环化反应。本研究采用已报道的 HMM 模型（PF03936、PF01397）从苦皮藤基因组中鉴定得到 41 个 TPS 基因。基于 TPS 氨基酸序列比对构建系统发育树，参照葡萄与拟南芥 TPS 的分类体系 ¹⁵,¹⁶，将这些 TPS 划分为 TPSa、TPSb、TPSc、TPSe/f、TPSg 共 5 个亚家族（图 3a，附图 17）。其中 TPSa 亚家族主要由倍半萜合酶构成，该亚家族基因大多催化生成单环或双环倍半萜 ¹⁷,¹⁸。鉴于 DHβAF 型倍半萜属于双环结构，本研究将 TPSa 亚家族作为挖掘苦皮藤功能 TPS 基因的重点对象。

共鉴定得到 12 个 TPSa 家族基因，注释结果均为 ()大根香叶烯 D 合酶。由于其催化产物与 DHβAF 结构高度相似，大根香叶烯类合酶具备较高的研究价值，将这 12 个基因命名为CaTPS5 CaTPS16 （附表 13）。表达量（FPKM）分析显示，CaTPS6 、CaTPS15 与CaTPS16 的表达水平和苦皮藤根中 DHβAF 类倍半萜含量高度相关，皮尔逊相关系数（PCC）＞0.95（附表 14）。其中CaTPS9 仅编码 138 个氨基酸的截短蛋白；已知植物倍半萜合酶通常由 550580 个氨基酸组成 ¹⁹，据此判断CaTPS9 为假基因，不再开展后续功能分析。

为解析 DHβAF 型倍半萜的生物合成，本研究对其余 11 个 CaSTS 开展体外酶活表征。将纯化后的重组蛋白与底物 FPP 孵育，产物采用 GCMS 检测（附图 18）。结果显示，CaTPS5、CaTPS7、CaTPS8、CaTPS13、CaTPS14 均可催化生成大根香叶烯 D（图 3b，附图 19，附表 15）。CaTPS6 与 CaTPS16 则主要生成 γ桉叶醇，同时伴随少量副产物，包括榄香素、7表α桉叶醇、α桉叶醇与隐缬草二醇（图 3c，附图 19，附表 15）。CaTPS16 的催化活性显著高于 CaTPS6，因此选为后续重点研究候选基因。CaTPS10 、CaTPS11 、CaTPS12 、CaTPS15 未检测到酶促产物。

在上述倍半萜产物中，γ桉叶醇是双环倍半萜，与同为双环分子的 DHβAF 结构相似度最高，是苦皮藤素 V 的核心前体骨架。γ桉叶醇与 DHβAF 拥有完全一致的环化模式，即 C1C10 环化与 C2C7 环化。1968 年 Marshall 报道 DHβAF 的化学合成路线中，表γ桉叶醇是关键中间体 ²⁰。据此我们推测，CaTPS6 与CaTPS16 参与苦皮藤素 V 生物合成通路，γ桉叶醇是该通路的关键中间体。

γ-桉叶醇在酵母中的从头生物合成

为高效筛选催化 γ桉叶醇向 DHβAF 衍生物转化的 CYP 候选基因，本研究对乙酰CoA 合成途径与甲羟戊酸（MVA）途径进行设计与优化，以期实现 γ桉叶醇的高水平合成（图 4a）。

将CaTPS16 整合至菌株 Sc027²¹ 的 HO 位点，构建酿酒酵母细胞工厂 LWG01，γ桉叶醇产量达到 80.2 mg/L。MVA 途径提供 γ桉叶醇的直接前体 FPP；已有研究通过过表达 MVA 途径关键基因获得 FPP 供给提升的工程菌株 Sc027²¹。文献表明，过表达upc21 能够提高工程酿酒酵母的倍半萜合成能力 ²²。本研究将upc21 整合至 LWG01 的GAL80 位点，得到菌株 LWG02，γ桉叶醇产量由 80.2 mg/L 提升至 140.2 mg/L。进一步在GAL80 敲除的调控背景下，使用葡萄糖诱导型启动子P_HXT1替换ERG9 自身启动子，借助葡萄糖将碳流从生长代谢重定向至萜类合成通路，促进萜类物质积累 ²³；得到工程菌株 LWG03，γ桉叶醇产量达到 342.32 mg/L（图 4b）。

乙酰CoA 是异源合成倍半萜的 MVA 途径起始底物，乙酰CoA 供给不足常常限制酵母中倍半萜的高效合成 ²⁴。非氧化糖酵解途径（NOG）依靠木酮糖5磷酸特异性磷酸酮醇酶（PK）与磷酸转乙酰酶（PTA），可将 1 分子葡萄糖转化为 3 分子乙酰CoA，碳理论得率 100%，远高于 EMP 糖酵解途径的 66%²⁵。参照已发表策略 ²⁶，将肠膜明串珠菌来源磷酸酮醇酶基因LmxPK 与克氏梭菌来源磷酸转乙酰酶基因CkPTA 整合至 LWG03 的GPP1 位点，构建菌株 LWG04，γ桉叶醇产量提升至 693.7 mg/L（图 4b）。

为进一步增大胞质乙酰CoA 通量，敲除 LWG04 中参与乙酰CoA 竞争消耗的胞质苹果酸合酶基因MLS1 与过氧化物酶体柠檬酸合酶基因CIT2 ²⁶；双敲除菌株 LWG05 的 γ桉叶醇产量达到 1040.53 mg/L（图 4b），相比已报道荷花NnTPS10 工程酵母的最高产量（801.66 mg/L）提升 1.29 倍 ²⁷。CaTPS16 与 NnTPS10 蛋白序列相似度为 40%（附图 20）；体外酶活证实二者均特异性利用 FPP 生成不同桉叶烷型倍半萜，不能以 GPP 为底物合成单萜（附图 21）。稳态动力学实验表明，CaTPS16 的催化效率是 NnTPS10 的 1.23 倍（附表 16）。

利用核磁共振（NMR）进一步确认 γ桉叶醇、大根香叶烯 D、7表α桉叶醇、隐缬草二醇的化学结构（附图 2225）。电子圆二色谱（ECD）确定 γ桉叶醇绝对构型为 (2R ,4aR )异构体，即 (+)γ桉叶醇；旋光色散（ORD）实验进一步验证该结果（附图 26，附表 17）。

结合基因组与转录组分析鉴定苦皮藤中关键 CYP 基因

细胞色素 P450（CYP）家族是植物中规模最大的酶家族，参与多种复杂天然产物的生物合成。CYP 家族基因同源性较低，约为 40%，大量基因功能仍未阐明 ²⁸。为解析苦皮藤素 V 合成的分子机制，本研究基于 HMM 模型（PF00067）在苦皮藤基因组中鉴定得到 315 个 CYP 基因，大致分为 A 型与非 A 型亚家族（附图 27）。多数参与倍半萜生物合成的 CYP（包括 CYP71、CYP76、CYP706、CYP82 亚家族）归属于 CYP71 进化支 ²⁹，本研究共识别 101 个隶属于 CYP71 进化支的基因（图 5a）。

参与特化次生代谢的通路基因通常具有相似的表达模式 ³⁰。CaTPS16 在根中的表达与苦皮藤素 V 合成呈正相关，据此推测，催化 γ桉叶醇生成 DHβAF 衍生物的 CYP 基因同样具备根优势表达特征。以CaTPS16 为诱饵基因，对苦皮藤根、花、茎、叶转录组中的 101 个 CYP 转录本开展共表达分析，筛选得到 23 个与CaTPS16 表达高度相关的候选 CYP 基因，作为后续重点研究对象（图 5b）。

次生代谢通路基因普遍存在家族扩张现象 ³¹；这是植物提升次生代谢产物、适应环境的重要进化策略，也可用于从海量基因组数据中筛选功能相关基因 ³²。基因家族扩张分析显示，23 个候选 CYP 中有 9 个发生显著扩张。除CYP83F151 （CaA04G00594）以外，其余 8 个基因CYP71BE83 （CaA05G00613）、CYP71BE414 （CaA11G00952）、CYP71BE415 （CaA11G00954）、CYP71BE404 （CaA11G00956）、CYP71BE209 （CaA11G00957）、CYP71BE211 （CaA11G00958）、CYP71BE416 （CaA11G00959）、CYP71BE417 （CaA11G00960）均属于 CYP71BE 亚家族（图 5a，附表 18）。该结果表明，CYP71BE 亚家族扩张在苦皮藤素 V 合成通路进化过程中发挥重要作用。除CYP83F151 位于 04 号假染色体、CYP71BE83 位于 05 号假染色体外，其余候选 CaCYP 基因几乎全部聚集于 11 号染色体。

对苦皮藤 11 号染色体上的 CYP 基因簇开展精细微共线性分析，与 COM 演化支（卫矛目酢浆草目金虎尾目）代表物种雷公藤、毛果杨、蓖麻，以及亲缘关系更远的双子叶植物葡萄进行比对（图 5c）。苦皮藤 A11 染色体上形成紧密串联排列的 CYP 基因簇，共包含 15 个 CYP 基因，其中 7 个为本研究候选基因，多数相邻拷贝转录方向一致。与雷公藤比对，未鉴定到可匹配该 CYP 基因簇的微共线性区块，说明该基因座在雷公藤中缺失或经历了剧烈基因组重排，两个卫矛科物种之间无法直接比对串联复制模式。而苦皮藤与 COM 演化支其它物种之间存在保守的微共线性，共享包含 CYP 基因的同源基因组区段，说明 COM 演化支共同祖先已经存在该 CYP 原始基因座。葡萄虽不属于 COM 演化支，同样存在该 CYP 同源区段，提示该基因座的祖先基因组背景早于 COM 演化支分化，在早期双子叶植物中就已经出现。

尽管该祖先基因座整体保守，但不同物种间基因拷贝数与局部基因排布差异显著。苦皮藤通过局部串联复制发生物种特异性 CYP 基因扩张，基因簇规模远大于毛果杨、蓖麻、葡萄。该进化模式表明，苦皮藤与共同祖先分化之后，该 CYP 基因座发生大量串联复制，推动基因家族功能分化（补充数据 2）。据此推测，这些 CYP 基因具备催化 γ桉叶醇羟基化的潜力，是苦皮藤素 V 生物合成的候选基因。

CaCYP 候选基因的功能鉴定

参照已被广泛验证的功能表征体系 ³¹，在酿酒酵母中异源表达候选 CaCYP 蛋白以解析其生化活性。将 9 个候选 CYP 基因（CYP83F151 、CYP71BE83 、CYP71BE414 、CYP71BE415 、CYP71BE404 、CYP71BE209 、CYP71BE211 、CYP71BE416 、CYP71BE417 ）的全长 cDNA，连同拟南芥AtCPR1 一同克隆至 pESCUra 表达载体；转化 BY4741 菌株，分别获得工程菌株 LWG06LWG14。收集诱导表达后的酵母微粒体蛋白，以 γ桉叶醇为底物开展体外酶活实验。

结果显示，CYP71BE209 、CYP71BE211 、CYP71BE416 可以催化生成带有醚环结构的倍半萜 α沉香呋喃；产物分子量m/z=220 ，质谱图谱与 NIST 数据库比对确认结构。其中 CYP71BE416 催化效率最高，酶活分别为 CYP71BE209 的 1.23 倍、CYP71BE211 的 1.08 倍（图 5d，附图 28，附表 19）；同时CYP71BE416 在根组织中的表达量高于CYP71BE209 与CYP71BE211 （附图 29）。CYP71BE404 主要产物为酮基倍半萜卡里松，由连续氧化生成（m/z=236 ，质谱与 NIST 标准库匹配），同时生成少量 α沉香呋喃。CYP71BE416、CYP71BE211、CYP71BE209、CYP71BE404 蛋白序列相似度为 72.61%（附图 30）。CYP83F151 、CYP71BE83 、CYP71BE414 、CYP71BE415 、CYP71BE417 未检测到催化活性。

四氢呋喃环骨架 α-沉香呋喃在酵母中的从头合成

在酵母中共表达CaTPS16 与CYP71BE416 即可实现 α沉香呋喃的生物合成。为解析尚未阐明的苦皮藤素 V 完整通路，构建能够合成前体 α沉香呋喃的酵母底盘，用于后续下游基因挖掘。本研究筛选不同来源的 NADPH细胞色素 P450 还原酶（CPR），同时采用 CYPCPR 融合蛋白策略提升 α沉香呋喃产量（图 6a）。

CYP 的催化效率是制约终产物产量的限速步骤，酶活高度依赖 CYP 与 CPR 之间的氧化还原偶联效率 ³³。原始菌株 Sc027 中含有单拷贝黄花蒿AaCPR 基因，本研究敲除 LWG05 中的AaCPR ，得到工程菌株 LWG15，用于筛选与 CYP71BE416 适配的 CPR。利用 HMM 模型（PF00667、PF00258、PF00175）从苦皮藤基因组鉴定得到 23 个 CPR 基因；开展共表达分析，筛选出 8 个根特异性表达的候选 CPR（CaCPR1CaCPR8 ），其表达模式与苦皮藤素 V 通路基因CYP71BE416 、CaTPS6 、CaTPS16 相近，进入后续验证（图 6b，附表 20）。将上述 8 个苦皮藤 CPR，以及 4 个外源 CPR（AtCPR1 、AtCPR2 、东北红豆杉TasCPR GenBank: AY571340、中国红豆杉TanCPR GenBank: AY959320）分别与CYP71BE416 在 LWG15 中共表达。

表达CaCPR2 的 LWG17 菌株 α沉香呋喃产量最高，达到 27.75 mg/L；印证内源 CPR 相较异源来源具备更优电子传递效率 ³³（图 6c）。已有研究表明 CYPCPR 融合蛋白能够提升电子传递效率与催化活性 ³⁴,³⁵。本研究选用 3 种不同连接肽（GGG、GSTSSG、GSTSSGSG），在 LWG15 中构建 CYP71BE416CaCPR2 融合表达载体；其中融合蛋白 CYP71BE416GGGCaCPR2 在 LWG28 菌株中产量最优，α沉香呋喃达到 43.89 mg/L（图 6d）。将CYP71BE416GGGCaCPR2 表达盒整合至 LWG15 的高表达整合位点YORWΔ22 ³⁶，得到最终工程菌株 LWG31。在 5 L 生物反应器发酵条件下，LWG31 可积累 7.82 g/L γ桉叶醇与 445.35 mg/L α沉香呋喃，为目前微生物底盘报道的最高产量。利用 NMR 进一步确认 α沉香呋喃化学结构（附图 31）；电子圆二色谱（ECD）解析其绝对构型为 (1R ,6S ,9R )异构体，即 (±)α沉香呋喃（附图 32）。

讨论

苦皮藤素 V 属于 DHβAF 类倍半萜，具有独特的四氢呋喃环结构，具备强烈的拒食与杀虫活性，是国内广泛使用的生物农药⁷,³⁷。带有特征四氢呋喃环的 DHβAF 类倍半萜广泛分布于卫矛科植物，拥有显著的生物活性 ³⁸,³⁹。以往针对苦皮藤素 V 生物合成的研究仅依靠转录组数据，只鉴定到部分倍半萜合酶基因 ¹⁰，而苦皮藤素 V 完整生物合成途径以及四氢呋喃环的形成机制一直未见解析。本研究报道了苦皮藤首个染色体水平、单倍型分辨的参考基因组，单倍型 A（HA）组装大小 321.88 Mb，单倍型 B（HB）为 321.47 Mb，scaffold N50 分别为 14.31 Mb 与 14.01 Mb，为解析苦皮藤素 V 生物合成奠定了基因组基础。据我们所知，本研究首次解析萜类分子中四氢呋喃环的生物合成通路，为该重要杂环骨架的生物制造提供了多种研究思路。

本研究证实苦皮藤经历一次晚近全基因组复制事件；全基因组复制与串联复制共同驱动苦皮藤基因组中苦皮藤素 V 合成相关基因家族发生扩张。结合基因组与转录组分析，筛选得到 12 个 TPSa 亚家族的倍半萜合酶基因，注释均为 ()大根香叶烯 D 合酶，开展后续功能验证。除CaTPS8 、CaTPS9 、CaTPS15 之外，其余多数基因均来自全基因组复制扩张（附表 13）。功能实验证明CaTPS6 与CaTPS16 负责催化生成 γ桉叶醇（图 3c），二者在苦皮藤根组织高丰度特异性表达，与苦皮藤素 V 主要积累部位相吻合。本研究通过共表达、基因家族扩张与串联复制分析筛选得到 9 个 CYP71BE 亚家族候选基因。体外功能证实，CYP71BE209、CYP71BE211、CYP71BE416 能够催化 γ桉叶醇转化生成 α沉香呋喃，构建卫矛科特有的四氢呋喃环；该结构与带有酮基或双羟基的桉叶烷型倍半萜存在本质差异。本研究鉴定到植物倍半萜生物合成中一类全新催化反应的 CYP 酶，拓展了对 P450 酶催化多样性的认知，也拓宽了 CYP71BE 亚家族的产物谱。

更为重要的是，本研究的基因组序列为解析四氢呋喃环型倍半萜以及苦皮藤素 V 的进化提供线索。随着越来越多植物基因组数据发布，研究发现特化代谢通路的合成酶基因在基因组上并非随机分布，常常以串联阵列、基因对或者基因簇的形式物理连锁⁴⁰。但苦皮藤中CaTPS6 、CaTPS16 、CYP71BE209 、CYP71BE211 、CYP71BE416 并未形成基因簇，这与绝大多数植物次生代谢通路基因不聚集的现象一致⁴¹，例如花青素合成通路⁴²、黄连苄基异喹啉类生物碱通路⁴³。基因家族扩张分析在苦皮藤 11 号假染色体上鉴定到包含 8 个 CYP71BE 成员的 CYP 串联基因阵列。雷公藤基因组不存在该 CYP 基因座的共线性区段，而该基因座在 COM 演化支其它物种以及葡萄中保守但发生差异性扩张（图 5c）。综合以上证据推测：卫矛科共有的 βWGT 事件为苦皮藤该 CYP 基因座发生局部串联复制创造条件，最终产生物种特异性的基因扩张，体现卫矛科内部 CYP 基因家族截然不同的进化轨迹。

CYP71BE 家族基因功能分析可将其划分为三类。第一类包含 CYP71BE209、CYP71BE211、CYP71BE416，三者催化活性一致，能够将 γ桉叶醇转化生成 α沉香呋喃。类似现象见于楤木齐墩果烷型三萜合成通路：AeCYP72A935 与AeCYP72A936 位于楤木 9 号染色体 130 kb 区间内，二者催化相同反应⁴⁴。第二类代表为 CYP71BE404，主产物为卡里松，同时少量生成 α沉香呋喃；CYP71BE404 这种杂泛催化活性，可能是通路功能分化的进化起点⁴⁵,⁴⁶。第三类包括 CYP71BE83、CYP71BE414、CYP71BE415、CYP71BE417，未检测到催化活性。这 8 个 CYP71BE 基因由苦皮藤进化过程中的基因复制产生，并演化出各异的功能⁴⁷。雷公藤三萜内酯（triptonide）合成通路也存在相似案例：TwCYP71BE83 、TwCYP71BE85 、TwCYP71BE86 在 CM023878 染色体上串联排布；TwCYP71BE85 与TwCYP71BE86 参与贝壳杉烷重排二萜母核合成，而TwCYP71BE83 丧失功能⁴⁸。丹参酮基因簇中串联复制基因SmCPS1 与SmCPS2 ，在不同组织参与丹参酮合成⁴⁹,⁵⁰。CYP 串联基因阵列为解析特化代谢通路中 CYP 介导的连续催化步骤的进化提供参考。例如那可丁基因簇中串联基因CYP82X2 与CYP82X1 ，分别催化那可丁合成中高度专一的连续两步反应⁵¹,⁵²；丹参中CYP76AH1 与CYP76AH3 亲缘关系很近，分工催化丹参酮合成的顺序化反应⁵³,⁵⁴。苦皮藤的 CYP 基因也可能通过功能分化，分工完成苦皮藤素 V 合成的连续催化过程。后续我们计划在酵母中共表达CYP71BE209 、CYP71BE211 、CYP71BE416 、CYP71BE404 与CYP71BE83 、CYP71BE414 、CYP71BE415 、CYP71BE417 、CYP83F151 ，以期捕获苦皮藤素 V 生物合成的多个关键中间体，这将是后续值得深入研究的方向。

此外，本研究探究了CaTPS16 与CYP71BE416 在生物工程领域的应用潜力，构建了合成 α沉香呋喃的酿酒酵母工程菌株（图 6）。该结果为后续挖掘下游功能酶基因打下基础，预示CaTPS16 与CYP71BE416 具备生物工程合成苦皮藤素 V 的应用前景。据我们所知，CaTPS16 与CYP71BE416 是首批报道的 DHβAF 类倍半萜四氢呋喃环生物合成基因。该研究成果为 DHβAF 活性化合物及其药物开发奠定基石，也为制备临床相关衍生物提供底盘平台。

综上，本研究极大丰富了卫矛科的基因组资源。苦皮藤基因组助力发现功能偶联的CaTPS16 与CYP71BE416 ，二者共同启动苦皮藤素 V 特征四氢呋喃环骨架 α沉香呋喃的生成。该发现阐明了四氢呋喃环的生物合成起源，揭示该特征杂环的进化线索：四氢呋喃环的产生来源于 CYP71BE 亚家族一个进化分支发生串联复制与新功能化。本研究不仅为药用活性物质苦皮藤素 V 的合成起源与进化提供重要见解，也为农业、医药领域应用的 DHβAF 类倍半萜四氢呋喃环骨架提供普适性进化参考。

方法

植物材料与 DNA 测序

于中国陕西省咸阳市杨凌区西北农林科技大学博览园，采集苦皮藤自然分布生境（108.07°81′90″N，34.27°24′26″）的新鲜根、叶、茎、花组织。本研究所用 DHβAF 类倍半萜标准品 NW31、NW32、NW35、NW41、NW49、NW61 由西北农林科技大学魏少鹏教授馈赠。采用超高效液相色谱质谱（UPLCMS）测定苦皮藤根、茎、叶组织中 DHβAF 类倍半萜的含量。甲酸、乙腈为 UPLC 色谱级（美国赛默飞世尔）。 使用 Waters ACQUITY 超高效液相色谱系统，搭配 ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 × 100 mm，1.7 μm，美国 Waters），柱温 35 ℃完成样品分离；质谱检测采用 Xevo™ TQXS 串联四极杆质谱仪（美国 Waters）。

提取苦皮藤根组织 DNA，通过琼脂糖凝胶电泳与 Qubit 荧光定量仪（赛默飞）评估 DNA 质量。参照 Illumina 建库流程构建插入片段 500 bp 的双端测序文库，在 Illumina HiSeq 2500 平台测序。PacBio Sequel 测序按照官方试剂盒流程制备 SMRTbell™文库。构建 4 组独立 HiC 文库，由安诺优达基因科技在 Illumina HiSeq 2500（PE125 bp）平台完成测序。

基因组大小评估

使用 fastp v0.23.2 默认参数对 Illumina 短读长进行质控；采用 Jellyfish v2.3.0 基于 kmer 分布估算基因组大小，kmer 设置为 17 bp。

基因组组装

过滤后的长读长使用 NextDenovo v2.3.1 组装；利用 Racon v1.4.20 默认参数进行三轮纠错。随后使用 FALCON_phase 完成 contig 组装。为将 contig 锚定至染色体，使用 Juicer v1.555 与 3DDNA (3Dde novo assembly) v.18011456 流程将 HiC 读长比对至组装得到的 contig；借助 JuiceBox 人工校正，最终得到 23 条染色体。 采用 embryophyte_odb10 数据集，通过 BUSCO v5.2.1 评估组装完整度；同时使用 HISAT2、BWA 将 Illumina 短读长比对回基因组，辅助评估组装质量。

重复序列注释

结合同源比对与从头预测两种策略注释苦皮藤基因组重复序列。 同源预测：RepeatMasker v4.1.1，默认参数比对 Repbase v20.05 数据库。 从头预测：RepeatModeler v2.0.1（参数engine ncbi）构建物种特异性重复序列一致文库；使用 LTR_FINDER v1.07、LTRharvest v1.6.2、LTR_retriver v2.9.5 默认参数鉴定全长 LTR 反转录转座子，构建 LTR 文库。 调用 RepeatMasker v4.1.1 比对上述两套文库，注释基因组重复元件；最后依据基因组坐标合并同源预测与从头预测得到的重复序列结果。

蛋白编码基因注释

屏蔽基因组重复序列后，整合同源比对、从头预测、转录本证据 三套策略预测蛋白编码基因。 同源基因预测：Exonerate 将苦皮藤蛋白序列与拟南芥、水稻、马铃薯、番茄、玉米蛋白集比对。 从头基因预测：使用 Augustus、GeneMarkES、SNAP 多款软件。 转录本证据：Trinity 完成转录组从头组装，Stringtie 完成参考基因组引导的转录本组装；全部 RNAseq 读长比对至苦皮藤基因组，使用 PASA59 处理转录本。 通过 Evidence Modeler（EVM）60 整合上述所有基因模型，得到非冗余基因结构集。

功能注释：BLASTP 比对 NCBI NR 非冗余蛋白库、SwissProt 数据库；InterProScan 预测蛋白基序与结构域；eggnogmapper 获取基因 GO、KEGG 通路注释。

非编码 RNA 鉴定

tRNA 注释：tRNAscanSE v2.0.11 默认参数。 rRNA 注释：RNAmmer v1.2。 miRNA、snRNA：INFERNAL v1.1.4 的 cmscan 工具检索 Rfam 数据库完成预测。

单倍型变异分析

Minimap2 (v.2.17r941)，参数ax asm5，完成两套单倍型全基因组比对；SyRI v1.6 默认流程基于比对结果检测倒位、易位、复制、倒位易位、倒位复制等结构变异（SV）以及单核苷酸多态性（SNP）。Plotsr61 用于共线性可视化；snpEff (v5.4a) 完成 SNP 与 InDel 的功能注释。

基因组共线性与全基因组复制（WGD）分析

苦皮藤基因组开展种内、种间共线性分析：首先对蛋白序列执行 allagainstall BLAST；使用 MCScanX62 鉴定基因共线性与共线性区块；jcvi 包（v1.0.6）的 Python 版 MCScanX 可视化共线性基因对。 KaKs_Calculator 2.063，采用 YangNielsen（YN）模型计算同义替换率 Ks 与四简并位点替换率 4DTv。

系统发育分析

选取苦皮藤以及拟南芥、番木瓜、桃、蓖麻、可可、向日葵、毛果杨、枳、雷公藤、马铃薯、茄子、莴苣、黄瓜、葡萄、水稻、森林草莓共 16 个物种的蛋白序列开展基因家族聚类。对 17 个物种的全部基因进行如下过滤：（1）一个基因存在多个转录本时，仅保留编码区最长的转录本；（2）保留编码蛋白氨基酸长度大于 30 的基因用于后续分析。使用 OrthoFinder v2.2.7⁶⁴默认参数（开启msa参数）鉴定 17 个物种的旁系同源与直系同源基因家族。

基于 681 个单拷贝基因家族，采用最大似然法（ML）构建系统发育树。使用 MUSCLE 对单拷贝基因家族蛋白序列进行多序列比对，将各家族比对结果拼接形成超级比对矩阵；利用 RAxML v8.2.10，选用 PROTGAMMAJTTX 模型，设置 1000 次自举重复，构建 ML 系统发育树，水稻作为外类群。

将得到的最大似然树作为输入，使用 PAML 4.9i 软件包中的 MCMCTree 估算物种分化时间。燃烧期设置 5 000 000 次迭代，之后采样 20 000 次，采样频率为 5 000；设置两组独立重复运算检验收敛性。采用以下分化时间作为校正点：拟南芥番木瓜分化时间（6872 百万年前）⁶⁵；拟南芥毛果杨分化时间（100120 百万年前）⁶⁶；真双子叶植物冠群（125161 Ma）⁶⁷；被子植物冠群（195246 百万年前）⁶⁸。

使用 CAFE v5.0 推断基因家族扩张与收缩。设置K=3，采用伽马分布离散近似，解析系统发育树上各分支的基因家族变化。基于系统发育树中父子节点的基因家族大小，计算状态转换似然值，以条件概率作为检验统计量得到各分支 P 值，阈值 P＜0.05 筛选显著扩张、收缩的基因家族。对物种特异性扩张家族中的基因开展 GO、KEGG 通路富集分析。

基因组复制分析

使用 DupGen_finder⁶⁹流程，默认参数将复制基因划分为：全基因组复制 / 片段复制（共线性区块内≥10 对同源基因）、串联复制（连续相邻重复）、邻近复制（基因组邻近区域，间隔不超过 10 个基因）、分散复制（不属于上述三类的复制模式）；其余基因为单拷贝基因。利用 g:Profiler 工具包 go_profile 对五类复制模式的基因进行 GO 与 KEGG 富集分析，FDR 阈值 0.05 筛选显著富集条目。 采用公式\(\boldsymbol{T=Ks/2r}\)估算卫矛科 βWGT 发生时间；速率r依据苦皮藤与雷公藤化石校正的分化时间进行经验校准。

转录组分析

使用 FastQC v0.11.9 对花、叶、茎、根原始 RNA 测序读长进行质控与过滤，得到干净读长。高质量 clean reads 通过 HISAT v2.1.0 比对至苦皮藤参考基因组，StringTie 进行基因表达定量；调用 StringTie 内置 Python 脚本 preDE.py 将定量结果转换为计数矩阵。对各样品生物学重复取平均值，得到基因表达水平。

至少一个样本中 TPM（每百万转录本）≥1 的基因纳入后续分析。计算每对双向基因的皮尔逊相关系数（PCC）衡量基因表达相关性；采用互秩算法（MR）对 PCC 排序，MR≤300 的基因对判定为共表达基因。

CaTPS、CaCYP、CaCPR 基因家族的基因组挖掘

根据 PFAM 数据库中各家族保守结构域，构建 HMMER 搜索的结构域矩阵，在苦皮藤及其它物种基因组中鉴定、分类 CaTPS、CaCYP、CaCPR 基因家族。 CaTPS 家族：选取 PF01397、PF03936 两个 Pfam 结构域，在苦皮藤、雷公藤、毛果杨、蓖麻、拟南芥、葡萄、水稻基因组中 HMMER 检索；候选 CaTPS 至少匹配其中一个结构域。候选序列经 MAFFT v7.408 比对，GBlocks 修剪比对结果；RAxML v8.2.10 构建系统发育树，自举值 1000 次。

CaCYP 与 CaCPR 家族：HMMER 检索，PF00067 用于鉴定 CYP 基因；PF00667、PF00258、PF00175 用于鉴定 CPR 基因。将候选序列与 CYP 参考数据库比对，依据序列相似性标准完成分类：等位变异 97%，亚家族 55%，家族 40%；按照 CYP 标准化命名规则，将 CaCYP 划分为 A 型与非 A 型。选取同源氨基酸序列，RAxML v8.2.10 构建最大似然进化树。

CaTPS 基因功能表征

密码子优化后的 CaTPS 基因由苏州金唯智合成，克隆至 pET28a (+) 载体 NcoI/XhoI 酶切位点。重组质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3)；0.5 mM IPTG，16 ℃诱导蛋白表达 20 h。菌体裂解，4 ℃、16 000 g 离心 10 min 取上清，按照说明书使用 NiNTA 亲和树脂纯化重组蛋白；SDSPAGE 验证纯化蛋白分子量。

酶活反应体系 500 μL（50 mM TrisHCl pH 7.5、10 mM MgCl₂、5 mM DTT），2 mL 玻璃管中加入 50 μg 纯化蛋白、10 μM 法尼基焦磷酸（FPP）；30 ℃孵育 30 min。空载体转化菌株作为阴性对照。正己烷萃取反应液，用于 GCMS 检测。

CaCYP 基因功能表征

携带 CaCYP 候选基因的 pESCUra 载体分别转化酵母 BY4741，菌株同时表达拟南芥 NADPHCYP 还原酶AtCPR1 ，实现 P450 酶催化活性；转入空 pESCURA 载体的 BY4741 作为对照。 TEK 缓冲液配方：50 mM TrisHCl，1 mM EDTA，0.1 M KCl，pH 7.4。菌体 2000 g 离心 5 min 收集，重悬于 TEK，菌体湿重 0.5 g/mL，室温放置 5 min；再次离心收集菌体，重悬于 TESB 缓冲液（TE 缓冲液添加 0.6 M 山梨醇）。低温均质仪 26 ℃破碎细胞；17 300 g 离心 15 min，向上清中加入 NaCl 至终浓度 0.15 M、PEG4000 至终浓度 0.1 g/mL 沉淀微粒体；再次 17 300 g 离心 15 min，沉淀重悬于 TEG 缓冲液（TE 缓冲液含 20% 甘油 v/v），微粒体蛋白终浓度 40 mg/mL。

体外酶活体系 300 μL：100 mM TrisHCl（pH 7.4）、1 mM NADPH、0.5 mg 微粒体蛋白、100 μM 底物。30 ℃振荡孵育 2 h；加入 300 μL 乙酸乙酯萃取，萃取物用于 GCMS 分析。

酵母从头合成 α-沉香呋喃的菌株构建

底盘菌株 Sc027 过表达 MVA 途径 8 个关键基因，适合倍半萜合成 ²¹；将CaTPS16 整合至 Sc027 的 HO 位点，实现前体 γ桉叶醇合成。菌株同时过表达LmxPK 、CkPTA 、upc21 ；敲除MLS1 、CIT2 ；ERG9 启动子替换为HXT1 启动子。 为构建 α沉香呋喃合成菌株：将携带CYP71BE416 与不同 CPR 的 pESCURA 重组质粒，以及CYP71BE416linkerCaCPR3 基因片段，分别化学转化酵母 LWG07。采用标准醋酸锂法完成酿酒酵母转化。本研究所用全部质粒、菌株、引物详见补充数据表 3、4、5。转化子在尿嘧啶缺陷 SD 培养基筛选。

摇瓶发酵：单菌落接种至 50 mL 含 2% 葡萄糖的 SD 培养基，30 ℃、220 rpm 培养 120 h；分别在 36 h、60 h 补加乙醇作为碳源，终浓度 10 g/L。发酵液用 5 mL 乙酸乙酯萃取两次，萃取物用于 GCMS 检测。

气相色谱-质谱（GC-MS）分析

合并有机萃取液经旋转蒸发蒸干，残留物溶于 0.5 mL 正己烷，使用赛默飞 ISQLT 气相色谱质谱联用仪开展 GCMS 检测；分别采用 DB5（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，非极性色谱柱）、HP5MS（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm，非极性色谱柱）、DBWax（60 m × 0.25 mm × 0.25 μm，极性色谱柱）、BP20（50 m × 0.25 mm × 0.25 μm，极性色谱柱）四根色谱柱。

进样口温度 250 ℃；进样量 1 μL，分流进样（分流比 1:10）；载气为氮气，流速 1 mL/min。柱温程序：70 ℃保持 2 min；以 10 ℃/min 速率升温，DB5、HP5MS 升至 300 ℃，DBWax、BP20 升至 230 ℃，终温保持 5 min。质谱扫描质荷比（m/z）范围 35350。主要组分通过与标准品比对质谱图、保留时间，同时比对 NIST17 质谱库完成初步定性。为进一步确认化合物，运行 C5C22 烷烃混合标准品，计算所有检出化合物的保留指数（RI），并与 NIST 化学手册报道值进行比对。

化合物提取、纯化与结构解析

为获取足量样品用于结构解析，分别使用 LWG05 与 LWG31 菌株在 5 L 生物反应器（上海百仑生物）开展补料分批发酵，共培养 20 L 发酵液并进行萃取。发酵温度 30 ℃，通气量 2 vvm；通过调节搅拌转速 300600 rpm，使溶氧（DO）维持在 30% 以上。补料液按照已有文献方法配制，基于 pH 与溶氧信号自动补料：当溶氧＞50%、pH＞5.5 时，补料速率设置为 2 mL/min；pH 低于 5.5 时自动通入氨水。葡萄糖基本耗尽（约 15 h）时开始补料。

收集乙酸乙酯有机相，旋转蒸发浓缩，氮气吹干。挥发油粗品经硅胶柱层析纯化（洗脱剂乙醚 / 乙酸乙酯体积比 600:1 梯度变化至 100:1）；收集各馏分，采用薄层色谱（TLC）与 GCMS 检测。分离得到的化合物溶于氘代氯仿，使用 Bruker AVANCE III HD 400 MHz 核磁共振仪采集核磁共振（NMR）谱图。

理论电子圆二色谱（ECD）与旋光色散（ORD）计算

使用 Gaussian 16 软件包完成 γ桉叶醇与 α沉香呋喃的 ECD 理论计算。采用 Conflex 8.0 软件，MMFF94 力场开展构象搜索，能量窗口设置 7.0 kcal/mol；选取玻尔兹曼布居大于 0.5% 的构象，在真空条件下以 B3LYPD3 (BJ)/6311G (d,p) 级别进行结构再优化。γ桉叶醇以氯仿为溶剂测定 ORD；结构优化采用 B97XD/6311+G (d,p)，旋光性质计算采用 B97XD/AugccpVDZ，使用 SMD 溶剂化模型考虑溶剂效应。

统计学与可重复性

本研究分析过程未剔除任何数据；实验未做随机化处理。

Data availability

Data supporting the findings of this study are available in the article, supplementary materials, or public database. The raw genome and transcriptome sequencing data have been deposited into the National Center for Biotechnology Information BioProject under accession number PRJNA1292965 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA1292965. All the genes used in this study were listed in Supplementary Data 6. Source data are provided with this paper.

Code Availability

The scripts used for the genome survey, genome_assembly, genome_annotation, evolution_analysis and transcript_analysis can be freely and openly accessed at GitHub https://github.com/andyzhu1029/Cangulatus_Genome and have been archived with Zenodo70.

图 1 苦皮藤素 V 推测生物合成通路以及苦皮藤基因组统计信息

a 推测的生物合成通路及催化酶。STS：倍半萜合酶；CYP450：细胞色素 P450 酶；AT：酰基转移酶。FPP：法尼基焦磷酸；1：γ桉叶醇；2：α沉香呋喃；NW41：苦皮藤素 V。 b 苦皮藤根、茎、叶、花组织的 LCMS 总离子流图（TIC）。 c 单倍型解析的苦皮藤基因组组装全景圈图。由外圈至内圈各轨道依次代表：(Ⅰ) 染色体；(Ⅱ) GC 含量分布（滑动窗口 500 kb）；(Ⅲ) 基因密度；(Ⅳ) Gypsy 型转座子分布（滑动窗口 500 kb）；(Ⅴ) Copia 型转座子分布（滑动窗口 500 kb）；(Ⅵ) 重复序列密度（滑动窗口 500 kb）；(Ⅶ) 共线性区块，连线代表核心同源等位基因的对应关系。

绘制图 1c 所用源代码托管于 GitHub（https://github.com/andyzhu1029/Cangulatus_Genome），并已在 Zenodo 归档⁷⁰。

图 2 苦皮藤与其他植物的比较基因组学分析

a 基于 17 个植物物种的 681 个单拷贝基因家族拼接比对结果构建的系统发育树。分支节点旁黑色数字代表物种分化时间；绿色表示基因家族扩张，红色表示基因家族收缩；全基因组复制（WGD）与全基因组三倍化（WGT）发生时间标注于进化树对应位置。 b 苦皮藤、雷公藤、蓖麻、毛果杨与葡萄之间一对一直系同源基因的 Ks 分布。 c 不同染色体间的共线性关系，连线代表同源基因。 d 苦皮藤与雷公藤基因组同源染色体的宏观共线性比较。 e 共线性点图展示苦皮藤与葡萄基因组存在 1:3 的对应关系；X 轴为葡萄染色体水平基因组组装，Y 轴为苦皮藤染色体水平基因组组装。

绘制图 2b-2e 所用源代码托管于 GitHub（https://github.com/andyzhu1029/Cangulatus_Genome），并已在 Zenodo 归档⁷⁰。

图 3 苦皮藤大根香叶烯型倍半萜合酶（STS）的系统发育分析与功能鉴定

a CaTPS 基因的进化分析。热图展示 CaTPS 基因在苦皮藤根、茎、叶、花组织中的表达水平，采用 FPKM 值归一化并依据数值进行颜色映射；TPSa 亚家族成员以红色标记。

b、c CaTPS58、CaTPS1314、CaTPS16 体外催化法尼基焦磷酸（FPP）生成环化产物的 GCMS 分析。Empty 代表转入空载体的酵母对照；图中展示上述 CaTPS 酶催化得到的萜类产物化学结构。其中大根香叶烯 D（3）、α桉叶醇（6）、香木兰二醇（7）通过与标准品比对完成鉴定；γ桉叶醇（1）、榄香素（4）、7表α桉叶醇（5）通过比对 NIST17 质谱库完成鉴定。

图 4 苦皮藤素 V 生物合成前体 γ-桉叶醇在酵母中的从头生物合成

a 酵母中构建 γ桉叶醇合成代谢通路；通路改造部分以红色标注。乙酰CoA 通路中，过表达LmxPK 与CkPTA ，敲除MLS1 和CIT2 ，提升乙酰CoA 供给。MVA 通路中，过表达 MVA 通路全部基因，同时表达upc21 实现通路间接上调，提高法尼基焦磷酸（FPP）合成；将ERG9 原有启动子替换为P_HXT1 ，将碳流从细胞生长通路重定向至萜类生物合成通路。

b 各工程菌株的 γ桉叶醇产量。数据以平均值 ± 标准差展示（n=3 个生物学重复）。原始数据存放于 Source Data 文件。

图 5 CaCYP 基因筛选与功能鉴定

a 苦皮藤 CYP71 进化支的系统发育分析。绿色分支代表 CYP71BE 亚家族成员；采用最大似然法构建进化树，自举检验重复次数设置为 1000 次。

b CYP 基因与苦皮藤素 V 生物合成通路基因的共表达谱。CaTPS16 与CaTPS6 作为诱饵基因，标记为红色；基于皮尔逊相关系数（PCC）进行线性回归分析，筛选并展示与诱饵基因相关性排名前 25 的基因。

c 毛果杨、蓖麻、葡萄基因组中包含 CYP 基因的共线性区段。

d CYP 基因体外酶活分析。以纯化的 γ桉叶醇为底物，利用酵母微粒体开展体外酶活实验：CYP71BE209、CYP71BE211、CYP71BE416 能够生成带有醚环的倍半萜 α沉香呋喃（2）；CYP71BE404 催化生成两种 γ桉叶醇氧化产物 ------ 酮基倍半萜卡里松（8）与 α沉香呋喃（2）；CYP83F151、CYP71BE83、CYP71BE414、CYP71BE415、CYP71BE417 未检测到催化产物。仅表达AtCPR 的酵母微粒体作为阴性对照。

绘制图 5b、5c 所用源代码托管于 GitHub（https://github.com/andyzhu1029/Cangulatus_Genome），并已在 Zenodo 归档⁷⁰。

图 6 苦皮藤素 V 生物合成中四氢呋喃环骨架 α-沉香呋喃在酵母中的从头生物合成

a 酵母体内四氢呋喃环骨架 α沉香呋喃的生物合成通路示意图。采用 CPR 基因筛选与蛋白融合两种策略提升 CYP 基因的催化效率；本图由 PowerPoint 绘制。

b CaCPR 基因与苦皮藤素 V 生物合成通路基因的共表达谱。以CYP71BE209 、CYP71BE211 、CYP71BE416 、CaTPS16 和CaTPS6 作为诱饵基因；基于皮尔逊相关系数（PCC）开展线性回归分析，筛选展示与诱饵基因相关性排名前 25 的基因。

c CYP 与 CPR 基因最优组合筛选。

d CYP71BE416 与 CaCPR2 最优融合蛋白组合筛选。

e LWG31 菌株在 5 L 生物反应器补料分批发酵体系下合成 γ桉叶醇与 α沉香呋喃。补料发酵过程中 LWG31 菌株的菌体生长（黑色）、γ桉叶醇合成量（蓝色）、α沉香呋喃合成量（绿色）以及残余葡萄糖浓度（红色）的时间变化曲线。

绘制图 6b 所用源代码托管于 GitHub（https://github.com/andyzhu1029/Cangulatus_Genome），并已在 Zenodo 归档⁷⁰。数据以平均值 ± 标准差展示（n=3 个生物学重复）。原始数据存放于 Source Data 文件。