摘要
了解与年龄相关的神经生理变化，对于识别脑衰老生物标志物及制定对抗运动与认知衰退的策略至关重要。为探究多个领域中与年龄相关的变化模式，本研究评估了年轻（4月龄）、成年（14月龄）及老年（24月龄）小鼠的运动与认知表现、功能连接及突触组织结构。与年轻小鼠相比，成年小鼠的运动活性降低（−50.3%），前肢力量下降（−38.3%）；而老年小鼠则表现出空间记忆能力下降（−30.4%）及识别记忆能力下降（−40.3%）。高尔基-科克斯染色显示，不同脑区树突棘密度存在区域特异性变化：与成年小鼠相比，老年小鼠运动皮层II/III层锥体神经元数量增加，而内侧前额叶皮层及海马CA1区数量减少。免疫荧光分析表明，各脑区中 VGLUT 与 VGAT 的表达均随年龄发生变化。局部场电位记录显示，各年龄组间功能连接未见显著差异。通过机器学习整合行为学与电生理学特征进行探索性分析，分类准确率达0.798。尽管这一结果相较于仅使用行为学特征仅略有提升且无统计学显著性，但在成年与老年小鼠之间仍观察到最高的配对区分度（AUC = 0.861）。总体而言，这些研究结果对脑老化进行了多层面描述性分析，揭示了独特的行为与结构改变，同时功能连接性仍得以保留。
引言
衰老是一个基本的生物学过程，其典型特征是各组织及器官系统的功能进行性衰退，其中大脑尤其易受年龄相关变化的影响1,2。即使在生理性衰老过程中，若无明显神经退行性疾病，个体仍普遍会出现运动协调性、学习能力、记忆功能及执行功能的渐进性衰退3,4。值得注意的是，衰老是罹患主要神经退行性疾病（包括阿尔茨海默病与帕金森病）的最强风险因素，这表明年龄相关的神经改变可能为病理学改变的发生提供适宜的基础环境2。因此，探究大脑功能在衰老过程中的变化机制，不仅对界定健康衰老的轨迹至关重要，亦有助于识别那些会增加神经退行性疾病易感性的早期改变。在细胞水平上，突触完整性是贯穿个体生命周期大脑功能的关键决定因素，且已有大量研究利用可直接观测突触网络、结构及可塑性的实验模型对此展开深入探索。其中，树突棘作为皮层及海马回路中兴奋性突触连接的主要结构基础，是一种高度动态的结构，会依据个体经历与环境需求持续发生重塑5。针对脑衰老动物模型的研究已揭示：树突棘密度与形态存在区域及层次特异性改变，尤其在支持运动与认知功能的神经回路中尤为显著6,7。然而，突触老化在脑内并非均匀分布：某些脑区出现树突棘减少，而其他脑区则显示树突棘密度得以保留甚至增加，这表明衰老过程涉及异质性的结构可塑性形式，但其功能意义尚未被完全阐明6。
除了局部突触重塑外，衰老还会影响分布式脑网络中神经元活动的协调性。功能连接反映了空间上不同神经元群体之间活动的时间同步性，它是脑功能的基本组织原则，支持高效的信息处理和行为8。在不同物种中，已有关于网络同步性随年龄变化的报道，包括人类神经影像学研究及实验模型中的电生理分析结果，均表明衰老过程中大规模网络动力学会发生非线性变化9--11。这些发现强调了在大规模网络组织层面研究衰老相关过程的重要性。在此背景下，动物模型中的局部场电位（LFP）记录为探究脑功能连接提供了有力手段，因其能以高时间分辨率主要反映神经元集群的突触与树突活动总和，从而将细胞级过程与大规模网络动力学联系起来9,12--14。基于 LFP 的连接度测量不仅具有高信噪比，且与人类广泛使用的脑电图（EEG）指标在概念上高度相似，这凸显了其在探究全生命周期脑动力学方面的转化应用价值。然而，由于与衰老相关的功能连接改变往往具有细微性、分布广泛性，且遵循非线性轨迹，因此仅采用传统的单变量分析方法可能无法全面捕捉这些改变的功能相关性10,11。
行为表型反映了神经系统的整合输出，因此能够在分子和结构层面提供年龄依赖性变化的功能读数，补充突触和网络层面的测量15。在该框架下，机器学习方法为整合多维数据集和识别超越单一领域分析的多变量衰老特征提供了强大的框架16。这种整合方法特别适合研究生理衰老，因为在个体层面变化可能较小，但结合考虑时会明显。在本研究中，我们探究了运动与认知行为、树突棘密度，以及兴奋性和抑制性突触前终末标志物在皮层和海马区域中的年龄相关变化；这些区域是根据它们对脑组织不同层级上衰老相关改变的已知敏感性而选取的。
运动和认知表现作为累积神经衰退的行为读数17;树突棘密度和突触前标志物捕捉突触层面的结构和功能可塑性，而区域特异性重塑是皮层和海马体衰老的主要特征18。与此同时，我们利用LFP记录得出的全相干性（TotCoh）评估了大规模功能耦合，探测了仅由局部突触组织无法直接预测的网络层级动态19。通过将行为测量与LFP衍生的TotCoh在多个频段上整合，利用监督机器学习和特征选择方法，我们尝试识别生理性大脑衰老的多模态特征。这种方法可以帮助我们探讨行为、突触和网络层面的变化如何共同影响衰老相关的功能表型，并有助于理解神经退行性疾病易感性。
结果
行为评估
C57BL/6JRj雄性小鼠被分为三个年龄组（年轻4个月、成年14个月和老24个月），并通过一系列经过验证的行为测试进行运动和认知表现测试，这些测试从电极植入后一周开始，进行LFP记录，持续3周。特别是，第1周使用握力测试评估前肢力量，第2周分别使用开放场测试（OFT）和物体定位测试（OLT）评估一般运动活动和空间记忆，电极植入后第3周使用新型物体识别（NOR）测试评估长期识别记忆。最后一次测试后，小鼠被献祭，采集了它们的脑组织。部分样本被处理用于脊柱密度和突触前标记分析（见图1;详见第4节关于样本量、实验设计和排除/纳入标准的细节），其余组织则被保存以备后续分析。
图1。实验时间线。所有小鼠均接受电极植入（时间0），局部场电位（LFP）记录分别在术后1、2和3周进行。行为评估包括1周时的握力测试，2周时的开放场测试（OFT）和物体定位测试（OLT），以及手术后3周的新型物体识别（NOR）。最后一次检测后，小鼠被牺牲，其大脑被采集用于高尔基-考克斯染色和VGLUT及VGAT免疫荧光分析。剩余组织被储存以供进一步分析。LFP记录被用于功能连接性和机器学习分析。该模型是在BioRender中创建的
运动缺陷在成年后出现，并持续到老年
统计分析显示，成年和老年小鼠的前肢力量（力g/体重g）均低于年轻组（成年组与幼鼠：2.88 ± 0.24 对 4.67 ± 0.12;p < 0.0001;单向方差分析，Bonferroni事后分析;科恩的 d = 2.86;95%置信区间，置信区间：−2.43，−1.16;图2a;老年组对年轻组：3.24±0.17比4.67±0.12;第<页 0.0001;单向ANOVA，Bonferroni事后;科恩的 d = 2.50;95% CI：−2.01，−0.85;F（2,39） = 30.98;第<页 0.0001;幼鼠：n = 16只;成年：n = 11只;老鼠：n = 15只;图2a）。成年组与老组无差异（2.88±0.24对3.24±0.17;p = 0.486;单因子方差分析，Bonferroni事后分析;图2a）。这些发现表明，前肢力量在成年阶段出现下降，之后相对稳定。
图2。年轻、成年和老年小鼠的运动和认知功能行为评估。（a）术后一周进行的握力测试显示，成年（n=11）和老年小鼠（n=15）前肢受力较年轻组（n=16小鼠）有所减少。（b，c）术后2周进行的OFT显示，成年（n=15）和老年小鼠（n=18）的运动活动较年轻小鼠（n=21）（b）减少;成年（n=15）和老年小鼠（n=18）的平均运动活动（c）则低于年轻组（n=21只）。（d） 术后2周进行的OLT显示，老年小鼠（n=13）空间记忆受损，而年轻组（n=12只）则有较少。成年（n = 9）与年轻小鼠之间未观察到统计学上显著差异。（e）术后3周进行的NOR显示老鼠识别记忆下降（n=14），相比年轻（n=18）和成年（n=14）小鼠。数据以均值±标准误（SEM）的形式呈现。** p < 0.01， *** p < 0.001， **** p < 0.0001;单向方差分析，Bonferroni事后分析。每个点代表一只单独的动物。体重，体重。该模型是在BioRender中创建的。
使用OFT评估了其整体运动活动。结果显示，成年和老年小鼠的运动活动均低于年轻组，总行进距离显著减少（成年n = 15小鼠对年轻n = 21只：14.63±1.98米对29.41±3.06米;p < 0.001;单向方差分析，Bonferroni事后分析;科恩的 d = 1.25;95%置信区间：−23.27，−6.31;图2b;老鼠 n = 18 只 vs 年轻老鼠：12.78±1.26米 vs 29.41±3.06米;第<页 0.0001;单向ANOVA，Bonferroni事后;科恩的d = 1.52;95% 置信区间：−24.69，−8.57;F（2,51） = 15.71;第<页 0.0001;图2b）以及平均速度（成年与幼年：0.03 ± 0.003 m/s 对比 0.05 ± 0.01 m/s;p = 0.001;单向方差分析，Bonferroni 事后分析;科恩的 d = 0.56;95% CI：−0.04，−0.01;图2c;老年与年轻：0.02±0.002米/秒 vs. 0.05±0.01米/秒;第<页 0.0001;单向ANOVA，Bonferroni事后;科恩的d = 0.88;95% CI：−0.04，−0.01;F（2,51） = 13.50;p < 0.0001;图2c）。成年和老年小鼠在行进距离上均无差异（14.63±1.98米对12.78±1.26米;p > 0.999;单向方差分析，Bonferroni事后分析;图2b）或平均速度（0.03 ± 0.003 m/s 对比 0.02 ± 0.002 m/s;p > 0.999;单向方差分析，Bonferroni post hoc;图2c）。这些结果表明，运动能力的损伤在成年阶段出现，并在老年后持续存在，且没有进一步的下降。由于年龄相关的行为变化涵盖运动和高阶认知领域，我们评估了跨年龄组的认知和空间记忆。
认知缺陷在老年时出现
进行OLT评估长期空间记忆。老年小鼠的识别指数显著低于年轻小鼠（45.20±3.48%，对比64.93±2.10%;p.<0.0001;单向方差分析，Bonferroni事后分析;科恩的 d = 1.90;95% CI：−29.29，−10.18;F（2,31） = 13.66;第<页 0.0001;幼鼠：n = 12只;成年：n = 9只;老鼠：n = 13 只;图2d）。成年与幼鼠识别指数无统计学显著差异（54.78±2.01%对64.93±2.10%;p = 0.062;单向方差分析，Bonferroni事后分析;图2d）或成年老鼠间的差异（54.78±2.01% 对 45.20±3.48%;p = 0.077;单因子方差分析，Bonferroni 事后分析;图2d）。这些结果表明空间记忆会随着年龄增长而下降，老鼠的记忆能力明显下降。 为了评估衰老期间的长期识别记忆，我们对小鼠进行了NOR测试。分析显示，老年小鼠在识别记忆方面存在缺陷，识别指数均低于年轻组和成年组（老年组与年轻组：40.29±4.18% 对比67.44±2.72%;p < 0.0001;单向方差分析，Bonferroni事后分析;科恩的d = 2.02;95% 置信区间：−38.76，−15.54;老年人与成人：40.29±4.18%对56.53±3.25%;p < 0.01;单向ANOVA，Bonferroni事后;科恩的d=1.16;95%置信区间：−28.54，−3.92;F（2,43） = 16.99;第<页 0.0001;幼鼠：n = 18只;成鼠：n = 14只;旧版：n = 14只老鼠;图2e）。成年与年轻小鼠之间未观察到统计学显著差异（56.53±3.25%对67.44±2.72%;p = 0.06;单向方差分析，Bonferroni事后分析;图2e）。这些结果表明认知记忆与年龄相关的损害，而在老年时尤为显著。
运动和认知测量中年龄相关的明显轨迹
进行了回归分析，正式描述了运动和认知结果中年龄依赖的行为轨迹。通过额外的平方和F检验比较线性和二次模型，以确定最能描述年龄与性能关系的模型。 在运动指标中，握力在线性模型中表现出显著的年龄相关下降（R² = 0.388，F（1,40） = 25.34，p < 0.0001）。然而，二次模型显著提升了拟合度（二次R² = 0.613），模型比较确认比线性模型显著更佳（F（1,39） = 22.66， p < 0.0001），表明年龄相关的握力变化呈非线性轨迹（见图3a）。
图3。通过回归分析评估年龄依赖的行为轨迹。（a）握力的二次回归，显示出非线性年龄依赖性下降。（b）开放田地测试中行进距离的二次回归，表明运动能力早期衰退，随后在较老年龄部分稳定。（c） 开放场测试中平均速度的线性回归，显示出与年龄相关的递减。（d） 物体定位测试（OLT）识别指数的线性回归，显示与年龄相关的认知衰退。（e）新颖对象识别（NOR）识别指数的线性回归，显示出年龄相关的认知衰退。
同样，在开放场测试中，线性模型中行驶距离随年龄显著减少（R² = 0.328，F（1,52） = 25.35，p < 0.0001）。二次模型提供了显著更好的拟合（R² = 0.381;F（1,51） = 4.410，p < 0.05），表明其呈适度非线性轨迹，特征为早期下降，随后在较老年龄部分稳定（见图3b）。平均速度也随年龄显著下降（R² = 0.304，F（1,52） = 22.74，p < 0.0001）;然而，二次模型并未显著改善拟合度（R² = 0.343;F（1,51） = 2.983，p = 0.090），表明该指标已通过线性模型充分描述（见图3c）。 相比之下，认知表现始终表现为线性年龄相关性下降。在物体定位检验中，识别指数随年龄显著下降（R2 = 0.469，F（1,31） = 27.39，p < 0.0001），而二次模型并未改善模型契合度（R2 = 0.469;F（1,30） = 3.193 × 10⁻⁻，p = 0.996;图3d）。同样，在新颖物体识别（NOR）测试中，识别指数随年龄显著下降（R² = 0.436，F（1,44） = 34.05，p < 0.0001），二次模型未能提供更优的拟合（R² = 0.442;F（1,43） = 0.400，p = 0.530;图3e）。总体来看，这些分析揭示了不同领域的年龄相关行为轨迹。运动相关指标大多由非线性模型描述，而认知指标则一致表现为渐进性线性衰退。
树突棘密度及突触前标记的分析
鉴于观察到的年龄依赖性功能障碍，分别采用高尔基-考克斯染色和免疫荧光评估脊柱密度和突触前标志物。
初级运动皮层表现出树突状棘密度的年龄依赖性和层级特异性变化
单向方差分析显示年龄对顶端树突棘密度有显著影响（F（2,12） = 6.797，p < 0.05;n = 5只小鼠/组;图4a，c）以及运动皮层II/III层锥体神经元的基底树突（F（2,12） = 4.543，p < 0.05;n = 5小鼠/组;图4a，d）。事后比较显示成年与老年小鼠之间存在显著差异，老年小鼠在顶端的棘密度均增加（1.10±0.06对比0.88±0.03微米;p<0.01;博恩费罗尼赛后;科恩的d = 2.07;95% 置信区间：−0.39，−0.05;图4c）和基部树突（1.12±0.10对比0.85±0.04微米;p<0.05;博恩费罗尼赛后;科恩的 d = 1.59;置信区间：−0.52，−0.01;图4d）。在顶端V层锥体神经元组间观察不到显著差异（年轻：0.88±0.03根刺/微米;成虫：0.87±0.046根刺/微米;旧时：0.96±0.11 刺/微米;F（2,12） = 0.46;p = 0.641;单向方差分析;图4e）和基部树突（年轻时：0.92±0.08 粒刺/微米;成虫：0.88±0.06根刺/微米;旧时：0.88±0.11根刺/微米;F（2,12） = 0.058;p = 0.944;单向方差分析;图4a，f）。
图4。初级运动皮层和内侧前额叶皮层的树突棘密度分析。（a，b）不同实验组（n=5只小鼠/组）中用于棘密度分析的代表性高倍率（100×）树突状段图像。比例杆：5微米。（c--f）在初级运动皮层中，老年小鼠在II/III层锥体神经元的顶端（c）和基部（d）树突中脊柱密度均较成年小鼠增加。在第五层，顶端（e）和基部树突（f）无群差异。（g--j）在内侧前额叶皮层（mPFC）中，成年和老年小鼠在II/III层锥体神经元的顶端（g）和基部（h）树突的脊柱密度均低于年轻小鼠。在V层，顶端（i）和基部（j）树突未观察到基部树突的群差异。数据以SEM平均±表示。* p < 0.05， ** p < 0.01;新数，不显著;单向方差分析，Bonferroni事后分析。每个点代表一只单独的动物。
内侧前额叶皮层表现出层级特异性、年龄相关性树突状脊柱密度的减少
考虑到mPFC在高阶运动和认知功能处理中的作用，在该区域评估了树突状棘的密度。树突棘密度在单个神经元中量化（每只小鼠10--15个），并对每只动物（n=5只小鼠/组）进行平均值以进行统计分析。单因子方差分析显示年龄对顶端（F（2,12） = 11.24，p < 0.01;n = 5只/组;图4b，g）以及II/III层锥体神经元的基部树突（F（2,12） = 9.384，p < 0.01;n = 5只小鼠/组;图4b，h）。事后分析显示，成年小鼠（0.94±0.03根刺/微米）和老年小鼠（1.01±0.04根刺/微米）的顶端树突棘密度显著减少，而年轻小鼠则为1.21±0.05根刺/微米;成年与幼年，第<页 0.01;科恩的d = 2.93;置信区间：−0.44，−0.11;Old vs. Young，第<页 0.05;博恩费罗尼赛后;科恩的 d = 1.98;置信区间：−0.37，−0.04;图4g）。成年与老年小鼠之间无明显差异（p = 0.82，见图4g）。基底树突室也获得了类似结果（杨氏：1.10±0.04 μm;成虫：0.91±0.03根刺/微米;旧时：0.95±0.03 刺/微米;成年与幼年，第<页 0.01;科恩的 d = 2.40;置信区间：−0.32，−0.06;老年对年轻，第<0.05页;Cohen's d = 1.90;置信区间：−0.28，−0.03;成人与老年，第>0.999页;单向方差分析，Bonferroni事后分析;图4h）。 在顶端的V层锥体神经元中，组间无差异（年轻期：1.02±0.03 μm;成虫：1.07±0.10根刺/微米;旧时：0.92±0.08刺/微米;F（2,12） = 0.52;p = 0.61;单向方差分析;图4i）或基部树突（年轻：1.0±0.04根刺/微米;成虫：1.02±0.10根刺/微米;旧时：0.90±0.05刺/微米;F（2,12） = 3.31;p = 0.07;单向方差分析;图4b，j）。 总之，形态学分析表明，与年轻组相比，成年和老年小鼠的树突状刺密度随年龄下降，影响第二层和第三层，但第五层则无此变化。
衰老与海马CA1亚田顶端树突脊柱密度降低相关
还评估了海马体CA1、CA3和齿状回（DG）区域的树突棘密度，因为行为评估显示物体识别和空间记忆均存在严重依赖于该区域的障碍20。树突棘密度在单个神经元中量化（每只小鼠10--15个），并对每只动物（n=5只小鼠/组）进行平均值以进行统计分析。单因子方差分析显示，年龄对CA1锥体神经元顶端树突的树突棘密度有显著影响（F（2,12） = 10.16，p < 0.01;n = 5只小鼠/组;图5a，b）。事后分析显示，成年小鼠（1.12±0.09根刺/微米）和老年小鼠（1.04±0.06根刺/微米）相比年轻小鼠（1.52±0.09根刺/微米）显著减少;成年与幼年，第<0.05页;科恩的d = 1.99;置信区间：−0.71，−0.08;老鼠与幼鼠，p< 0.01;Bonferroni post hoc;Cohen's d = 2.81;置信区间：−0.79， −0.16;见图5a，b。成年与老鼠无明显差异（p > 0.999;图5a，b）。基部树突区室分析显示两组无差异（年轻组：1.26±0.13根刺/微米;成虫：1.14±0.10根刺/微米;旧时：0.99±0.09 刺/微米;F（2,12） = 1.70，p = 0.23;单向方差分析;图5c）。在CA3区域，顶端（年轻：1.27±0.11 μm）均无差异;成虫：1.14±0.13根刺/微米;旧型：1.03 ± 0.07 刺/微米;F（2,12） = 1.06;p = 0.38;单向方差分析;图5a，d）或基部树突（幼年：1.28±0.10 刺/微米;成虫：1.14±0.13根刺/微米;旧时：1.07 ± 0.08 刺/微米;F（2,12） = 1.61;p = 0.24;单向方差分析;图5a，e）。在DG中也观察到相同模式（年轻：1.33±0.06刺/微米;成虫：1.24±0.13根刺/微米;旧时：0.97±0.11刺/微米;F（2,12） = 2.81;p = 0.10;图5a，f）。综合来看，形态学分析的结果显示，年龄会差异性地调节运动和认知回路中的树突棘密度。
图5。海马树突棘密度的特征描述。（a） 代表性高倍率图像（100×）用于不同实验组的树突状段，用于脊柱密度分析（n=5只小鼠/组）。比例杆：5微米。（b，c）在CA1区域，成年和老年小鼠的顶端树突（b）的刺密度均低于年轻小鼠，而基底树突在各组（c）中无差异。（d，e）在CA3组中，顶端（d）和基底树突（e）未观察到基部树突的组差异。（f）齿状回（DG）未观察到组别差异。数据以SEM平均±表示。* p < 0.05， ** p < 0.01;新数，不显著;单向方差分析，Bonferroni事后分析。每个点代表一只单独的动物。
新皮层和海马区域抑制性和兴奋性突触前标记的年龄相关差异
在初级运动皮层中，单向方差分析显示，年龄对VGLUT表达的主要影响（F（2,11） = 7.395，p < 0.01），在成年组（9.20 ± 3.54%;n = 4小鼠）和老年小鼠（7.77 ± 2.65%，n = 5 小鼠）中显著低于年轻组（29.40 ± 6.19%;n = 5 < 0.05;科恩的 d = 1.77;置信区间：1.66,38.75;p < 0.05 对比老组;Bonferroni post hoc;Cohen's d = 2.03;置信区间区间：4.14,39.12;图6a，c）。成人组与老年组之间未发现统计学显著差异（p > 0.999;图6a，c）。VGAT表达也观察到类似的年龄相关效应（F（2,15） = 16.46，p < 0.001;单向方差分析）。特别是，成年小鼠的VGAT免疫荧光（15.57±2.31%;n = 6小鼠）和老年小鼠（11.14±1.54%;n = 6小鼠）均低于年轻老鼠（40.10±6.05%;n = 6只小鼠;p < 0.01 与成年犬相比;科恩的d = 2.19;置信区间：9.88,39.17;p < 0.001 对比老组;Cohen's d = 2.68;置信区间：14.31,43.61;图6b，c）。成年组与老年组差异不显著（p > 0.999;图6b，c）。
图6。脑区兴奋性和抑制性突触前标记的免疫荧光分析。（a，b）代表性免疫荧光图像显示年轻、成年和老年小鼠初级运动皮层中VGLUT（a）和VGAT（b）染色的DAPI。比例杆：50微米。（c--e）跨年龄组运动皮层（c）、mPFC（d）和海马体（e）的VGLUT和VGAT免疫荧光定量。数据以SEM平均±表示。* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001。仅标示显著差异;单向方差分析，Bonferroni事后分析。每个点代表一个个体动物（幼年：n = 5 只，成年：n = 4 只，老年：n = 5 只，用于初级运动皮层的 VGLUT 免疫荧光和 mPFC;幼鼠：n = 6 只，成鼠：n = 6 只;旧：n = 5只小鼠在海马体进行VGLUT免疫荧光;不同脑区的VGAT定量使用了每组n=6只小鼠的切片。
在mPFC中，VGLUT免疫荧光水平在各组间显著差异（F（2,11） = 5.803，p < 0.05;单程方差分析），成体（6.53 ± 2.91%;n = 4小鼠）和老年动物（8.23 ±/ 1.38%;n = 5 小鼠）水平较低，而幼鼠则为36.32 ± 10.96%;n = 5;p < 0.05 对比成鼠;科恩的 d = 1.58;置信区间：1.03,58.55;p < 0.05 vs. Old;Bonferroni post hoc;Cohen's d = 1.61;置信区间：0.99， 55.21;图6d）。成年鼠与老鼠之间的差异无显著性（p > 0.999）。
关于mPFC中VGAT表达，出现了更复杂的情况，主要效应为年龄（F（2,15） = 11.54，p < 0.001;单因子方差分析）与成年小鼠的VGAT表达增加相关（31.99±5.22%;n = 6小鼠），相比年轻小鼠（13.42±2.99%;n = 6小鼠;p < 0.01;博恩费罗尼赛后;科恩的 d = 1.78;置信区间：4.73,32.4;图5d和S1）以及老年动物（8.63±1.82%;n = 6只小鼠;p < 0.01;Bonferroni post hoc;Cohen's d = 0.79;置信区间：9.52,37.19;图6d和S1），而年轻老鼠之间未发现差异（p > 0.999;图6d和S1）。 对海马体VGLUT免疫荧光的分析未发现组间显著差异（年轻组：35.78±3.56%，n=6只;成虫：27.36±4.15%，n = 6只;老鼠：26.90±5.29%，n = 5只;F（2,14） = 1.392，p = 0.2811;单向方差分析;图6e）。相比之下，VGAT免疫荧光显示出显著的年龄依赖性调节（F（2,15） = 14.42，p < 0.01;单向方差分析）。事后分析显示，变化模式与mPFC相似，成年小鼠的VGAT水平较高（27.51±3.70%;n = 6只），而Young（10.31±2.14%;n=6只;p < 0.01;科恩的 d = 2.32;置信区间：7.36,27.04）和老年动物（10.72±1.31%;n = 6只小鼠;p <的 0.01;Bonferroni post hoc;Cohen's d = 2.47;CI：6.94,26.63），而年轻和老年小鼠之间无差异（p > 0.999;图6e和S1）。 综合来看，这些发现揭示了新皮层和海马体区域在抑制性和兴奋性突触前标记上的区域和年龄特异性差异。
电生理测量与机器学习
各年龄组的完全一致性差异不显著
由于突触变化可能影响网络层面动态，我们随后通过分析LFP衍生相干性（TotCoh）在多个频带上的年龄相关功能耦合变化，计算见第4.9节。 数据正态性和同方差分别通过Shapiro--Wilk检验和Levene检验得到确认（p > 0.05）。 为分析LFP数据，进行了双向方差分析评估年龄对TotCoh值的影响;分析结果显示无统计学显著的主效应或相互作用（F（12， 306） = 1.3964，p = 0.166）。然而，如图7所示，观察到一个不显著的数值趋势，成年组（n=15只）在所有频段上的连通性持续高于年轻组（n=21只）和老组（n=18只）。这一模式暗示了潜在的倒U形轨迹，且成年后网络同步峰值的趋势显著。然而，鉴于这些发现具有探索性质且缺乏统计显著性，这一趋势应仅作为初步观察。
图7。年轻组、成人组和老组的频率间完全一致性。各年龄组间未观察到统计学上显著差异（幼年：n = 21 只，成年：n = 15 只;旧版：n = 18 只老鼠）。数据以SEM±均值呈现。双因子方差分析。
多模态机器学习增强了年龄组的辨别能力
鉴于年龄相关效应可能微妙且分布于行为和网络特征，我们测试了多模态整合是否能通过监督机器学习改善年龄组辨别能力。 仅基于行为特征的机器学习分类（数据集1）使用径向基函数支持向量分类器（RBF-SVC）（见图8a）实现了0.762的总体准确率（95% CI：0.681--0.842）。该模型的平衡准确率为0.749（95% CI：0.665--0.833），宏观F1评分为0.730（95% CI：0.638--0.822），宏观敏感性为0.749（95% CI：0.665--0.833），宏观特异性为0.885（95% CI：0.845--0.925）。混淆矩阵显示年轻组和老组之间的辨别较好，而成年组的错误分类率更高，主要偏向老组。按类别划分的表现指标显示，幼犬（0.98）和老犬（0.60）的真阳性率（TPR）高于成犬（0.67）。受试者工作特征（ROC）分析支持了这些结果，曲线下面积（AUC）值显示类别可中等至良好（年轻与成年：0.968±0.054;年轻对老：0.981±0.040;成年与老年：0.792±0.161）。
图8。仅基于行为特征（a）及结合行为与LFP特征（b）进行年龄组辨别的分类表现。混淆矩阵展示了预测类别与真实类别的分布（幼鼠：n = 21 只，成鼠：n = 15 只;旧版：n = 18只小鼠），并报告了每个模型的整体分类准确率。相邻矩阵显示每个年龄组的真阳性率（TPR）和假阴性率（FNR）。三类接收机工作特征（ROC）曲线均被报告，点表示所选操作点及曲线下的相应面积（AUC）。
当行为特征与LFP衍生的功能连接度量（跨频段TotCoh;数据集2）结合时，分类表现显示出数值提升，但未达到统计显著性，使用线性支持向量分类器（LinearSVC）的整体准确率为0.788（95% CI：0.697--0.880）（见图8b）。模型显示准确率平衡为0.778（95%置信区间：0.689--0.867），宏观F1评分为0.759（95%置信区间：0.648--0.869）。此外，分类器获得了0.778的宏观敏感性（95% CI：0.689--0.867）和0.892的宏观特异性（95% CI：0856--0940）。LFP的加入增强了类别分离性，尤其是老组，TPR显著增加（0.72），年轻组（TPR = 0.95）。尽管年轻组的真实阳性率略有下降，但合并模型显著改善了成年与老年动物的区分，这在小鼠衰老研究中尤为具有挑战性。尽管成年组的准确性相对较低（TPR = 0.67），但模型在成年组与老年组比较中得出了更高的 AUC 值（年轻组与成体组：0.887 ± 0.137;年轻对年长：0.994±0.132;成年与老年：0.844±0.17）。 通过特征选择程序选择的简化特征集（数据集3;图9）。使用线性SVC，模型整体准确率为0.798（95%置信区间：0.725--0.871）。表现指标显示准确率平衡为0.786（95%置信区间：0.709--0.864），宏观F1评分为0.770（95%置信区间：0.684--0.856）。该分类器还获得了0.786的宏观敏感性（95% CI：0.709--0.864）和宏观特异性0.902（95% CI：0.871--0.934）。具体来说，所选行为特征包括握力测试、NOR、OFT（平均速度和行进距离）和OLT测试，而保留的LFP衍生特征包括Delta、Theta、Alpha 1、Alpha 2和Beta 1 TotCoh。按类别划分，年轻组和成年组的真阳性率保持稳定，分别达到0.95和0.67，而老组的TPR较高（0.74）。此外，各组别均观察到较高的AUC值（幼年与成年组：0.910±0.143;年轻对年长：0.969 ± 0.064;成年与老年：0.861±0.152），显示整体辨别能力良好。
图9。基于SelectKBest的特征选择后，结合行为和LFP特征进行年龄组辨别的分类性能。混淆矩阵展示了预测类别与真实类别的分布（幼鼠：n = 21 只，成鼠：n = 15 只;旧版：n = 18只小鼠），整体分类准确率基于平均的外层测试折叠。相邻矩阵报告了特定类别的TPR和FNR。右侧展示了每个类别通过一对一策略计算的ROC曲线，点表示所选操作点和对应的AUC值。特征选择嵌入内环，以优化类的可分离性同时最大限度减少信息泄漏。
讨论
神经系统的衰老并非均匀或线性轨迹;相反，它涉及细微且异质的变化，逐步影响行为、突触组织和大尺度网络动态21。理解这些变化如何在大脑组织的多个层面中展开，对于阐明生理衰老期间大脑韧性和脆弱性的机制至关重要，最终指导制定有针对性的策略，促进健康的大脑衰老并对抗神经退行性疾病。在此背景下，本研究采用统一实验设计，在同一队列中获得行为和电生理测量，并对这些队列的子集进行突触分析，从而实现跨领域年龄相关变化的平行评估。 我们的发现支持一个多层次的生理脑老化模型，其中运动、认知、突触和网络层面的区域遵循时间上不同且部分可分离的轨迹。 综合来看，我们的发现表明，运动相关系统在生理条件下可能比认知系统更早表现出衰老的脆弱性（见图10）。这凸显了关注成年早期变化的重要性。值得注意的是，我们的研究采用了多变量方法，整合了行为和功能连接数据。
图10。热图总结了行为、突触和功能参数随年龄变化的变化。热力图显示了不同年龄组变化的幅度和方向，以百分比变异表示。这些数值代表成年与幼年之间的相对变化（成年与幼年）以及老年与成年之间的变化（老年与成年）的比例，这些变化相对于参考组的平均值，按照公式（Group2 − Group1）/Group1）×100计算得出。负值（蓝色刻度）表示减少，正值（红色刻度）表示增加。统计显著性由单向方差分析确定;Bonferroni事后用星号表示（* p < 0.05， ** p < 0.01， *** p < 0.001，详见第2节）。未达到统计显著性的比较标记为ns（即不显著）。该描述性热图提供了行为表现、树突棘密度、突触标志物及大尺度功能连接性等年龄相关变化的可视化总结。其目的是促进对不同领域变化方向和幅度的比较，而非提供独立的分析或因果框架。
特别是，我们的行为分析显示运动表现早期下降，成年后前肢力量和运动活动均下降，持续至老年。这些发现与以往的寿命研究一致，后者表明运动衰退开始得相对较早17,22。值得注意的是，成年与老年动物之间未观察到进一步下降，表明运动障碍在成年初期发病后趋于平稳，而非逐渐恶化。 回归分析进一步支持这一解释，表明大多数运动指标更适合用非线性轨迹描述，而认知结果则呈线性年龄依赖性下降。这些分析正式表明，年龄相关的行为衰退在功能领域间并非一致。 临床研究强调了早期识别运动功能障碍的转化意义，表明阿尔茨海默病患者的运动技能障碍往往发生在认知下降之前23,24。 认知表现通常在临床环境中对有神经退行性风险的老年人进行评估，但其发展轨迹较为延迟。通过使用OLT和NOR范式评估，保持24小时的记忆间隔，成年小鼠的识别记忆基本保持，而老年动物则表现出明显的损伤，识别指数在各任务中接近偶然水平。由于所有动物在测试阶段均符合严格的探索标准，并在开放田地测试中表现出保持的运动活动，这些缺陷不太可能反映动物活动或动机的非特异性变化。相反，它们指出的是随着时间推移，保留或检索对象和空间相关信息的能力降低。综合来看，这些发现表明该模型中的认知衰老特征是识别记忆相对保留至成年，随后衰老时下降更为明显。NOR和OLT之间缺陷的趋同表明，多个识别记忆域在内存负载增加的条件下变得脆弱，这一点与之前的报告一致25。
虽然无法直接从本设计推断因果关系，但对行为、突触和电生理测量的平行评估揭示了跨领域协调但部分解离的年龄依赖性变化。在初级运动皮层中，仅成年小鼠与老鼠之间观察到显著差异，老年动物在II/III层锥体神经元的顶端和基部树突中表现出增加的棘密度。我们无法根据现有数据判断这些变化是适应机制还是补偿机制。在此背景下，先前使用纵向体内成像的研究报告了脊柱密度和运动皮层更新随年龄增加，暗示衰老过程中结构重塑26。 在mPFC中，我们观察到层别性年龄相关变化，成年和老年小鼠II/III层神经元顶端和基底的树突棘密度显著减少，较年轻动物显著减少。这些发现与先前研究一致，即前额叶和海马回路的年龄相关结构变化与啮齿动物认知衰退相关15,27，并可能促成老年动物认知表现型的形成。然而，基于现有数据，我们无法直接建立II/III层脊柱改变与特定行为结果之间的直接联系。有人提出，支持皮质-皮层整合的表层前额叶层可能对年龄相关的结构变化特别敏感。此外，一些研究报告称，衰老不仅可能涉及脊柱缺失，还可能改变脊柱更新和前额叶皮层结构稳定性的提升，凸显了衰老过程中突触重塑的复杂性28,29。
第五层锥体神经元在mPFC和初级运动皮层的树突棘密度均未表现出显著的年龄相关变化，表明皮层输出通路相对得以保留。 先前研究报告称，衰老与海马体的结构突触改变有关，包括树突棘密度的减少以及与空间记忆表现相关的突触形态变化7,30。 在我们的实验环境中，我们观察到成年和老年小鼠CA1锥体神经元顶端树突的棘密度显著减少，而基部树突相对保留。CA1锥体神经元通过颞氨通路从内嗅皮层接收主要兴奋性输入31，因此顶端树突可能对衰老相关结构变化具有差异性敏感性。然而，基于现有数据，我们无法直接建立这些结构性变化与记忆任务中观察到的行为障碍之间的直接关联。已知CA1在对象-上下文和空间表征中起作用32,33，尽管直接的机制关系尚待建立。 综合来看，这些观察表明皮层区域内具有特定区域和层次的年龄相关结构变化模式。特别是，初级运动皮层和mPFC的II/III层神经元，以及CA1锥体神经元的顶端树突，比其他检查的区室对年龄相关变化的敏感性更高。 在不同区域，我们观察到脊柱密度变化的轨迹不同，运动皮层增加，而中前叶皮层和海马体减少。这些差异表明，与年龄相关的结构变化在大脑各区域并不均匀，而是在特定区域内有所不同。 与此同时，我们检测到兴奋性和抑制性传递的突触前标志物在区域特异性的变化。然而，现有数据尚无法确定突触后和前突触变化是否具有机制性关联，还是反映了不同脑区间协调的过程。
我们的结果与以往报告的VGLUT和VGAT表达在衰老过程中皮层和海马回路异质变化的研究一致15,34,35。特别值得注意的是，在mPFC和海马体中观察到的VGAT表达非单调模式，成年小鼠VGAT水平升高，老年动物则恢复到较低水平。尽管现有数据尚无机制结论，但这种暂时性增加可能反映了GABA能信号的代偿性增强，旨在在早期突触改变存在的情况下维持网络稳定性，包括mPFC中VGLUT表达减少和树突棘密度的年龄相关变化36。这种机制有助于在成年时保持兴奋性与抑制性平衡，因为认知表现基本保持完整。有趣的是，老鼠不再观察到VGAT表达升高，反而表现出明显的识别记忆缺陷。尽管属推测，这些发现提出了代偿性抑制机制在成年阶段被激活，但在高级衰老时不再维持的可能性。还需要进一步研究来确定这种短暂的VGAT升高是否代表一种适应性反应，有助于生理衰老期间的认知韧性。 为确定本研究中识别的区域特异性行为和突触变化是否伴随大规模交流变化，我们对包括额叶、运动和顶叶皮层在内的多个脑区进行了体内LFP记录，以评估其功能连接性。 对LFP衍生的全相干性（TotCoh）在不同频段的分析未发现大规模功能耦合中统计学显著的年龄相关差异37。成年小鼠在频段间表现出略高的相干值与年轻和年老动物比较;然而，这些差异在统计学上并不显著，应视为探索性研究。因此，从现有数据中无法推断出具体的与年龄相关的模式或网络同步轨迹，这些观察应谨慎解读。 鉴于在单个LFP相干性测量层面观察到的效果有限且无显著性，我们采用监督机器学习探讨多模态整合是否能增强年龄组辨别能力。仅基于行为特征的分类取得了中等准确性，年轻和老年动物的区分更为清晰，但成年动物的辨别能力较差。这种模式可能反映了成年期的中间行为特征，这种特征既与年轻阶段，也与年长阶段相似。有趣的是，成虫组观察到的分类表现下降本身可能具有生物学信息量。行为分析显示，成年小鼠在运动相关指标上已表现出显著障碍，包括运动活动和前肢力量，而认知表现则基本保持，且仅在老年动物中出现显著损害。因此，成年期可能代表一个过渡阶段，其特征是早期衰老相关变化与认知功能的共存。在这一框架下，一些成年动物倾向于被归类为老动物，可能反映了衰老相关表型的逐渐出现，而非单纯的分类失败，凸显了生理性大脑衰老的非线性和渐进性质。此外，纳入LFP衍生的功能连接性指标带来了小幅且无显著的分类性能提升。这些发现应谨慎解读，因为电生理测量未显示显著的群体差异，且无法推断出对年龄相关辨别的具体贡献。这些发现可能表明网络层面特征可能为行为测量提供互补信息，表明多变量方法能够捕捉分布式的变化模式，这些变化模式仍低于传统单变量分析的检测阈值。特征选择似乎在降低模型复杂度的同时优化了分类，表明有限的非冗余特征可能足以捕捉小鼠大脑衰老的关键方面，即使准确率提升不显著。持续选择的行为指标，包括运动力量、运动活动和物体识别表现，都是年龄依赖性功能衰退的成熟读数，强调了运动和认知领域对衰老表型的综合贡献，即使在该初步模型中也是如此38。
在电生理特征中，Delta、Theta、Alpha和Beta-1波段的TotCoh值被识别为多模态机器学习框架内的重要预测因子。然而，需要注意的是，分类器选择这些特征本身并不意味着具有直接的机制相关性或确立的生物学重要性，尤其是在单变量分析中缺乏显著的组级差异的情况下。相反，这些频率区间的一致选择可能表明它们作为更广泛多变量变化模式中的数学组成部分，且该模式仍低于传统统计的检测阈值。在小鼠大脑中，虽然这些振荡带已知参与海马-皮层通信39、感觉运动整合和认知处理40,41，但它们对我们模型的贡献应谨慎解读为网络级衰老的潜在标志，而非决定性指标42。在这一探索框架下，将这些LFP衍生特征与行为读数（如运动力量（握力测试）、运动活动（OFT）和记忆表现（NOR和OLT）整合，为讨论人类衰老研究中常见的多变量特征43提供了初步基础，而无需假设特征选择与生物衰退之间存在因果关系。
综合而言，我们的发现表明，行为表现、突触组织和网络活动都受到生理衰老的影响，但它们不一定在分析层级间呈现统一或完全耦合的轨迹。相反，每个结构域都表现出部分可解离的年龄相关模式，表明衰老相关的变化以特定区域和系统的方式出现。 本研究的主要优势之一是在高度受控的环境中，将小鼠模型与LFP衍生的功能连接性指标整合行为评估。该框架建立了探索多变量衰老模式的初步平台，提供了对混杂变量的实验控制，这在人类队列中本质上难以实现。 从转化角度看，整合行为和电生理特征的监督分类器在人类衰老和神经退行性研究中日益被应用，已被证明能提升年龄预测能力以及对细微分布网络变化的敏感性44--46。然而，在人类中，这些多变量特征的生物学解释常受个体间变异性和实验控制减少的限制。通过在小鼠模型中应用类似的分析框架，本研究提供了一个受控环境，可以探讨行为与网络层面特征及年龄之间的关系。虽然我们的结果未能确立明确的多变量"特征"，但它们可能有助于未来完善和解释基于人工智能的人类衰老生物标志物的努力。 通过在传统分析后应用机器学习，我们的方法既保持了生物学的可解释性，也提高了对年龄相关变化的敏感度。目前的研究结果表明，全面理解生理性脑老化可能受益于行为、突触和网络层面的平行评估，而非孤立的评估。总体而言，本研究结果支持一种模型，即生理性脑老化通过时间上不同的阶段进展，特征包括早期运动系统脆弱性、认知迟缓衰退、区域特异性突触重塑以及相对保留的大规模网络同步。尽管多模态特征的整合与分类准确度的适度提升相关，但这一提升未达到统计显著性，因此应谨慎解读。因此，机器学习结果应被视为探索性，强调不同模态间潜在的互补贡献，而非提供分类性能提升的最终证据。
这一观点可能具有相关性，尤其是在考虑性别差异带来的额外变异性时，这些差异已被证明会影响大脑的衰老轨迹和结果47。在此背景下，本研究仅包含雄性动物构成了限制，因为研究结果对雌性动物的推广性尚不确定。未来纳入男女研究是必要的，以确定观察到的年龄依赖差异在性别影响下受到多大影响，从而提升该领域研究成果的可解释性和转化相关性。
材料与方法
动物
本研究共使用了54只野生型C57BL/6JRj雄性小鼠48。该研究旨在最大化统计能力，在可行的样本量内实现;如果男女皆有参与，则需要更大规模的队列来考虑性别作为生物学变量47。这些小鼠被安置在标准动物饲养条件下，采用12小时的明暗周期，恒定湿度（60--75%），控制环境温度（20--22°C），并随时提供食物和水。所有努力都尽量减少动物数量，减少它们的痛苦。
动物模型与实验设计
C57BL/6JRj雄性小鼠被分为三个年龄组：（i）4个月大小鼠（幼年），（ii）14个月大小鼠（成年），（iii）24个月大老鼠（老年）。在行为测试前，所有小鼠都接受了慢性电极植入手术，随后连续三周每周进行一次LFP记录，从电极植入后一周开始。 第1周使用握力测试评估前肢力量，第2周分别使用开放场测试（OFT）和物体定位测试（OLT）评估一般运动活动和空间记忆，电极植入后第3周使用新型物体识别（NOR）测试评估长期识别记忆（见图1）。 特别是一个试点动物队列（幼年：5只小鼠;成年：4只小鼠;老组：3只小鼠）分别在电极植入后2周和3周接受了OFT测试以评估整体运动活动，并进行了NOR测试以评估长期识别记忆。 为了更好地探索运动和认知功能，后续的动物队列（幼年：16只小鼠;成年：11只小鼠;老鼠：15只小鼠），除了OFT和NOR测试外，分别在电极植入后1周和2周接受握力测试和OLT测试。参与不同测试的动物总数汇总于表1，表1还报告了被排除在测试或分析之外的动物数量。
作为内部对照，从每个年龄组（年轻、成年和老年;每组n = 5只小鼠）中随机选取一组小鼠，在手术前一周接受了NOR测试的基线评估，以评估手术和实验程序对其行为表现的潜在影响。NOR任务的选择是先验的，基于其对年龄相关认知变化的敏感性，而这些变化在文献中最为详实25。术后3周的基线与术后测量对比中，未发现识别指数有统计学显著差异（见图S2）。这些数据表明，在当前实验条件下，手术程序及后续实验处理并未对NOR表现产生可检测的改变。然而，这种控制仅限于一部分动物和单一行为领域;因此，它并不排除对其他行为或神经生物学指标的潜在影响。 行为评估安排在三周内的不同时间点进行，以避免动物过载，并尽量减少任务间可能影响表现结果的干扰。行为分析在上午9点至下午4点之间进行，至少在录音后一天。所有行为测试均在准确评估动物健康状况后进行。采用了任务特定的纳入和排除标准，如下所述。
数据采用ANY-MazeTM行为追踪系统（Stoelting Co.，Wood Dale，美国伊利诺伊州伍德代尔）进行盲法收集和分析，握力测量则为人工评分。 最后一次行为分析结束时，所有动物都被献祭，并采集了它们的大脑以便后续分析。实验设计经过优化，最大限度地减少动物数量，同时最大化从每只小鼠获得的数据。这是通过使用相同的动物进行体内评估（即行为测试和LFP记录），并在多种方法学方法中最大化死后脑组织的利用来实现的。具体来说，在高尔基-考克斯染色中，每组分析五个动物中的一个半球，而对侧半球则用于免疫荧光分析。每组对4至6只动物进行了免疫荧光，每组还额外1只半球，以完成数据集。该方法遵循3R原则（替代、减少和精炼）实施。
纳入与排除标准
对于OFT分析，如果动物的总行进距离小于3米（排除n = 0小鼠），则被排除在分析之外。对于NOR和OLT的纳入标准，测试阶段的总探索时间至少为5秒，每个天体需花费≥2秒，且至少有三次不同的探索阶段。这些标准事先定义并统一应用于所有年龄组，以确保区分指数仅从测试过程中表现出足够任务参与的动物计算（NOR：排除n = 3 幼年，n = 1 成年，n = 4 老年小鼠;OLT：排除n = 2只成年小鼠，n = 2只老鼠）。此外，最初纳入研究的16只年轻小鼠中有4只未在OLT中测试，因为它们头戴式电极组件在OFT后松动，随后用额外树脂固定;小鼠未进行操作，随后仅在第3周进行NOR测试（见表1）。这些小鼠因技术问题被列入表1，未列入。 未进行敏感性分析，包括不符合纳入标准的动物，因为在极低的探索条件下，所得识别指数不能被视为可靠的辨别指标。在这种情况下，探索时间上的微小差异可能产生虚假的高值，无法反映新事物与熟悉物体的真实认知。 在NOR和OLT任务中，年龄组间未观察到显著排除率差异（双侧Fisher精确检验;表S2），表明排除措施并未引入系统性群体特异性偏倚。
握力测试
使用握力测试评估前肢力量。老鼠被尾巴悬挂，并用前爪抓住连接力测量仪器（GSM，法国Vitrolles的Bioseb仪器）的金属网格，并记录最大握力。前肢力量值（g）为三次连续试验归一化至小鼠体重（g）的平均值，并用于统计分析13,49,50。
开放场地测试
使用OFT评估了其整体运动活动。每只老鼠被放置在一个空旷的竞技场中央（45×45厘米），并允许它们探索10分钟。在10分钟内，使用自动追踪软件（ANY-Maze版本7.65）测量了总行驶距离和平均速度。每次治疗后，设备都用70%乙醇溶液清洗51。
新颖物体识别
NOR测试旨在评估前述的长期识别记忆52。第一天，小鼠们在一个空旷的场地（45×45厘米）中单独接受10分钟的适应训练，以熟悉设备。第二天，训练仅进行一次10分钟的训练，场馆内对称地放置两个相同的物体。 第三天，在测试阶段，一个熟悉的物体被一个形状和颜色不同的新物体替换，老鼠们被允许探索10分钟。 探索时间（定义为动物口鼻从<2厘米距离对准物体的时间）记录了新奇和熟悉的物体。识别指数计算为探索新对象的时间与总探索时间（包括新旧）的百分比。为了进一步排除对场地一侧位置的偏好，测试过程中新物体的位置在双方之间交替进行。在后续测试前，物体和场地均用70%乙醇溶液清洗。所有用于识别范式的对象大小相近。
物体定位测试
使用OLT评估长期空间记忆。该测试在Y型迷宫装置中进行（由三条相同的手臂组成：长=35厘米，宽=5厘米，高=15厘米，彼此以120°角排列，形成Y形），相比在方形场地进行的OLT中，这种装置具有增强小鼠自发探索行为的优势，这很可能是因为迷宫本身空间复杂度更高25。动物们最初习惯了Y型迷宫装置，持续10分钟无物。第二天，在训练阶段，在迷宫的两臂末端放置了两个相同的物体，允许老鼠探索10分钟。在此阶段，将黑色三角形卡片组成的视觉提示放置在物体旁的墙上，以帮助动物判断空间方向。24小时后，在测试阶段，其中一个物体被移至第三个之前空的臂上，动物们被允许探索10分钟。随后记录每个天体的探索时间。位移物体的识别指数是通过探索该物体所花费的时间与总物体探索时间的百分比计算的。为了进一步排除迷宫中一臂位置偏好，测试过程中两臂交替放置了被移置物体的位置。识别指数的计算方式是针对NOR的描述。Y形迷宫和物体在后续测试间隙用70%乙醇清洗。所用物体与NOR中使用的不同。
电极植入与LFP记录
行为测试开始前一周，所有动物接受了前述的慢性电极植入手术13,14。小鼠通过腹腔内注射（含氯胺酮，87.5 mg/kg）和木苯酸（12.5 mg/kg）混合麻醉，随后被置入立体定位框架（Stereotaxic for Mouse， Digital and Portable， SGL M， 68513;RWD，中国深圳）。采用纵向头皮切口暴露头骨，并在立体定位坐标上钻了六个小毛刺孔，分别对应于额叶皮层（前后+2.5毫米，距布雷格玛外侧±0.3毫米）、初级运动皮层（+1.4毫米前后，±距布雷格玛外侧2毫米）和体感皮层（前后距−0.34毫米，距布雷格玛外侧±2.4毫米）。此外，还钻了两个孔：一个用于放置参考电极（距Bregma前后+2.5毫米，侧距−2.5毫米），另一个用于插入用作接地的颅螺钉（前后+2.5毫米，距Bregma侧+2.5毫米）。八根不锈钢灯丝是焊接到多针插座（NPD-18-DD-GS连接器，Omnetics，明尼阿波利斯，美国），其中六个作为录音电极，一个作为参考电极，最后一个作为地线。每个电极都被小心地通过钻孔安置，以确保电接触而不损伤硬膜。这种预防措施最大限度地减少脑部创伤，防止脑脊液泄漏。整个植入物随后用牙科光固化树脂（Tetric Evoflow，Schaan®，列支敦士登）固定，提供一种微创方法，减少因颅骨暴露于大气环境下可能引起的颅内压力波动。手术后，小鼠被单独安置，给予一周恢复期，并密切监测是否有疼痛或不舒服的迹象。在此期间结束时，动物被单独放入录音笼中，允许在LFP录音期间自由活动。每次LFP录音时长30分钟。数据采集使用Cereplex Direct System（美国犹他州盐湖城Blackrock Microsystems公司）。
LFP数据分析
LFP录制在MATLAB版本R2022b（美国马萨诸塞州纳蒂克MathWorks）中处理，使用基于EEGLAB工具箱2024.1版（美国加州拉荷亚斯沃茨计算神经科学中心）的定制脚本。信号在0.2至47 Hz之间采用有限脉冲响应滤波器进行带通滤波。随后将数据按2-s纪元细分，对受显著伪影（包括运动相关或环境噪声）污染的段进行了目视检查，排除在进一步分析之外。在人工伪真排除后，每只小鼠至少保留23分钟无伪因数据以供后续分析使用。功能连接性分析在MATLAB中使用基于EEGLAB的程序进行，如前所述53。LFP信号之间的耦合通过大小平方相干（MSCoh）量化，该计算涵盖所有可能的电极对组合。为了提供网络级同步的全局衡量，相干值被汇总为总MSCoh（TotCoh）54。具体来说，对于每个频带，每个电极的相干值计算为与其他所有电极的平均相干性，TotCoh通过在各电极间取平均得到。TotCoh对每次记录及传统脑电频段均进行了估计：Delta（2--4 Hz）、Theta（4--8 Hz）、Alpha 1（8--10.5 Hz）、Alpha 2（10.5--13 Hz）、Beta 1（13--20 Hz）、Beta 2（20--30 Hz）和伽马（30--45 Hz）13,55。后续分析则采用三次记录的平均TotCoh值。
高尔基-考克斯染色与树突棘密度分析
大脑按照制造商的说明和已发布的方案，使用FD Rapid GolgiStainTM套件（FD NeuroTechnologies，哥伦比亚，美国）进行高尔基-考克斯染色13,49。简短地，脑部浸泡在浸渍溶液中，16天后迅速冷冻于液氮中，并在−80°C下过夜保存。矢状切片（100微米）使用低温恒温器（Slee MEV低温器;Slee Medical GmbH，德国下奥尔姆）温度为−20°C。这些切片安装在明胶涂层的载玻片上，染色、脱水、用二甲酸清理，并用Eukitt®（ORSAtec GmbH，德国博宾根）安装介质覆盖滑套。 本研究分析了初级运动皮层II/III和V层的锥体神经元及mPFC。此外，还观察了CA1和CA3区域的锥体神经元，以及DG的颗粒细胞。 神经元的纳入标准包括：完全均匀浸渍、无背景沉淀、树突状植状平面排列，以及与邻近染色细胞相对隔离。在顶端和基部的二级和三级分支中分析了树突棘的密度树突。由于近端区域的刺密度通常较低，分析中排除了各分支的初级轴和初始节段（前几微米）。使用Neurolucida 7.5软件（MicroBrightField，美国佛蒙特州威利斯顿），连接配备高分辨率数码相机的蔡司电动台显微镜，定量了长约20微米的树突片段。脊柱密度通过Neurolucida Explorer计算为树突节的刺数/微米长度。每只动物随机选取10--15个神经元量化脊柱密度，并在动物层面平均，每只动物作为独立数据点进行统计分析（n=5只/组）。
免疫荧光分析
小鼠接受深度麻醉（氯胺酮，87.5 mg/kg，和木拉嗪，12.5 mg/kg，内注射），并经心灌注冷磷缓冲生理盐水（PBS）。脑部被提取后，在4°C下4%对甲醛中固定48小时，并在30%蔗糖中冷冻保护，浸泡在0.1 M PBS中。使用徕卡VT1000S振动器切开40微米矢状切片进行免疫荧光分析。游离矢状切片在室温（RT;22--24°C）阻断溶液（1% BSA、10%山羊血清、0.5% Triton X-100 PBS）中阻断1小时，并在4°C下与原级抗体VGLUT（1：500，细胞信号#47181）和VGAT（1：500，细胞信号#44498）一起孵育。清洗后，切片与二级抗体（Alexa Fluor 546 驴抗兔IgG，1：500，Invitrogen，用于VGLUT;Alexa Fluor 488 驴抗兔子 IgG，1：500，Invitrogen，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆，用于 VGAT）。DAPI被用于核染色50。 共焦点成像使用尼康（日本东京品川）A1 MP共焦显微镜完成。为减少采集相关偏差并确保样品间的可比性，所有图像均采用相同的设置（激光功率、探测器增益、针孔、像素停留时间和Z步长），且在每个染色实验中保持不变。所有图像均以20×倍率拍摄，呈Z叠加，总厚度为20微米。为定量分析生成了最大强度预测值。所有图像均在非饱和条件下拍摄。 对于每只动物，根据立体定位标志，选择了两个解剖学匹配的矢状体切片，分别位于等效的前尾水平。每个切片在初级运动皮层和mPFC中采集了两个不重叠的场，而在海马体中采集了四个不重叠的场，以采样CA1、CA2、CA3和DG区域。田间选择基于解剖标准，并在动物间一致应用，以最大限度减少抽样偏差。 使用ImageJ 1.54p软件（美国国立卫生研究院，马里兰州贝塞斯达）对最大强度投影进行了VGLUT和VGAT免疫荧光定量。每个标记的所有图像均使用相同的分析流程处理，以最大限度减少操作员偏差。简而言之，图像被转换为8位并使用ImageJ中实现的Otsu自动阈值方法二进制，该方法通过最小化前景与背景像素之间的类内强度差异来确定阈值。阈值并非逐图手动调整;相反，通过对所有在相同条件下拍摄的图像应用相同的自动化方法和预处理步骤来确保一致性。对所得的二进制图像进行了信号量化，以确保输出标准化，不受人工阈值选择的影响。整个分析流程（预处理、二元化和定量）均统一应用于所有样品。对于每只动物，定量值在所有田间和剖面中均值，得到一个单一生物复制体，用于统计分析（每组 n = 4--6只小鼠）。所有图像采集和分析程序均在盲目进行实验组识别。
人工智能
机器学习分析基于三种不同数据集，将小鼠分为三个年龄组：年轻、成年和老年。第一个数据集（数据集1）包含五个行为变量，第二个数据集（数据集2）包含行为变量和跨频带的TotCoh值，总共得12个特征。第三个数据集（数据集3）包含通过特征选择技术获得的简化特征集，具体将在下节详细描述。 在模型训练之前，缺失值通过按组的K最近邻（KNN）补补程序处理。具体来说，这是用 k 邻居 = 5 且权重 = "距离"的 KNeighborsTransformer 实现的。缺失数据在每个诊断组内单独归算，以保持群体特异分布，避免类别间出现人为重叠或信息泄漏。这种方法确保缺失值的估计基于五个最近样本的加权平均值，而较近的邻居对估计值的贡献更大，而连续变量则作为浮点值保留，以确保数据完整性。在交叉验证之前，采用独立应用于各组的无监督方法进行补值。这一选择的动机是由于缺失值比例较低且分布均匀，同时需要在有限的样本量内确保多模特征的稳定和一致估计。尽管这种方法理论上可能存在数据泄露风险，但补缺程序未包含除分层外与结果变量相关的任何信息。 为确保模型评估的严谨性并避免乐观偏差，采用嵌套交叉验证框架评估分类性能。外环基于重复分层k折法（5重叠，2重叠），确保了各分割类比例的保持，并提供了对未见数据泛化性能的稳健估计。在每个外部训练集中，进行了内部五重分层交叉验证，用于超参数调优和模型选择，包括特征选择子集的优化。 比较了四个分类器：带L2正则化的逻辑回归（自由线性求解器）、带L1正则化的逻辑回归（saga求解器）、线性SVC和RBF-SVC。为考虑潜在的类别不平衡，所有模型均采用类别权重平衡训练。超参数优化通过内环内的网格搜索实现。具体来说，正则化参数C针对逻辑回归和支持向量模型进行了优化，而RBF-SVC还包括核系数γ的优化。对于L1正则化的多项逻辑回归，参数网格包括C = 0.05， 0.1， 1.0， 10.0;对于L2逻辑回归和线性垂直变换，C = 0.1， 1.0， 10.0;对于RBF-SVC，C = 0.1， 1.0， 10.0，γ = scale， 0.01， 0.1。
特征标准化通过 StandardScaler 的 z 分数归一化，在 scikit-learn 流水线中应用，以避免信息泄漏。所有线性和基于核的模型都包含了缩放，所有预处理步骤均专门拟合在每个折叠的训练数据上。 内环的模型选择基于平衡准确性，选择此作为调整指标以减少可能的类别不平衡影响。超参数调整后，每个内圈中最优模型在完整的外层训练集上重新训练，然后在相应的外层测试折叠上进行评估。 对于每个外层测试折叠，计算了以下性能指标：准确性、平衡准确性、宏观平均F1评分、宏观平均敏感度（回忆）和宏观平均特异性。每类的敏感性和特异性均以一对静止法计算。具体来说，对于每个类别，真阳性、假阴性、假阳性，真阴性由混淆矩阵推导，类别特异性计算为TN/（TN + FP）。宏值是通过跨类平均获得的。 对每个外折叠计算行归一化混淆矩阵，使得每一行代表每个真实类别内预测标签的分布。对于每个模型，归一化混淆矩阵在外层折叠间平均，以稳定表示类别特异的分类模式。 ROC曲线及对应的AUC值均通过专用分析脚本计算。在多类环境中，ROC分析采用一对一策略，为每个类别组合生成成对ROC曲线。对于每对类别，在每个外层检验折叠内计算ROC曲线，并跨折叠平均，以获得平均ROC曲线及相应的AUC估计值。 每个分类器和特征集的最终模型性能被总结为外折痕的平均值和95%置信区间。CI是通过SEM在可用时使用t分布估算的;否则，则采用正规近似。这一过程使模型在不同特征配置间的性能能够稳健地比较，同时最大限度地减少过拟合和信息泄漏。 所有分析均在Python 3.13中使用NumPy 2.1.0、pandas 2.2.3、scikit-learn 1.6.0、matplotlib 3.10.0和SciPy 1.14.1库（如适用）。
特征选择
为了降低维度并识别最具信息量的预测变量，特征选择被直接纳入机器学习流程。具体来说，采用了基于单变量滤波器的特征选择方法，使用 SelectKBest 0.18，并以方差 F 统计量（f_classif）作为评分函数。该方法根据特征相对于多类目标变量的个别判别力对特征进行排名，并保留得分最高的k个特征。 重要的是，特征选择在嵌套交叉验证框架内进行，因此仅针对每个折叠的训练数据，以避免信息泄漏和乐观偏见。特别地，对于每个模型和每个外部训练折叠，选中的特征数量（k）被视为超参数，并在内交叉验证循环中与分类器特有的超参数一起进行优化。这确保特征选择完全融入模型选择过程，测试折叠直到最终评估前完全不可见。 对于线性和基于核的分类器，特征选择步骤之前是在同一 scikit-learn 流水线内的 zscore 标准化（StandardScaler）。因此，缩放和特征选择仅从每次交叉验证分割的训练数据中估算，然后应用于相应的验证或测试数据。 根据可用预测变量总数，选择特征数量的候选值进行了自适应定义。评估的k值包括低至中维解（如2、3、4、5、6、8和10），以及在适当情况下的完整特征集。在内环网格搜索过程中确定了最优的选定特征数量，同时结合分类器超参数。 为评估特征选择的稳定性，记录了每个外折和分类器保留特征的子集。此外，还通过计数每个特征被选中的外褶皱数量，进行了选择频率分析。该程序使得识别出在重抽样迭代中保留最一致的预测变量，因此可能与群体歧视关联更为强。在多个折叠中一致被选中的特征被视为稳定的预测因子。特别是，变量在至少80%的外部交叉验证中被选中折叠被定义为最稳定的特征，表明在独立数据集重抽样中对分类任务的贡献一致。 通过将特征选择嵌入嵌套交叉验证程序，分析最大限度地减少了过拟合，并提供了更可靠的单个预测变量对分类表现贡献的估计。
统计分析
样本量是先验确定的，使用G*Power 3.1.9.4软件，考虑三组的平均±标准差（SD），基于先前试点数据集或研究的结果（包括我们自己的数据），采用类似的方法或范式，假设幂为80%，置信水平为95%，双尾I型错误率（α）为0.05。 数据以均值±均值标准误（SEM）表示。所有两两比较均通过汇总标准差计算效果量（Cohen's d），每个参数的对应值见正文和表S1。CI用于正文中统计显著的生物学比较，以及通过嵌套交叉验证程序得出的机器学习性能指标。数据首先采用（Shapiro--Wilk和Levene检验）检验正态性和方差相等。行为和脊柱密度结果采用单向方差分析（ANOVA;因子：组别）分析，随后进行Bonferroni事后纠正。此外，还进行了基于回归的分析以评估年龄依赖的行为轨迹。对行为结果拟合了线性和二次回归模型，使用确定系数（R²）评估模型拟合度，并使用额外平方和F检验进行模型比较，以确定二次模型是否显著提升了拟合度。采用双侧Fisher精确检验比较实验组中纳入与排除动物的比例。 在分析LFP数据时，进行了双向重复测量方差分析，以考察年龄对TotCoh值的影响，考虑因素组（年轻组、成年组、年长组）和带（δ组、Theta组、Alpha 1组、Alpha 2组、Beta 1、Beta 2组、γ组）。格林豪斯盖瑟修正被用来解释球状度的违规。多次比较均采用Bonferroni校正进行了修正。数据分析使用GraphPad Prism 8.4.0版本、SigmaPlot 14.0或Statistica v.8（美国俄克拉荷马州塔尔萨StatSoft公司）。 统计分析单位为所有实验中的单个动物。所有排除标准均事先定义并一致应用于各组，详见第4.2节。所有实验和分析均采用盲法进行。
结论
总之，本研究结果表明，生理性大脑衰老以非线性和领域特异性变化为特征，这些变化影响行为、突触结构和大规模网络活动。运动损伤在成年早期出现，尽管运动皮层区域同时发生结构变化，但随着时间推移仍相对稳定。相比之下，认知衰退在老年更为明显，伴随着前额叶和海马回路的突触改变。功能连接性测量中未检测到显著的年龄相关差异，表明在当前实验条件下大尺度耦合得以保留。 在此背景下，行为特征和电生理特征为年龄组分类提供了互补信息。尽管多变量方法具有探索性且性能适度，但它们可能提高对分布年龄相关变化的敏感度，这些变化未能被单变量分析完全捕捉。值得注意的是，虽然多模态特征的整合与分类准确度的适度提升相关，但这一效应未达到统计显著性，因此应谨慎解读，支持机器学习分析的探索性而非确认性角色。 未来的研究可能会通过加入更多网络级描述符（如基于熵的指标）来扩展电生理分析，以更好地表征衰老期间功能动力学的复杂性。总体而言，这些发现为大脑衰老提供了描述性和探索性见解，并支持采用明确跨领域分析方法在更大队列中的进一步研究。 局限性：尽管本研究提供了一些见解，但仍需承认若干局限性。首先，样本量相对较小且细分为不同年龄组，这在机器学习流程复杂性面前构成了根本性限制。尽管我们采用嵌套交叉验证以减轻偏差，但特征空间相对于受试者数量的高维度固有地增加了性能估计中过度拟合和不稳定性的风险。此外，小队列规模可能导致特征选择过程不稳定，因此分类器识别的具体预测变量应被视为多模态方法的说明，而非最终的生物标志物。其次，本研究缺乏外部验证队列，这是试点调查中常见的限制，限制了独立数据集中模型稳健性的评估。鉴于观察到的性能提升有限且未达到统计显著性，这些结果必须严格解释为概念验证框架下的探索性信号检测。需要更高主体与特征比的大规模研究，以最终验证这些多变量特征特征，并确保所选特征的稳定性。此外，由于仅纳入男性动物，这些发现对女性的推广性尚待确定，尤其考虑到脑老化中性别特异性轨迹的潜在影响。