The chromosome-scale genome of Magnolia officinalis provides insight into the evolutionary position of magnoliids
厚朴染色体水平基因组解析揭示木兰类植物的演化地位
摘要
厚朴（*Magnolia officinalis*）是木兰科具有芳香气味的高大代表性乔木，为药用植物，广泛应用于医药、化妆品等多个行业。本文报道了厚朴染色体水平的基因组草图，约 99.66% 的序列可锚定到 19 条染色体，scaffold N50 达到 76.62 Mb。研究发现，重复序列占比高是已有基因组数据的 3 种木兰科物种的共有特征。系统发育分析显示，**木兰类是真双子叶‑单子叶分支的姊妹群**，该结果为解析被子植物内部系统发育位置提供了更多依据。厚朴基因组存在一次古老复制事件，该复制事件与樟科植物共享。基于转录组（RNA‑seq）分析，本研究在厚朴基因组中鉴定出多个参与木脂素生物合成的关键酶编码多基因家族。厚朴基因组的构建可为木兰属乃至木兰科其他物种的后续研究提供参考基因组资源。
引言
木兰属在植物演化历史中十分古老，属下包含大量药用、园艺以及观赏物种。厚朴（Magnolia officinalis Rehd.，中文俗称 HouPo）是木兰亚属最重要的物种之一，花朵芳香艳丽是其显著特征，主要分布于东亚与东南亚地区。厚朴始载于《神农本草经》，在中、日、韩传统医学中有着悠久的应用历史，常作为替代或辅助药物用于临床。它的树皮和花可作为传统草药，用于治疗肠胃疾病、焦虑、过敏症等。值得关注的是，厚朴树皮还作为重要原料广泛应用于化妆品领域，其花也已获批作为膳食补充剂原料。
厚朴主要活性成分为木脂素、生物碱、挥发油等，其中厚朴酚（magnolol） 与**和厚朴酚（honokiol）**是两大核心活性物质。由于成分复杂，已有大量研究报道厚朴具备抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗菌等多种药理活性。尽管厚朴在国内被广泛栽培，拥有极高的药用与经济价值，但受限于遗传资源、演化背景、次生代谢合成通路等分子基础研究的不足，厚朴资源的综合利用程度仍然较低。
图 1 厚朴植株形态照片 成熟植株 (A)、花 (B)、果实 (C)。
近年来，多个木兰类物种已完成全基因组测序，包括望春玉兰、鹅掌楸、香樟、胡椒等，为解析被子植物的演化关系提供了一定支撑。木兰类在植物演化与分类系统中属于较为原始的类群；关于木兰类、真双子叶与单子叶三者之间的系统发育地位，学界长期存在较大争议。 例如，对望春玉兰、鹅掌楸、胡椒、鳄梨、闽楠的系统发育分析支持木兰类是真双子叶与单子叶二者的共同姊妹群 ；而另外一些针对香樟、山鸡椒、蜡梅、柳叶蜡梅的基因组研究则认为木兰类为真双子叶的姊妹群。此外，张等人汇总了包含 ANA 级被子植物、真双子叶、木兰类、单子叶、裸子植物在内共 115 个物种（44 个基因组、71 个转录组）的系统发育关系与分化时间，结果同样支持木兰类与真双子叶互为姊妹群。因此，需要更多有代表性的木兰类基因组数据，来厘清这些相互矛盾的系统发育拓扑结论。
本研究利用 PacBio 测序平台，完成了木兰属厚朴（2n = 2x = 38）的染色体水平基因组组装。该高质量基因组进一步充实了厚朴遗传演化研究的数据资源。同时，将厚朴基因组与已发表的其他木兰类基因组开展系统发育分析，为解析木兰类的系统发育地位与基因组演化提供新见解。总而言之，该基因组也有助于解析木兰属植物木脂素的生物合成途径，并鉴定其花香组分中的萜类物质。
图 2 厚朴染色体特征总览 (A) 厚朴基因组特征圈图。由外至内各轨道依次为：(a) 染色体分布；(b) GC 密度；(c) LINE 反转录转座子密度；(d) LTR 反转录转座子密度；(e) DNA 转座子密度；(f) 基因密度；(g) 共线性区块。 (B) 厚朴基因组 HiC 互作热图，展示 19 条染色体之间的互作关系。颜色越深代表互作频率越高。
结果
基因组测序与组装
本研究采用 PacBio、Illumina 测序平台结合 HiC 技术对厚朴开展基因组测序。过滤低质量与短片段后，共得到 140.91 Gb PacBio 原始长读长数据，测序深度 84×；读长平均长度 8.65 kb，读长 N50 为 13.78 kb，最长读长可达 128.49 kb（见补充材料）。HiC 文库获得约 94.25 Gb 有效 clean reads（见补充材料）。
利用 Illumina 短读长数据开展基因组预估（Genome survey）；基于 Kmer 分析估算厚朴基因组大小约为 1.76 Gb，杂合度仅约 0.58%（见补充材料）。 利用 PacBio 与 HiC 数据完成染色体水平组装，厚朴最终组装基因组大小 1.68 Gb，序列覆盖度 99.95%；scaffold N50 为 76.62 Mb，GC 含量 40.65%（表 1，见补充材料）。共计 1.67 Gb 组装序列锚定至 19 条染色体；其中 1.53 Gb 的序列完成排序与定向，占组装基因组的 91.21%（见补充材料）。
利用 HiC 组装结果绘制全基因组互作热图进一步评估组装质量。HiC 热图显示厚朴的 19 条染色体可以清晰区分；每条染色体对角线位置互作信号强度显著高于非对角线区域（图 2B，见补充材料）。
Table 1. The major characteristics of M. officinalis genome
|--------------------------------|--------------------------|
| Empty Cell | M. officinalis |
| Assembly ||
| Total length (bp) | 1,684,361,614 |
| Number of scaffolds | 2,892 |
| Scaffolds N50 (bp) | 76,619,249 |
| Number of contig | 11,562 |
| Contig N50 (bp) | 222,069 |
| GC content % | 40.65 |
| Complete BUSCOs % | 86.20 |
| Percent of CEGs % | 95.19 |
| Annotation ||
| Repeat sequences % | 81.44 |
| Number of predicted genes | 23,424 |
| Number of protein-coding genes | 23,050 |
| Number of non-coding RNAs | 1,096 |
| Average gene length (bp) | 10,206.68 |
| Average exon length (bp) | 242.75 |
| Average intron length (bp) | 1,673.73 |
为评估基因组完整度，本研究同时采用 BUSCO 与 CEGMA 两种方法。BUSCO 分析结果显示，该基因组组装中检测到 86.2% 的完整 BUSCO 基因（1391/1614，见补充材料）。CEGMA 分析在厚朴基因组中检测到约 95.19%（436/458）的真核生物保守核心基因（见补充材料）。上述结果证实厚朴基因组组装达到近乎完整的水平。
基因组注释
值得注意，厚朴基因组中重复序列总长 1.37 Gb，占比高达 81.44%（见补充材料）。与其他已测序木兰类物种对比，该重复序列占比为目前木兰类中最高：望春玉兰基因组大小 2252.5 Mb，重复序列占比约 66.48%；香樟基因组 730.7 Mb，重复序列占比约 48%；鹅掌楸基因组 1742.4 Mb，重复序列占比约 62%；闽楠基因组 989.19 Mb，重复序列占比约 68.51%；胡椒基因组 761.74 Mb，重复序列占比约 54.85%。
厚朴的重复元件以 Ⅰ 类反转录转座子为主；其中 LTR/Gypsy、LTR/Copia、LARDs 元件分别占基因组的 27.53%、21.11%、23.90%。与望春玉兰、胡椒、鹅掌楸、山鸡椒、香樟等木兰类的重复注释结果一致，厚朴基因组内 LTR/Gypsy 占比高于 LTR/Copia。此外，厚朴的 LARDs 元件含量也高于上述物种，LARDs 是造成厚朴重复序列占比显著高于其他木兰类的主要元件。LARDs 元件最早由 Kalendar 等人在大麦及其近缘物种基因组中报道；现有研究认为 LARDs 是自主性 LTR 反转录转座子发生缺失后遗留的残件。
在石榴基因组中，占基因组 13% 的 LARDs 元件能够影响果实着色相关基因的表达，例如黄酮糖基转移酶、MYB 基因。据此我们推测，厚朴基因组中大量的 LARDs 元件可能也和次生代谢物积累存在关联，与石榴中的情况类似。厚朴基因组海量的重复元件，也印证了植物演化过程中遗传物质持续发生复制扩张这一观点。
基因预测方面，结合从头预测 与同源比对预测 ，共预测得到 23424 个蛋白编码基因以及 1096 个非编码 RNA 基因。非编码 RNA 包含 72 个 miRNA、575 个 tRNA、449 个 rRNA（见补充材料）。通过比对 NR、TrEMBL、KOG、GO、KEGG 数据库，共有 23050 个基因获得功能注释（见补充材料）。其中 13438 个基因（57.37%）得到 GO 功能条目注释（见补充材料附图 A）；生物过程类中占比最高的条目为代谢过程，涉及 7709 个基因。
KEGG 分析表明厚朴基因主要富集于各类代谢通路（见补充材料附图 B），包括碳代谢（237 个基因）、氨基酸生物合成（217 个基因）、淀粉与蔗糖代谢（207 个基因）以及苯丙烷类生物合成（190 个基因）。KOG 功能注释结果显示，厚朴多数注释基因归属于次生代谢物的合成、转运与分解，其中细胞色素 P450 家族（181 个基因）、多铜氧化酶（56 个基因）基因数量突出（见补充材料附图 C、补充材料）。
细胞色素 P450 在植物代谢网络中扮演关键角色：例如 CYP98 催化苯丙烷生物合成的限速步骤；苯丙烷通路核心酶 C4H 则属于 CYP73 家族。本研究在厚朴基因组中鉴定到CYP73A 与CYP98A家族基因（见补充材料）。
基因家族与系统基因组学分析
比较基因组分析显示，23424 个预测蛋白编码基因中，共计 21966 个基因可聚类为 14082 个基因家族，其中 202 个为厚朴特有基因家族（见补充材料）。木兰类共有基因家族为 8106 个（分析物种：厚朴、鹅掌楸、香樟、鳄梨、山鸡椒）。厚朴与鹅掌楸共享 784 个基因家族；而和樟科物种相比，二者共享的基因家族数量更少（图 3A）。
图 3 厚朴与其他物种的比较基因组分析 (A) 厚朴、鹅掌楸、山鸡椒、鳄梨、香樟共有基因家族的韦恩图。物种名称下方数字为该物种总基因家族数目；韦恩图内数字代表对应交集的基因家族数量。 (B) 各物种在各个基因家族中的基因拷贝数统计分析。
为进一步探究木兰类的系统发育地位，本研究选取 14 个物种的 365 个单拷贝直系同源基因构建系统发育树（图 4）。结果显示，厚朴与望春玉兰亲缘关系最近。结合化石校正，利用 MCMCtree 估算分化时间，得到 95% 最高后验密度（HPD）置信区间；推断厚朴与望春玉兰的分化时间约为 6.330.2 百万年前（mya）。
迄今为止，真双子叶、单子叶与木兰类这三大类群之间的系统发育位置仍尚无定论。基于 365 个单拷贝基因构建的系统发育树，本研究支持木兰类为真双子叶和单子叶二者的共同姊妹群。结合此前已发表的另外两个木兰科基因组（望春玉兰、鹅掌楸），本研究的系统基因组学分析均表明木兰类独立于单子叶与真双子叶，该结论与前人研究结果保持一致。
图 4 基于 365 个单拷贝基因构建的 14 个物种系统发育树 红色五角星标记木兰目与樟目共享的全基因组复制（WGD）事件；紫色方框标记樟目经历的一次额外近代全基因组复制事件。
木脂素合成与调控相关基因
木脂素广泛存在于多种植物中，包括木兰属、五加属、五味子属以及亚麻属。部分木脂素类化合物已被证实具备显著生物活性，如开环异落叶松脂素、落叶松脂素、松脂醇、马台树脂醇、厚朴酚、和厚朴酚等。厚朴酚与和厚朴酚是厚朴特有的天然联苯类衍生物，同样经由木脂素合成通路生成。
鉴于厚朴酚、和厚朴酚的重要研究价值，本研究采用高效液相色谱，对厚朴 5 种组织（叶、根、茎、小枝、果实）中的这两种活性成分开展定量检测（图 5）；同时结合这 5 种组织的转录组数据，解析木脂素生物合成通路相关基因。
图 5 厚朴 5 种组织（叶、根、茎、小枝、果实）中厚朴酚与和厚朴酚的高效液相色谱（HPLC）检测结果
基于转录组测序结果，本研究鉴定出 65 个木脂素合成相关基因，每一个基因家族在 5 种组织中均至少存在 1 个高表达成员（图 6B），包括 PAL、C4H、4CL、PLR 等，上述基因的表达可推动木脂素的生物合成。
在苯丙氨酸代谢通路中会生成香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸等一系列中间产物；这些中间产物再经多种酶催化，转化为木脂素及其他代谢物质。PAL、C4H、4CL 与 PLR 是研究较为充分的关键酶，在木脂素生物合成中发挥重要作用；本研究的转录组数据集均鉴定到这些木脂素合成通路相关基因。
PAL 催化苯丙氨酸代谢的第一步反应，通过脱氨基作用将苯丙氨酸转化为肉桂酸。本研究检测到PAL基因在厚朴 5 种组织中均高表达。属于细胞色素 P450 家族的 C4H 主要在根和小枝中表达；厚朴基因组中也鉴定出多种 CYP450 酶家族成员（补充材料附表 2），该类酶特异性对肉桂酸进行羟基化，生成对香豆酸。4CL 的功能是分别将香豆酸、咖啡酸、阿魏酸转化为对应的辅酶 A 酯，该基因同样在 5 种组织中高表达。PLR 催化松脂醇还原生成落叶松脂素，再进一步生成开环异落叶松脂素；开环异落叶松脂素可经 SIDR 氧化生成马台树脂醇（图 6A）。
由马台树脂醇起始的木脂素下游生物合成过程至今尚未完全阐明。但从苯丙氨酸到马台树脂醇这一反应步骤是木脂素合成通路的共有阶段，马台树脂醇被认为是各类木脂素合成的核心中间代谢物。
综上，本研究拓展了厚朴中新木脂素（厚朴酚、和厚朴酚）生物合成候选基因的相关研究，但其潜在的分子调控机制仍有待进一步解析。
图 6 基于转录组解析厚朴 5 种组织中木脂素生物合成通路基因的表达模式 (A) 木脂素生物合成总通路。实线箭头代表已报道酶催化的反应；虚线箭头代表厚朴中尚未完全阐明的木脂素合成预测步骤。 (B) 木脂素合成通路基因的表达量。R：根；F：果实；S：茎；L：叶；T：小枝； C4H：肉桂酸4羟化酶；COMT：咖啡酸 3O甲基转移酶；CCOAMT：咖啡酰辅酶 AO甲基转移酶； HCT：莽草酸O羟基肉桂酰转移酶；SIRD：开环异落叶松脂素脱氢酶；CAD：肉桂醇脱氢酶； CCR：肉桂酰辅酶 A 还原酶；4CL：4香豆酸辅酶 A 连接酶；PLR：松脂醇落叶松脂素还原酶； PAL：苯丙氨酸解氨酶。
全基因组复制与共线性分析
全基因组复制事件被认为是生物演化的重要驱动力。本研究解析了厚朴、鹅掌楸、香樟、山鸡椒的全基因组复制（WGD）事件。厚朴旁系同源基因的 Ks 分布仅出现 1 个峰值（Ks≈0.73），说明其经历过一次古老全基因组复制。鹅掌楸、香樟、山鸡椒的旁系同源基因 Ks 分布同样存在峰值，Ks 值分别约为 0.68、0.76、0.8（图 7A）。
WGD 分析结果表明：木兰科与樟科共享这一次古老全基因组复制事件；此后樟科还额外发生一次白垩古近纪 WGD 事件（Ks₁≈0.5）。这次早期复制事件被命名为 λ 事件，发生于约 1.2 亿年前木兰类早期分化阶段。综上，4 个木兰类物种均在约 1.2 亿年前经历 λ 复制事件，该结论与已发表的望春玉兰、鹅掌楸、香樟、山鸡椒基因组研究结果一致。
厚朴分别与鹅掌楸、香樟、山鸡椒的一对一直系同源基因 Ks 值为 0.13、0.75、0.76。该结果说明：厚朴的 WGD 发生在木兰科樟科共同祖先分化之后，这与同属的望春玉兰的近期基因组演化研究结论存在差异。本研究推断，以香樟、山鸡椒为代表的樟科，与厚朴、鹅掌楸代表的木兰科，在白垩纪约 1.16-1.20 亿年前发生分化。
图 7 厚朴基因组演化与共线性分析 (A) 红色虚线框代表物种内比较；蓝色虚线框代表物种间比较。种内 Ks 分布峰值指示古老全基因组复制（WGD）事件；种间 Ks 分布峰值指示物种分化事件。 (B) 共线性模式图：厚朴基因组的一个区段可对应香樟基因组中最多两个区段，对应鹅掌楸基因组中最多一个区段。背景灰色连线代表跨基因组的主要共线性区块；一组共线性对用彩色高亮展示。
本研究将厚朴基因组分别与鹅掌楸、香樟开展共线性分析。在厚朴鹅掌楸的共线性区块中，鉴定到 23122 个同源基因，占总基因数的 39.39%；厚朴香樟共线性区块包含 15417 个同源基因，占总基因数 30.86%。 进一步比较基因组分析显示：厚朴鹅掌楸共线性深度比为 1∶1，厚朴香樟共线性深度比为 1∶2（图 7B）。该结果与物种 WGD 历史吻合：鹅掌楸经历一次古老 WGD，而香樟经历了两次古老 WGD 事件。
萜类合酶基因家族
厚朴是观赏植物，花朵硕大雅致且具有独特花香。木兰科其他物种，如望春玉兰、黄兰、白兰花同样香气浓郁。已有针对厚朴不同开花时期的花香挥发物研究表明，萜类是花香主要组分，其中莰烯、D柠檬烯、月桂烯、石竹烯等单萜与倍半萜含量最高。
萜类是花香物质中最大的一类；萜类合酶（TPS）基因是决定挥发性代谢物时空释放的关键基因 ，TPS 参与花香物质合成已在多种植物中得到证实。利用 HMMER，基于保守结构域（PF01397、PF03936），本研究在厚朴基因组中共注释得到 40 个 TPS 候选蛋白。 将厚朴、望春玉兰、鹅掌楸与拟南芥的 TPS 蛋白序列比对并构建系统发育树，确定厚朴 TPS 家族分类（图 8B）。系统发育树将 40 个 TPS 蛋白划分为 TPSa、TPSb、TPSc、TPSe、TPSf 共 5 个亚家族。多数 MoTPS 归属于 TPSa 与 TPSb 亚家族；被子植物已知的倍半萜合酶、单萜合酶大多分布于这两个亚家族。 相较于 TPSa、TPSb 亚家族存在大量亲缘关系很近的 MoTPS 成员，TPSc、TPSe、TPSf 每个亚家族仅含有少量基因；在组装的厚朴基因组中未鉴定到 TPSg 亚家族 。TPSg 主要合成无环单萜，其产物挥发性强于其他 TPS 亚家族。厚朴花香挥发物中无环单萜含量偏低，花香偏淡雅。据此推测：TPSg 亚家族可能在厚朴物种演化过程中发生丢失，该差异可能参与调控花香挥发物的生物合成。
此外，TPS 基因主要分布于厚朴 10 号染色体；1、2、15、16 号染色体上存在多处 TPS 基因簇（图 8A），这很可能来源于 TPS 基因的串联复制。
图 8 厚朴 TPS 基因家族的系统发育树与染色体定位
(A) 厚朴、望春玉兰、鹅掌楸与拟南芥 TPS 蛋白的系统发育树 (B) 厚朴 TPS 基因的染色体定位
讨论
植物基因组通常体量庞大、结构复杂。随着基因组测序与生物信息学技术不断发展，加之测序成本下降、分析方法持续优化，厚朴的基因组测序研究得以快速推进。
本研究整合 PacBio 长读长序列与 Hi-C 高精度 reads，构建了高质量、染色体水平的厚朴基因组组装版本。厚朴基因组具有高杂合、高重复序列 的特征。结合已发表的木兰科与樟科基因组数据可以发现：木兰科物种的基因组普遍偏大，例如厚朴（1.68 Gb）、望春玉兰（2.25 Gb）、鹅掌楸（1.74 Gb）；而樟科物种基因组相对更小，为 0.73--1.32 Gb。这种差异主要和重复序列中的**转座元件（TE）**相关。被子植物基因组中普遍存在转座元件含量与基因组大小显著相关的现象：拟南芥基因组（115 Mb）中转座元件占比仅 20%--30%，燕麦属重复序列约 70%--80%，玉米基因组（2 Gb）中转座元件占比超过 85%。本研究中的 3 个木兰科物种，转座元件占基因组比例均超过 60%。重复序列的扩增为基因组演化提供了丰富变异来源；但本研究尚无法阐明转座元件爆发是否推动物种遗传分化、进而帮助物种快速适应环境。
全基因组复制（WGD）在被子植物中十分普遍，很多物种巨大的基因组与复杂结构都源于 WGD（即多倍化事件）。本研究的证据表明木兰类植物经历两次古老 WGD：一次是樟目与木兰目共享的古老复制事件；另一次是樟科独立发生的额外 WGD。同时我们在厚朴与其他木兰类基因组间检测到共线性信号：厚朴与鹅掌楸的共线性区块为 1:1，厚朴与香樟为 1:2。因此，与经历两次多倍化事件的樟科（香樟）相比，木兰科（厚朴、鹅掌楸）仅经历一次和木兰类共享的多倍化事件。
木兰类是被子植物中较早分化的分支。但木兰类和真双子叶、单子叶之间的系统发育关系至今没有定论，目前主流有三种拓扑假说：（1）木兰类是真双子叶的姊妹群；（2）木兰类是单子叶的姊妹群；（3）木兰类是真双子叶 + 单子叶这一大支的姊妹群。造成拓扑结构差异的因素很多，包括样本量偏小、类群与基因取样不足、缺少核心木兰类关键类群等。木兰类中的白樟目目前还缺少基因组数据，需要更多植物类群的基因组信息，才能厘清这类长期孤立的被子植物的演化位置。本研究选取 14 个物种（6 个木兰类、3 个真双子叶、2 个单子叶、2 个 ANA 基部被子植物、1 个裸子植物）的 365 个单拷贝同源基因进行分析，结果支持木兰类是真双子叶 + 单子叶复合支系的姊妹群。该拓扑结构和同科的望春玉兰、鹅掌楸以及多篇已发表研究结论一致。
此外，本研究还重点探究和厚朴酚、和厚朴酚生物合成相关的生物学过程。通过多组学分析，我们在苯丙烷合成通路中筛选到多个关键酶，它们参与苯丙氨酸脱氨到罗汉松脂素生成这一过程。但遗憾的是，本研究尚未阐明木脂素下游重要中间产物罗汉松脂素如何转化为厚朴酚与和厚朴酚，该通路的具体机制仍有待深入解析。厚朴花香主要来自萜类物质；本研究一共鉴定到 40 个萜类合成通路候选基因，明确了该合酶多基因家族的分类。和望春玉兰相比，厚朴基因组缺失 TPS-g 亚家族。TPS-g 负责合成挥发性强的无环萜，因此我们推测 TPS-g 亚家族在演化中发生丢失，这也是厚朴花香偏淡的原因。
综上，本研究组装得到染色体水平的厚朴参考基因组，为解析木兰类演化历史、挖掘木脂素合成相关基因奠定基础。
研究局限性
本研究完成厚朴基因组测序，鉴定到若干木脂素合成相关基因；但仍无法完整解析厚朴活性成分的合成通路，还需要更多代谢组研究来阐明厚朴酚、和厚朴酚的合成途径。
方法详情
植物材料
厚朴材料采集自中国成都中医药大学药用植物园（东经 103°48′16″，北纬 30°41′29″）。采用改良 CTAB 法提取厚朴新鲜叶片的基因组 DNA；采集厚朴的叶、茎、根、小枝、果实用于转录组测序，每组设置 3 个生物学重复。按照试剂盒说明书，使用百迈客植物总 RNA 提取试剂盒（中国）提取总 RNA。所有实验材料均保存于国家中药种质资源库，储存温度−80 ℃。
基因组文库构建、测序与基因组大小预估
按照 PacBio SMRT 文库构建流程制备建库用基因组 DNA。SMRTbell DNA 模板制备流程包含 DNA 片段化、DNA 浓缩、损伤修复、末端修复、接头连接以及模板共纯化。之后在 PacBio Sequel 平台（美国加利福尼亚州门洛帕克，Pacific Biosciences 公司）完成基因组测序；同时在 Illumina Hiseq X Ten 平台（美国加利福尼亚州圣地亚哥，Illumina 公司）开展 PE150 双端测序。采用标准流程构建 HiC 文库，并在 Illumina Hiseq X Ten 平台测序。
基于 Illumina Hiseq X Ten 得到的测序数据，利用 Kmer（k = 21）分布曲线开展厚朴基因组预评估，估算基因组大小、杂合度以及重复序列含量。
转录组测序
使用 NEB Next Ultra RNA 文库制备试剂盒（美国）构建 cDNA 文库；文库在北京百迈客生物科技有限公司的 Illumina NovaSeq 6000 平台进行 PE150 模式测序。使用 Trinity v2.1.1 软件对叶、茎、根、小枝、果实混合样本的转录组 reads 进行组装。
基因组从头组装与 HiC 染色体挂载
使用 Canu v1.8 完成基因组初步组装，并结合 WTDBG 进行纠错组装；利用 Quickmerge 的合并策略优化两套组装结果。最后利用 Pilon 软件结合 Illumina 短读长对基因组草图进行纠错。 为将 scaffold 挂载至染色体，构建 HiC 文库；使用 BWA v0.78 将 HiC 有效 reads 比对到基因组初步组装序列。采用 HiCPro v2.7.1 基于唯一比对读对筛选有效互作片段；再使用 Lachesis 软件将经过纠错的 scaffold 完成聚类、排序与定向，得到染色体水平基因组。分别采用 CEGMA v2.5 和 BUSCO v5.0 评估基因组组装完整度。
重复序列注释
结合从头预测与同源比对两种策略注释厚朴基因组重复序列。使用 LTR_Finder v1.05、RepeatScout v1.05、PILER v2.4 完成重复序列的从头预测；利用 PASTEClassifier v1.0 分类重复元件，调用 RepeatMasker v4.06 比对 Repbase 重复序列数据库完成同源重复序列注释。
基因预测
采用两种策略鉴定厚朴蛋白编码基因。 从头预测：调用 Genscan v3.1、Augustus v2.4、GlimmerHMM v3.0.4、GeneID v1.4、SNAP v20060728。 同源预测：从 NCBI 数据库下载拟南芥、水稻、向日葵、莲的蛋白序列，经 TblastN 比对后，使用 GeMoMa v1.3.1 进行同源基因预测。 最后使用 EVM v1.1.1 整合以上所有预测结果，得到最终基因集。
非编码 RNA 注释与基因功能注释
依据各类非编码 RNA 的结构特征，使用 Infernal v1.1.2 比对 Rfam 与 miRbase 数据库预测 rRNA 和 miRNA；采用 tRNAscanSE v1.3.1 识别 tRNA 基因。 功能注释：使用 BLASTP（Evalue＜1e5）比对 NR、KOG、KEGG、TrEMBL 等功能数据库；利用 Blast2GO 完成 GO 功能注释；开展 KEGG 通路富集分析对厚朴预测基因进行功能解析。
比较基因组与系统发育树构建
为解析厚朴基因演化模式和物种特有基因，选取另外 13 个已发表基因组做多物种比较：5 个木兰类（香樟、鹅掌楸、望春玉兰、山鸡椒、鳄梨），3 个真双子叶（拟南芥、毛果杨、茶树），2 个单子叶（水稻、玉米），2 个 ANA 基部被子植物（无油樟、睡莲），1 个裸子植物（银杏）。使用 OrthoFinder v2.3.8 鉴定同源基因家族。
使用 MAFFT v7.394 对单拷贝蛋白序列做多序列比对；PAL2NAL（version14）将蛋白比对结果转换为编码序列；IQTREE v2.0.7 采用 JTT + F + I + G4 模型构建系统发育树，bootstrap 设置 1000 次重复。 使用 PAML 软件包中的 MCMCTREE 估算物种分化时间，参数设置：burnin = 5 000 000，nsample = 5 000 000，sampfreq = 30。从 TimeTree 数据库选取两个分化时间作为节点校正正态先验：无油樟鹅掌楸（约 173--199 百万年前）、水稻玉米（约 42--52 百万年前）。
全基因组复制与共线性分析
使用 Wgd（version 1.1.1）计算同义替换率 Ks 分布，采用跨物种与单系类群分析统计 Ks 分布；Ks 分布曲线上显著峰值对应物种分化事件或者全基因组复制事件。使用公式 \(T=Ks/2r\)（\(r=3.21\times10^{−9}\)）估算全基因组复制事件与同源基因分化时间。 利用 DIAMOND 执行 BLASTP（Evalue < 1e5）搜索厚朴与其他基因组的同源蛋白；MCScanX 用于基因组共线性分析，统计基因组内共线性区块数量。
定量与统计分析
本研究所有 BLAST 比对设置 E-value < 1e-5 作为筛选阈值。
Data and code availability
The accession number for the genome assembly and raw reads reported in this paper is GenBank: PRJNA752832 and PRJNA752923, respectively. This paper does not report original code. Any additional information required to reanalyze the data reported in this paper is available from the lead contact upon request.