一、为什么需要进行抗原--抗体分子对接？
在前面的教程中，我们已经利用MOE完成了CNTO607--IL-13复合物的结构准备、CDR注释、结合界面分析以及抗体理化性质计算。
这些分析主要基于已知的抗原--抗体复合物结构。
然而，在实际抗体研究中，我们经常只能获得抗体和抗原各自的三维结构，而缺少两者结合后的实验复合物结构。
例如，通过抗体同源建模或AlphaFold等结构预测工具，可以获得抗体的三维结构；同时，也可能从PDB数据库或其他结构预测方法获得抗原结构。
但即使已经知道两个蛋白质各自的结构，我们仍然无法直接确定：
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抗体主要结合在抗原的哪个区域？
-
抗体以什么方向和角度接近抗原？
-
哪些CDR可能参与抗原结合？
-
两个蛋白质之间是否能够形成合理的结合界面？
蛋白质--蛋白质对接（Protein--Protein Docking）就是用于研究这些问题的重要计算方法。
其基本思想是：在给定两个蛋白质三维结构的情况下，搜索它们可能的相对位置和空间取向，并通过一定的评分方法筛选潜在的结合构象。
在抗体设计中，这些预测结果可以为抗原表位识别、关键结合残基分析以及后续抗体突变优化提供结构参考。
二、蛋白质--蛋白质对接与小分子对接有什么区别？
小分子对接通常是将一个小分子配体放置到蛋白质的结合口袋中，搜索不同的平移、旋转和内部构象，并利用评分函数评价预测结果。
但蛋白质--蛋白质对接存在一些不同的特点。
| 比较维度 | 小分子--蛋白质对接 | 蛋白质--蛋白质对接 |
|---|---|---|
| 配体大小 | 通常较小 | 蛋白质分子，原子数量较多 |
| 结合区域 | 通常为相对明确的结合口袋 | 可能为面积较大的蛋白质表面 |
| 构象搜索 | 平移、旋转和配体内部扭转 | 主要搜索蛋白质之间的相对位置和取向，并可能考虑构象变化 |
| 搜索空间 | 通常可以利用口袋信息限制范围 | 当结合区域未知时，搜索空间较大 |
| 评分考虑 | 配体--受体相互作用、溶剂化等 | 大范围界面接触、静电互补、溶剂化等 |
对于抗体--抗原对接，虽然抗体的结合区域通常集中在可变区的CDR附近，但抗原表位的位置可能并不明确。
因此，如果直接对整个抗原表面开展搜索，可能产生大量候选结合构象。
而且，抗体本身也可能存在一定的构象柔性，特别是CDR-H3等环区，其构象变化可能对抗原识别产生影响。
这些因素都会增加蛋白质--蛋白质对接的计算难度。
三、MOE如何进行蛋白质--蛋白质对接？
MOE的Protein--Protein Docking通过构象搜索和能量评价，预测两个蛋白质可能形成的结合构象。
其核心流程可以概括为三个步骤。
3.1 粗粒化表示（Coarse-grained Representation）
由于蛋白质通常包含大量原子，如果在构象搜索的每一步都进行完整的原子级能量计算，计算成本可能非常高。
因此，MOE采用粗粒化表示方法，将蛋白质中的原子信息转换为数量更少的计算单元（Beads）。
在该方法中，一个氨基酸残基可以使用1--3个粗粒化Beads表示，并赋予相应的范德华及电荷参数。
这样可以在保留部分关键物理特征的同时减少计算量，使较大规模的构象搜索成为可能。
需要注意，粗粒化并不意味着忽略原子间相互作用，而是利用简化后的表示方法近似计算蛋白质之间的作用。
3.2 刚体构象搜索（Rigid-body Docking）
在刚体对接中，两个蛋白质的内部构象保持不变，主要搜索它们之间不同的平移和旋转方式。
MOE使用快速傅里叶变换（Fast Fourier Transform，FFT）等方法进行构象搜索，能够在较大的空间范围内生成大量候选结合姿态。
每一种候选结合姿态通常称为一个Pose。
搜索过程中，蛋白质可能以不同方向接近对方，并形成不同的接触界面。
因此，对接输出通常不是一个唯一结构，而是多个候选复合物构象。
3.3 构象优化与评分
生成候选Pose后，MOE会进一步使用更精细的能量模型对构象进行优化和筛选。
其评价会涉及范德华相互作用、静电相互作用和溶剂化等能量项。
例如，GB/VI（Generalized Born/Volume Integral）是一类隐式溶剂模型，可以用于近似描述溶剂环境对分子能量的影响。
通过逐步优化和评价，MOE最终输出一组经过排序的候选结合构象。
需要强调，Protein--Protein Docking的评分只能作为候选构象筛选依据，并不等同于实验测得的结合自由能。
此外，刚体对接主要考虑蛋白质之间的相对位置变化，难以充分描述较大的蛋白质构象重排。因此，当真实结合过程涉及显著的CDR或抗原构象变化时，预测结果可能存在偏差。
四、抗体--抗原对接为什么需要CDR约束？
在普通的蛋白质--蛋白质对接中，如果不知道具体的结合位置，通常需要搜索较大范围的蛋白质表面。
但对于抗体，我们已经具有一定的先验知识。
抗体通常通过VH和VL组成的可变区识别抗原，而六个CDR是抗原结合区域的重要组成部分。
因此，可以在对接时利用CDR信息，对抗体的候选结合区域进行限制。
这种方法被称为结合位点约束（Site Restraints）。
其作用是减少明显不符合预期的结合方式，使搜索更加集中于可能具有生物学意义的区域。
例如，如果一个预测Pose主要依赖Fab恒定区与抗原结合，而完全没有利用可变区，那么对于常规抗原结合型抗体而言，这种姿态通常需要谨慎评价。
引入CDR约束能够帮助减少此类不合理构象。
不过，需要注意以下两点：
-
CDR约束并不代表六个CDR都必须直接接触抗原，也不意味着Framework残基完全不能参与结合。
-
CDR约束主要提供抗体侧结合区域的信息，并不等于已经知道抗原上的准确表位。
因此，CDR约束属于辅助对接搜索的先验信息，而不是对真实结合方式的实验确认。
五、使用MOE进行CNTO607--IL-13对接
本篇继续使用PDB 3G6D。
由于3G6D已经包含CNTO607与IL-13的实验复合物结构，我们可以利用它开展一个具有已知参考构象的对接案例。
在本次计算中，使用其中抗体和抗原各自的结构进行对接搜索，最终可以将预测Pose与实验结合构象进行比较。
这种方法属于基于结合态结构的对接验证练习（Bound-state Redocking），它有助于学习对接操作与评价方法，但不能直接代表对未知抗原--抗体体系的预测能力。
步骤1：加载并准备3G6D复合物
在MOE中打开：
MOE | RHS | Open
选择：
3g6d.pdb.gz
或者打开之前已经完成结构准备的复合物文件。
如果从原始PDB重新开始，应按照第一篇教程完成QuickPrep结构预处理。
接下来，点击MOE主界面的SEQ按钮，打开Sequence Editor，并使用：
SEQ | Annotate | Antibody | IMGT
对抗体进行CDR注释。
完成后，MOE可以识别抗体重链、轻链、抗原及对应的CDR区域，并在System Manager中形成相应的结构分组和残基集合。
本次对接主要涉及：
| 组分 | 对应结构 |
|---|---|
| Antigen | IL-13，3G6D.A |
| Antibody | CNTO607，3G6D.H与3G6D.L |
| CDR | 抗体可变区中的CDR残基集合 |
这里需要特别注意：用于对接的抗体不仅仅是一条重链，而是由Fab中的重链和轻链共同组成的结构。
步骤2：启动Protein--Protein Docking
在MOE主菜单中选择：
MOE | Protein | Protein-Protein Dock...
随后会打开Dock面板。
在面板左侧选择：
Protein-Protein
进入蛋白质--蛋白质对接设置界面。
在这个界面中，可以定义参与对接的两个蛋白质，以及对接位点、搜索约束、构象优化与输出文件等参数。
步骤3：定义Receptor与Ligand
在蛋白质--蛋白质对接中，我们通常需要确定两个计算对象：
-
Receptor： 在对接搜索中作为相对固定参考的蛋白质。
-
Ligand： 相对于Receptor进行位置和方向搜索的蛋白质。
对于本次CNTO607--IL-13案例，设置为：
Receptor：Antigen
Ligand：Antibody
即将IL-13设置为Receptor，将CNTO607设置为Ligand。
这里的Ligand不一定是小分子，在蛋白质--蛋白质对接中，它也可以是一个完整的蛋白质或蛋白复合物片段。
将抗体定义为Ligand，主要是为了在对接过程中搜索抗体相对于抗原的不同结合姿态。
步骤4：设置结合区域
在Dock面板中找到：
Site
点击下拉菜单，选择已建立的：
Antigen
集合。
该设置用于指定当前对接操作中的相应位点集合。不同版本或不同结构注释状态下，可用的集合名称可能有所不同，因此需要确认Antigen集合确实对应IL-13，而不是仅依赖名称进行判断。
对于真实的未知表位体系，如果已有抗原结合区域的实验信息，也可以考虑进一步限定抗原侧的候选结合位置。
但本篇主要学习CDR约束对接，不额外引入未经验证的抗原表位限制。
步骤5：启用CDR Site Restraints
在Protein-Protein面板中找到：
Antibody: Auto-detect CDR Site Restraints
勾选该选项。
这一功能用于自动识别抗体CDR相关的结合区域约束，从而辅助进行抗原--抗体对接。
在当前示例中，Ligand Site区域还可以显示CDR相关的位点集合，例如CDR_H3。
需要注意，Ligand Site中的具体选项与Auto-detect CDR Site Restraints的自动约束设置需要分别检查。不能仅凭显示了CDR_H3，就认为全部CDR都具有相同约束，也不能直接认定只有CDR-H3参与真实结合。
步骤6：检查对接方法及输出设置
在同一个对接面板中，可以看到：
Refinement：Rigid Body
该选项表示当前使用刚体形式进行相关的构象优化。
在刚体优化过程中，主要调整蛋白质之间的相对位置和取向，不对蛋白内部的所有构象自由度进行充分搜索。
对于本次示例，可以保留该设置。
随后，在Output区域指定结果文件，例如：
dock.mdb
MDB是MOE使用的分子数据库格式，可以保存多个候选结构及相应的计算结果。
为了避免覆盖已有数据，也可以根据个人的文件管理习惯使用其他名称，例如：
CNTO607_IL13_dock.mdb
建议每次对接计算使用独立的结果文件，以便后续进行比较和复现。
步骤7：运行蛋白质--蛋白质对接
检查参数设置后，点击：
Run
MOE将启动Protein--Protein Docking计算。
对接过程中，程序会搜索不同的抗体结合位置和空间取向，并逐步筛选候选构象。
由于蛋白质--蛋白质对接需要搜索较大的构象空间，因此通常比简单的小分子局部结构优化消耗更多计算资源。
具体计算耗时会受到蛋白质大小、搜索参数及计算机性能等因素影响。
六、蛋白质--蛋白质对接会产生什么结果？
6.1 为什么会得到多个Pose？
在对接计算过程中，抗体可以通过不同的方向和角度接近抗原。
每一种候选结合姿态都可以表示为一个Pose。
这些Pose之间可能存在以下差异：
-
抗体结合在抗原的不同表面区域。
-
抗体结合位置相似，但相对旋转方向不同。
-
抗体识别的局部区域接近，但接触残基及界面构象存在差异。
因此，Protein--Protein Docking通常会输出多个候选结构，而不是只生成一个最终答案。
程序可以根据相应评分对结果进行排序，但评分靠前的Pose并不一定就是实验中的真实结合构象。
6.2 对接结果保存在哪里？
计算完成后，MOE会将结果写入指定的MDB数据库。
例如：
dock.mdb
该数据库可用于后续的构象浏览、评分比较及界面分析。
如果尚未完成实际计算，也可以使用MOE示例目录中提供的预计算数据库：
$MOE/sample/mol/3g6d_dock.mdb
这一示例数据库包含20个经过筛选和重新聚类的候选Pose，可用于后续的结果分析练习。
需要注意，这20个Pose是该示例数据库的内容，并不意味着每次对接计算都一定输出20个结构。
步骤8：打开对接结果数据库
使用：
MOE | RHS | Open
选择生成的dock.mdb文件。
如果使用已有的示例结果，则打开：
3g6d_dock.mdb
随后MOE会启动Database Viewer，显示对接计算生成的结构记录和相关字段。
步骤9：初步浏览对接构象
在Database Viewer中选择：
DBV | File | Browse
打开Database Browser。
在浏览面板中，可以选择包含分子结构的mol字段，查看不同的候选Pose。
如果使用3G6D预计算示例，可以通过浏览按钮依次切换不同的结合构象。
此时可以初步观察：
-
抗体是否位于IL-13表面合理的结合区域。
-
不同Pose之间的结合方向是否存在明显差异。
-
抗体的可变区是否朝向抗原。
-
是否存在显著的空间冲突或不合理的结合方式。
本篇暂时不对所有Pose进行详细评分或结构比较，主要确认对接计算已经生成可供后续分析的候选复合物。
七、如何理解CDR约束对接的优势与局限？
对于抗体--抗原体系，CDR约束可以提高对接搜索的针对性。
然而，引入约束并不意味着对接结果一定正确。
首先，抗体真实的结合方式可能涉及多个CDR和部分Framework残基，过于严格的约束可能限制真实结合构象的搜索。
其次，当抗体或抗原在结合前后发生明显构象变化时，刚体对接可能难以准确描述这种变化。
此外，如果抗原表位未知，即使已经限制抗体侧的CDR区域，仍然可能在抗原表面形成多种不同的候选结合模式。
因此，在实际应用中，可以根据已有信息选择不同的对接策略：
| 已知信息 | 可考虑的对接策略 |
|---|---|
| 只有抗体和抗原结构 | 在较大范围内搜索可能的结合构象 |
| 已知抗体CDR区域 | 使用CDR约束辅助搜索 |
| 已知部分抗原表位残基 | 结合表位信息进一步限制搜索区域 |
| 已有实验复合物结构 | 利用实验结构检验预测构象 |
对于CNTO607--IL-13，本次具有实验复合物作为参考，因此适合进一步开展预测结构与实验结构之间的比较。
但需要区分：使用结合态结构进行Redocking，与仅凭未知复合物的两个独立结构预测结合模式，并不是难度完全相同的任务。
如果抗体在结合前后发生较大构象变化，真实的未知结合模式预测可能更加困难。
因此，对接结果需要通过多种结构信息进行综合评价，而不能只依据排名选出一个Pose。
八、常见问题
Q1：为什么已经有3G6D复合物，还需要重新对接？
本篇使用3G6D主要是为了建立可验证的教学案例。
通过已知实验复合物，可以在后续分析中比较预测Pose与实验结构之间的差异，从而理解对接方法的预测能力和局限性。
Q2：Receptor和Ligand可以交换吗？
在概念上，两个蛋白质都可以作为对接对象，但Receptor和Ligand的设置决定了程序如何处理固定参考结构、移动对象及相关位点约束。
因此，交换两个对象可能改变搜索设置和结果，尤其是在使用特定Site或CDR约束时。
在本篇案例中，建议保持Antigen作为Receptor、Antibody作为Ligand。
Q3：为什么CDR注释后仍然找不到CDR约束？
需要检查抗体链是否被正确识别，以及Sequence Editor中的抗体注释是否已经完成。
此外，还需要确认用于对接的抗体结构包含正确的重链和轻链，并检查Site或Ligand Site下拉菜单中的可选残基集合。
Q4：为什么不同次运行得到的对接构象可能不同？
对接搜索的结果可能受到初始结构、搜索参数、约束设置、采样策略及软件版本等因素影响。
因此，比较不同计算结果时，应记录所使用的结构和计算条件。
Q5：对接排名第一的Pose是否就是最合理的结合结构？
不一定。
评分较高的Pose可能在当前评分模型下具有较有利的相互作用，但不一定与真实结合构象一致。
还需要结合CDR参与情况、界面接触、空间冲突、构象聚类以及已有实验信息进行进一步评价。
九、本篇小结
本篇以CNTO607--IL-13复合物为例，介绍了MOE Protein--Protein Docking的基本原理和实际操作流程。
我们首先了解了蛋白质--蛋白质对接与小分子对接之间的区别，以及粗粒化表示、FFT构象搜索和能量评分的基本思想。随后通过MOE设置抗原和抗体的对接对象，使用CDR Site Restraints辅助结合构象搜索，并将计算结果保存到MDB数据库中。
通过这些操作，我们获得了多个可供进一步分析的候选抗原--抗体复合物构象。
需要注意，Protein--Protein Docking主要提供可能的结合模式，其预测结果仍然需要进一步评价和验证。
下一篇预告
MOE抗体的理性设计教程（07）：如何评价抗原--抗体对接结果？结合构象排序与结构比较
下一篇将继续使用CNTO607--IL-13的对接数据库，介绍如何通过Database Viewer浏览候选Pose，并结合实验复合物结构、RMSD及界面接触等信息，对不同的预测结合构象进行比较和评价。