转录组学习第四弹-数据质控

数据质控

将SRR转为fastq之后，我们需要对fastq进行质量检查，排除质量不好的数据

1.质量检查，生成报告文件

ls *fastq.gz|while read id;do fastqc $id;done

并行处理

ls *fastq.gz|xargs fastqc -t 10

2.生成 html 报告文件和对应的 zip 压缩文件，并通过 scp 命令传输到本地后用浏览器打开查看。

#传文件
scp -i username@server-ip:~/my_project/airway/QC_results /Users/yangshengyu/qc

#传文件夹
scp -r username@server-ip:~/my_project/airway/QC_results /Users/yangshengyu/qc
#如果默认端口22关闭，使用-P指定端口

多个报告文件合成一个总的报告文件方便查看，不用一个个打开检查

mkdir QC_results 
mv *zip *html QC_results 
cd QC_results
multiqc ./

3.结果说明

FastQC 结果由11个模块组成，对于结果报告各个模块的说明参考FastQC 文档

1）综合统计(General Statistics)

重复reads的比例（%Dups）、GC含量占总碱基的比例、总测序量（M Seqs，单位：millions）

2）序列的计数（sequence counts）

可以看到reads的数量和重复reads的百分比

3）每个read各位置碱基的平均测序质量

横坐标------碱基的位置

纵坐标------质量分数=-10log10p（p代表错误率），所以当质量分数为40的时候，p就是0.0001。此时说明测序质量非常好。

绿色区间------质量很好，橙色区间------质量合理，红色区间------质量不好。

由此可知，32个样本在60个碱基前的测序质量平均线都在绿色区域内，质量很好。

4）具有平均质量分数的reads的数量

绿色区间------质量很好，橙色区间------质量合理，红色区间------质量不好。由此可知，32个样本大部分都在绿色区域内，质量很好。

5）每个read各位置碱基ATCG的比列

reads每个位置的颜色显示由4种颜色的比例混合而成，哪一个碱基的比例大，则趋近于这个碱基所代表的颜色。正常情况下每个位置每种碱基出现的概率是相近的。由下图可知32个样本的ATCG的含量比例是比较均匀的，测序质量是可以的。

6）reads的平均GC含量

正常的样本的GC含量曲线会趋近于正态分布曲线。由下图可知GC含量曲线符合正态分布曲线，测序质量可以。

7）每条reads各位置N碱基含量比例

当测序仪器不能辨别某条reads的某个位置到底是什么碱基时，就会产生"N"。正常情况下，N值非常小。由下图可知有样本出现N碱基，其中SRR1039511_2出现的最多。

8）序列长度的分布

所有样本的序列都是单一长度（63bp）

9）每个序列的相对重复水平

横坐标：每个序列的相对重复水平

纵坐标：在文库中的比例

由下图可知每个样本序列的相对重复水平都较高，测序质量不好。

10）文库中过表达序列的比例

横坐标------过表达序列的比例

一条序列的重复数，因为一个转录组中有非常多的转录本，一条序列再怎么多也不太会占整个转录组的一小部分（比如1%），如果出现这种情况，不是这种转录本巨量表达，就是样品被污染。

11）接头含量

32个样本的接头含量基本都低于1%

4.原始数据修剪

使用trim_galore对原始数据进行去接头和质控

nohup trim_galore -q 25 --phred33 --length 35 --stringency 3 --fastqc -o ../clean $fq &

##批量处理
for fq in `ls |grep fastq$`; do nohup trim_galore -q 25 --phred33 --length 35 --stringency 3 --fastqc -o ../clean $fq ; done &

参数说明：

-q 25 # 设定Phred quality score阈值是25

-phred33 # 指定使用phred33碱基质量值体系

--length 35 # 输出reads长度阈值，小于35bp的reads会被抛弃

--stringency 3 # 可以忍受的前后adapter重叠的碱基数为3

--fastqc # 修剪完数据之后运行fastqc

长腿猴子请来的救兵

写于2023年11月21日 上英语课摸鱼写的