结构生物学3-冷冻电镜单颗粒重构：

第3章和第4章区别在于用冷冻电镜还是用x射线来解析结构

请结合图片，详细解释图片中的内容，要求逻辑清晰，并给出整理与答疑

1，单颗粒冷冻电镜：可参考第1章绪论

2，emdataresource

EMDataResource.org是一个全球性的统一门户，用于存放和检索3D电子显微镜（3DEM）密度图（density maps）、原子模型（atomic models）以及相关的元数据（metadata）。以下是关于EMDataResource.org和相关概念的详细解释：

EMDataResource.org

• 一站式资源：EMDataResource.org提供了一个集中的平台，用于存储和检索3DEM相关的数据。
• 合作开发：由斯坦福大学/SLAC冷冻电镜设施、Rutgers结构生物信息学研究合作实验室（RCSB）的研究人员与欧洲生物信息学研究所的EMDB团队合作开发。
• 资源提供：除了存储3DEM数据，EMDataResource.org还为3DEM社区提供新闻、活动、软件工具、数据标准和验证方法等资源。

EMDB

• 数据分发：EMDB（Electron Microscopy Public Image Archive）是一个公共资源，用于存储3D cryo-EM maps和tomograms的原始图像。
• 数据自由使用：EMDB中存档的所有数据都可以自由重复使用，没有任何条件或限制，采用"CC0"许可模式。

MRC/CCP4文件格式

• 文件结构：MRC格式是用于存储电镜数据的二进制文件格式，由三部分组成：main header、extended header和Data block。
• Main Header：包含固定格式值，如图像/体积的元数据，限制为1024字节。
• Extended Header：可变长度，用于存储附加的元数据，如晶体学对称操作符。
• Data Block：包含实际的图像/体积数据，根据map的"mode"，将grid values表示为一系列可能的数据类型之一。

Data Block

• 数据值列表：表示image/map/volume本身的数据值列表，数据类型由main header中的MODE关键字定义。
• 3D Grid：数据项形成一个三维网格，分为columns, rows和sections，由main header中的NX、NY、NZ定义。
• 方向设置：grid相对于坐标系的方向由主标题中的关键字MAPC、MAPR、MAPS设置。

答疑

问：EMDataResource.org的主要功能是什么？

答：EMDataResource.org的主要功能是作为3DEM密度图、原子模型和相关元数据的一站式存放和检索门户，同时为3DEM社区提供新闻、活动、软件工具、数据标准和验证方法等资源。

问：CCP4格式与MRC格式有什么关系？

答：CCP4格式与3DEM社区中使用的MRC格式密切相关。CCP4的限制性稍强，因为voxel位置仅限于包含笛卡尔坐标原点（0,0,0）的格网。

问：Data Block在MRC文件中的作用是什么？

答：Data Block在MRC文件中包含实际的image/volume数据，是MRC文件中存储数据值的关键部分，它根据map的"mode"将grid values表示为一系列可能的数据类型之一。

问：EMPIAR如何支持研究者获取和使用3D数据集？

答：EMPIAR作为一个公共资源，支持研究者通过volume EM技术和soft and hard X-ray tomography获得的3D数据集，并且所有数据都可以自由重复使用，没有任何条件或限制。

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2，相位衬度：

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3，阿贝成像理论：

阿贝成像原理（Abbe's imaging principle）是显微镜成像的基础理论，它描述了光波通过透镜系统如何形成图像。：

阿贝成像原理概述

阿贝成像原理认为，透镜的成像过程可以分为两个主要步骤：

1. 散射引起的分频作用：当光波通过物体时，物体上的每个点都会成为一次波源，发出球面波。这些球面波经过透镜的折射后，会聚于透镜的焦平面上，形成不同的点，这些点代表了物体的不同空间频率成分。
2. 干涉引起的"合成"作用：在焦平面上的光线继续向前传播，在像平面上通过干涉叠加，形成物体的像。

阿贝成像原理的关键概念

• 平面波（plane waves）：入射光波在物体平面上发生散射。
• 光栅（grating object）：物体可以看作是光栅，其上的每个点都发出球面波。
• 傅里叶平面（Fourier plane）：球面波经过透镜折射后在焦平面上形成的空间频谱。
• 屏幕（screen）：最终成像的平面。
• 孔径光阑（aperture stop）：控制进入透镜的光线。

阿贝成像原理的数学描述

• 散射（diffraction）：光波遇到障碍物时偏离原来直线传播的现象。
• 傅里叶变换（Fourier transform）：描述了光波从物体到像平面的传播过程，涉及到光波的频率和相位的变化。

阿贝成像原理的物理过程

1. 入射光经物体平面散射：相同空间频率的光线散射角相等，互为平行光线，经透镜折射后在透镜焦平面上汇聚于同一点。
2. 高分辨率光线的散射角：高分辨率的光线对应更高的散射角，经透镜折射后在后焦面上形成远离中心的亮点。
3. 物镜收集有限散射角度的光线：物镜只能收集有限散射角度的光线，因此分辨率有限。

答疑

问：阿贝成像原理如何解释显微镜的分辨率限制？

答：阿贝成像原理通过散射和干涉过程解释了显微镜的分辨率限制。由于物镜只能收集有限散射角度的光线，这限制了成像的分辨率。

问：阿贝成像原理中的傅里叶变换如何影响成像过程？

答：傅里叶变换在阿贝成像原理中起着核心作用。第一次傅里叶变换将物体的三维信息转换为透镜焦平面上的频谱，第二次傅里叶变换则将这些频谱信息转换为像平面上的图像。

问：阿贝成像原理如何应用于现代显微镜技术？

答：现代显微镜技术，如共焦显微镜和高分辨率显微镜，都基于阿贝成像原理。通过优化透镜设计和使用先进的成像技术，可以提高成像的分辨率和质量，使得阿贝成像原理在现代显微镜技术中仍然具有重要意义。

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4，电子显微像的衬度：

5，衬度传递函数（CTF）：

6，相位衬度成像

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8，透射电镜的基本结构：

8，空间相干性：

9，像散和色差：

10，电子枪：

11，负染：

12，冷冻制样：

冷冻制样（Plunge Freezing）是冷冻电镜单颗粒样品制备（Single Particle Analysis, SPA）中的关键步骤，它涉及到将样品快速冷冻以保持其自然状态并减少冰晶的形成：

1. 冷冻制样的基本概念

冷冻制样是将溶液状态下的样品铺展在载网上，形成很薄的样品液层，然后将载网投入液态乙烷中进行快速冷冻。这样，样品被固定在玻璃态冰（vitreous ice）中，避免了冰晶的形成，从而不会破坏生物样品本身的结构，也不会产生电子衍射干扰数据收集。

2. 冷冻制样的关键步骤

• 选择载网：通常使用铜网，它具有三层结构，包括铜网骨架、方华膜和含有微米级小孔的碳膜。
• 亲水化处理：载网需要经过亲水化处理，以确保样品能够均匀铺展。
• 滴加样品：将3-5微升的待测试样品滴在铜网上。
• 滤纸吸去多余样品：使用滤纸吸去多余的样品，仅在铜网上留下一层非常薄的液体，这层液体的厚度略大于样品颗粒的尺寸。
• 快速冷冻：将载网快速投入到液态乙烷中，利用乙烷的高导热速率实现快速冷冻。

3. 冷冻制样的考虑因素

• 环境湿度和温度：环境温度影响生物样品的稳定性，通常使用100%的制样湿度以避免样品蒸发。
• 滤纸按压的时间和力度：这会影响样品在铜网上的厚度，需要精确控制以确保样品的均匀性。

4. 冷冻制样的设备

• 手动制样装置：需要人工操作，包括滴加样品、使用滤纸吸去多余样品等步骤。
• 自动化制样装置：如Vitrobot，具有密闭的制样室，可以控制温度和湿度，自动完成样品的减薄和冷冻过程，提供更好的重现性。

5. 冷冻制样的流程

• 设置制样室条件：调整湿度和温度，确保样品稳定。
• 设置制样参数：包括滤纸按压的时间和力度，以及等待时间。
• 安装铜网：将夹有铜网的镊子安装到装置的轴上。
• 注射样品：使用移液枪将3-5微升样品注射到铜网上。
• 自动完成后续操作：包括滤纸按压和铜网的冷冻，所有步骤按照预设程序自动完成。

答疑

• 为什么选择乙烷作为冷冻介质？ 乙烷的沸点比液氮高，可以在"液氮浴"环境中液化，提供稳定且快速的冷冻环境。乙烷的高导热速率使得样品能够迅速冷冻，形成玻璃态冰，而不是结晶冰。
• 玻璃态冰的优势是什么？ 玻璃态冰不含冰晶，不会破坏样品结构，也不会干扰电子衍射数据收集，有助于保持样品的自然状态。
• 自动化制样装置的优势是什么？ 自动化制样装置可以提供更精确的控制，减少人为误差，提高实验的重现性。

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13，其他答疑：

在冷冻电镜样品制备过程中，蛋白复合物的解离是一个常见的问题，这可能导致无法获得高质量的结构信息。针对这一问题，可以采取以下应对策略：

1. 交联（Crosslinking）

交联是一种通过化学方法增加蛋白复合物稳定性的技术。它涉及使用交联剂，这些交联剂可以形成共价键，将蛋白复合物的各个亚基连接在一起，从而减少解离的可能性。交联剂的选择和使用条件需要根据具体的蛋白复合物和实验需求来确定。

2. 使用Chameleon系统

Chameleon是一种自动化的冷冻制样设备，它能够提供精确控制的环境条件，以优化样品的制备过程。以下是Chameleon系统在应对蛋白复合物解离中的潜在优势：

• 精确控制环境条件：Chameleon可以精确控制制样室内的湿度和温度，这对于维持蛋白复合物的稳定性至关重要。
• 自动化操作：自动化的制样流程可以减少人为操作误差，提高样品制备的一致性和重复性。
• 快速冷冻：Chameleon系统能够实现快速冷冻，有助于减少样品在制备过程中的解离。
• 程序化操作：用户可以预先设置制样参数，包括滤纸按压的时间和力度，以及冷冻过程的参数，确保每次制样的条件一致。

3. 整理与答疑

• 如何选择合适的交联剂？ 选择合适的交联剂需要考虑其反应性、稳定性、对蛋白复合物的影响以及是否适合后续的冷冻电镜分析。
• Chameleon系统如何提高样品制备的效率？ Chameleon系统通过自动化和精确控制环境条件，减少了人为误差，提高了样品制备的效率和一致性。
• 除了交联和使用Chameleon，还有哪些方法可以减少蛋白复合物的解离？ 其他方法可能包括优化缓冲液条件、使用蛋白稳定剂、调整样品浓度等。

通过上述策略，可以有效地减少蛋白复合物在冷冻电镜样品制备过程中的解离，从而提高获得高质量结构信息的可能性。

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14，冷冻电镜单颗粒：

（1）样品制备：

（2）数据采集与整理：

重点关注其中的图像处理：

在冷冻电镜单颗粒分析中，图像处理是核心步骤之一，它涉及到从原始电子显微图像中提取有用信息并最终构建出生物大分子的三维结构。

1. 单颗粒重构基本流程

单颗粒重构的基本流程包括三个主要步骤：

• 数据采集：通过冷冻电镜获取样品的电子显微图像。
• 图像处理（3D重构）：对采集到的图像进行处理，以重建样品的三维结构。
• 建模与精修：构建模型并对其进行优化，以提高模型的准确性。

2. 电镜三维重构原理

三维重构的理论基础是中央截面定理和傅立叶变换。具体步骤如下：

• 通过不同方向投影的电子显微图像，获取物体的三维投影像。
• 对每幅图像进行傅立叶变换，得到一系列不同取向的截面。
• 当截面足够多时，通过傅立叶反变换得到物体的三维结构。

3. 冷冻电镜中流行的图像处理软件

目前广泛使用的图像处理软件包括：

• RELION：提供正则化的似然优化。
• cryoSPARC：提供完整的单颗粒分析流程。
• CisTEM：专注于透射电子显微镜的计算成像系统。
• EMAN2：提供全面的电子显微图像处理工具。
• FREALIGN 、SIMPLE 、SPARX 、SPIDER 、XMIPP：这些软件提供了不同的功能，如图像对齐、分类、3D重构等。

4. 图像处理流程

图像处理流程包括以下步骤：

1. 漂移校正（Motion Correction）：校正图像在采集过程中由于样品台漂移引起的偏差。
2. 衬度传递函数的修正（CTF correction）：修正电子显微图像中的相位偏移和幅度变化。
3. 颗粒挑选（Particle Picking）：自动识别并挑选出图像中的颗粒。
4. 2D分类（2D Classification）：将挑选出的颗粒图像进行分类，以去除不良图像。
5. 3D重构和优化（3D Reconstruction and Refinement）：使用分类后的图像进行3D重构，并优化模型。
6. 3D分类（3D Classification）：对重构的3D模型进行分类，以确保模型的准确性。

答疑

• 为什么需要漂移校正？ 漂移校正是为了校正在图像采集过程中由于样品台漂移引起的图像偏差，这对于后续的图像分析至关重要。
• CTF修正的重要性是什么？ CTF修正可以校正电子显微图像中的相位偏移和幅度变化，提高图像质量，从而提高三维重构的准确性。
• 如何选择合适的图像处理软件？ 选择软件时，应考虑其功能是否满足研究需求、用户界面的友好程度、社区支持和文档的完整性等因素。

通过上述步骤，研究人员可以从冷冻电镜图像中提取出高质量的三维结构信息，为生物大分子的结构研究提供重要数据。