CETSA实验避坑手册：WB高背景、熔解曲线问题及 CETSA-MS（TPP）的进阶应用

引言

接触细胞热位移分析（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）实验以来，从最初的手忙脚乱到逐渐熟练上手，其间踩过不少坑，也从 Research Gate、Biostars 论坛的前辈分享中汲取了很多经验。++这款能直接在细胞内验证药物++ ++- 靶点相互作用的技术，原理巧妙但操作细节要求极高，任何一个环节的疏忽都可能让辛苦收集的数据作废。++

今天就给大家分享一下，我在实验中遇到的常见问题、解决心得以及技术拓展的感悟，希望能给大家一些参考**++（结尾附问题快速查阅表）++。**

01 那些年踩过的坑：常见问题排查心得

1. Western Blot 的"鬼影"难题：高背景的4个解决关键

刚开始做CETSA-WB时，最让我崩溃的就是显影后膜上出现的"窗帘状"背景和黑斑，信噪比低到根本无法定量。后来反复尝试和排查，才发现问题大多出在细节上：

▶ 膜的干燥是隐形杀手：

有一次我在换液时，不小心让膜的边缘暴露在空气中几秒钟，结果那片区域就出现了明显的黑斑。

后来才知道，**++膜一旦短暂干涸，疏水性就会改变，抗体容易非特异性吸附。++**现在我操作时会格外注意，全程让膜浸泡在液体中，尤其是PVDF膜，转膜前一定会用甲醇充分活化，避免任何干涸的可能。

▶ 封闭液选对才有效：

一开始我沿用了磷酸化抗体实验常用的BSA封闭，结果背景一直很高。

后来看到论坛专家分享，**++CETSA检测总蛋白时，5%脱脂奶粉的封闭效果更好。++**我试着将封闭时间延长到1.5小时，并且确保奶粉完全溶解无颗粒，背景果然大幅降低。

▶ 抗体浓度千万别贪高：

作为新手，我曾误以为抗体浓度越高信号越强，结果导致全膜非特异性结合。

++经过多次滴定才找到合适的浓度，尤其是高灵敏度的ECL底物，二抗稀释到1:30000左右效果最佳，最高甚至用到过1:50000，既保证了信号强度，又能有效降低背景。++

▶ ECL底物处理要细致：

有几次显影时，条带发光极强但瞬间就灭了，背景还出现液流痕迹。

后来才明白是**++ECL底物积聚导致的++**，现在加完底物后，我会用吸水纸轻轻吸去膜角多余的液体，只留一层薄薄的液膜，再覆盖保鲜膜成像，这样就能避免上述问题。

2. 熔解曲线异常：平坦、鼓包该怎么破？

熔解曲线是CETSA的核心数据，我曾多次遇到曲线不符合预期的情况，总结下来主要有这几种情况：

▶ 曲线平坦无下降：

第一次做实验时，无论温度怎么升高，蛋白信号都没明显下降，当时以为是抗体失效了。

后来排查才发现，**++目标蛋白的热稳定性极强，Tm值超过80℃，常规的67℃最高温根本不足以让它聚集。++**我将最高温提升到90℃后，曲线就呈现出了正常的S型。

还有一次是**++因为抗体识别线性表位，离心不彻底导致沉淀复溶++**，后来我把离心力提高到20000×g，离心20分钟，吸取上清时格外小心不触及沉淀，问题就解决了。

▶ 曲线下降过于平缓：

++这种情况大多是裂解液的问题。++ 我曾用过含高浓度SDS的裂解液，结果热聚集的蛋白又被重新溶解，曲线自然平缓。后来换成0.6%的NP-40温和裂解液，就再也没出现过这种情况，++大家尽量避免使用强去污剂。++

▶ 40-50℃区间的"鼓包"：

有段时间实验中总是出现信号先上升后下降的情况，37℃时信号反而较低。

查了论坛才知道，这是因为37℃时抗原表位被遮蔽，适度加热后表位暴露，抗体结合力增强。++后来我调整了数据处理方式，以"鼓包"的最高点作为100%归一化，数据就变得合理了。++

3. 负向热位移：曾让我慌了神的"意外发现"

第一次遇到加药组Tm值比对照组低（ΔTm<0）时，我以为实验失败了，差点把数据丢掉。后来在论坛上看到很多人都讨论过这个问题，才明白自己犯了一个常识性错误。

++负向热位移不仅不是失败，反而可能是特定结合模式的有力证据。++

比如有些配体对蛋白去折叠态的亲和力高于天然态，会拉动平衡向去折叠方向移动，从而降低Tm值；还有些药物会破坏蛋白的多聚体结构，让它更容易热变性。我后来重复了实验，确认这种负向位移具有剂量依赖性，查阅相关文献后发现，这与我研究的药物作用机制完全契合。所以现在再遇到这种情况，我会格外留意，而不是盲目判定实验失败。

02 从基础到进阶：我的CETSA技术拓展之路

随着课题的深入，传统的CETSA-WB已经满足不了需求，比如需要筛选大量化合物或者寻找未知靶点时，我就开始尝试质谱联用的技术，过程中也有不少新感悟。

CETSA-MS/TPP：无偏倚靶点发现的利器

在寻找药物未知靶点时，CETSA-MS（TPP）技术给了我很大的惊喜。

它的流程也不复杂，样品加热离心后取上清，酶解成肽段，用TMT同位素标签标记后进行LC-MS/MS分析，我之前也整理过实验指南：《TPP热蛋白组分析：从操作到分析零门槛的实操指南-CSDN博客》，感兴趣的小伙伴可以自行阅读。

++一次实验就能测定细胞内数千个蛋白的熔解曲线，不仅能找到直接靶点，还能发现下游相关蛋白的变化，从而揭示药物的作用机制。数据分析比较复杂，需要和生物信息学团队合作，但得到的结果非常有价值，能让我们更全面地了解药物的作用网络。++

03 自用实用表格分享：实验效率提升小帮手

在长期实验中，我整理了两个实用表格，平时遇到问题或选择技术方法时，翻一翻就能快速找到答案，分享给大家：

表 1：CETSA 常见检测方法对比（自用整理版）

注意事项	依赖抗体质量操作要细致	样品制备和数据处理需严格质控

表 2：常见问题快速查阅表（结合自身经验补充）

复孔差异大	加热不均、边缘效应	使用高质量 PCR 板，提前检查 PCR 仪孔位温度均一性，操作时保持条件一致

结语

做 CETSA 实验的这些年，从最初用 CETSA-WB 摸索基础操作，到后来借助 CETSA-MS（TPP）突破研究瓶颈，我真切感受到不同技术范式带来的科研视野升级。

最初选择 CETSA-WB，正是看中它操作简单、无需特殊设备的优势，帮我解决了课题初期 "靶点是否有效"的核心疑问。但随着研究深入，它的局限也逐渐显现：++通量低，一次只能验证++ ++1-10 个化合物；依赖抗体质量，遇到难制备抗体的蛋白就束手无策；更无法触及未知靶点，难以揭示药物背后复杂的作用网络。++

而 CETSA-MS（TPP）的出现，恰好弥补了这些短板。++它无需依赖抗体，一次实验就能测定细胞内数千个蛋白的熔解曲线，不仅能无偏倚地发现药物的直接靶点，还能捕捉到下游相关蛋白的稳定性变化，甚至揭示脱靶效应++，让我对药物作用机制的理解从 "单点验证" 升级到 "全景解析"。

当然，两者并非替代关系：CETSA-WB 适合快速验证、初期筛选，是科研路上的 "高效探针"；CETSA-MS（TPP）适合深度挖掘、机制探索，是破解复杂问题的 "精密地图"。

这段经历也让我明白，科研技术没有绝对的优劣，只有是否适配当下的研究需求，希望我的这些实战笔记能给大家一些启发~

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▶ **全面直接筛选真实药靶组合：**蛋白质组水平筛选药物结合的蛋白靶点，全面覆盖治疗靶点与脱靶靶点；使用药物分子本体进行试验，无需设计合成分子探针，药靶结合更真实

▶ **多种数据分析策略：**结合蛋白热变性曲线分析和非参数分析方法（NPARC），全面捕获潜在药物靶点

▶ **多种生信分析数据库挖掘辅助筛选：**对潜在药物靶点进行生信分析与数据库挖掘，辅助最终药物靶点的确认

▶ **多种衍生技术可选：**除常规温度范围（TPP-TR）、药物浓度范围（TPP-CCR）、两者结合（2D-TPP）的常规热蛋白组分析方法外，还可进行单温度点（ITSA）、多温度点混合（PISA）等高通量热蛋白组分析方法

参考资料

Tu Y, Tan L, Tao H, Li Y, Liu H. CETSA and thermal proteome profiling strategies for target identification and drug discovery of natural products. Phytomedicine. 2023;116:154862. doi:10.1016/j.phymed.2023.154862
Kalxdorf M, Günthner I, Becher I, et al. Cell surface thermal proteome profiling tracks perturbations and drug targets on the plasma membrane. Nat Methods. 2021;18(1):84-91. doi:10.1038/s41592-020-01022-1
Zhang L, Wang Y, Zheng C, et al. Cellular thermal shift assay: an approach to identify and assess protein target engagement. Expert Rev Proteomics. 2024;21(9-10):387-400. doi:10.1080/14789450.2024.2406785