在细胞内，RNA与蛋白质形成复杂的RNA-蛋白复合物（ribonucleoprotein complexes, RNPs），共同参与基因表达调控。例如，mRNA结合蛋白可以影响转录本稳定性和翻译效率；非编码RNA（lncRNA、circRNA、miRNA等）通过结合特定蛋白参与表观遗传调控、信号转导以及疾病发生发展。因此，解析"哪些RNA与特定蛋白结合"成为理解RNA功能的重要切入点。
传统RNA免疫共沉淀（RNA Immunoprecipitation，RIP）技术能够验证某个蛋白是否结合特定RNA，但检测范围有限。而结合高通量测序技术后形成的RIP-seq（RNA Immunoprecipitation sequencing），能够在全转录组水平系统鉴定目标蛋白结合的RNA谱，为研究RNA-蛋白互作网络提供了强大的技术平台。
01 RIP-seq技术原理
在细胞中，RNA结合蛋白（RBP）会与目标RNA形成复合物，通过抗体特异性识别目标蛋白，将蛋白-RNA复合物从细胞裂解液中免疫沉淀下来，随后提取与该蛋白结合的RNA，经过富集和纯化后进行测序分析。实验流程如下：
**1、细胞裂解：**收集细胞，用含RNase抑制剂的裂解液破膜，释放RNA-蛋白质复合物。
**2、抗体孵育：**加入目标蛋白的特异性抗体进行孵育，让抗体和蛋白充分结合。
**3、磁珠免疫沉淀：**加入Protein A/G磁珠，继续孵育，形成"磁珠-抗体-蛋白-RNA"复合物。
**4、洗涤：**用洗涤液洗3-5次，去除非特异性结合的蛋白和RNA。
**5、RNA分离与检测：**使用蛋白酶K等试剂消化蛋白质成分，使RNA从复合物中释放并进行RNA纯化。
**6、文库构建与测序：**将提取的RNA逆转录成cDNA后进行文库构建，最后进行高通量测序。
RIP-seq技术原理（Trotman J et al., 2026）
02 RIP-seq适用范围
**1. 全转录组范围筛选RNA结合靶标：**RIP-seq通过高通量测序可以一次性鉴定某个RNA结合蛋白结合的全部RNA分子，包括非编码RNA（如lncRNA、miRNA等）与蛋白质的互作。
**2. 研究特定RBP的调控网络：**通过后续生物信息学分析可以系统地鉴定该RBP在细胞或组织中的结合RNA谱，从而揭示其在转录后调控中的具体作用机制。
**3. 研究RNA修饰：**结合特定的抗体（如针对m6A修饰的抗体），可以富集并鉴定出带有特定修饰的RNA分子，从而揭示这些修饰在RNA功能调控中的作用。
03 研究案例
案例1
静息状态和炎症状态下RRP1与RNA之间的结合变化（Zhou et al., 2025）
**题目：**The RNA-binding protein
RRP1 brakes macrophage one-carbon metabolism to suppress autoinflammation
**期刊：**Nature Communications
**影响因子：**18.1
研究者利用IL-1β刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞建立炎症状态，并比较静息状态和炎症状态下RRP1与RNA之间的结合变化。研究者进一步进行RIP-seq，系统鉴定RRP1-associated RNAs，发现炎症刺激后，RRP1与大量RNA的结合数量以及结合强度均发生增加。进一步的KEGG分析发现，IL-1β刺激后RRP1结合增强的RNA明显富集于代谢相关通路，特别是一碳代谢相关过程。研究者进一步将RIP-seq结果与功能实验结合，发现Tyms（thymidylate synthase，胸苷酸合成酶）mRNA是RRP1的重要靶RNA。RRP1能够结合Tyms转录本，并在转录后水平降低TYMS表达，抑制巨噬细胞的一碳代谢，从而限制炎症反应。
案例2
TOP1与RNA广泛结合（Bhola M et al., 2025）
**题目：**RNA interacts with topoisomerase I to adjust DNA topology
**期刊：**Molecular Cell
**影响因子：**16
过去人们主要认为TOP1的功能是结合DNA并解除转录过程中产生的DNA拓扑压力。美国Northwestern University等单位研究人员提出了一个新的问题：TOP1是否也能够与RNA结合？如果TOP1能够结合RNA，这种RNA结合是否具有功能？研究人员通过RIP-seq发现TOP1能够与大量RNA发生关联，而且其中绝大多数是mRNA，这一结果说明TOP1不仅仅是DNA拓扑异构酶，同时也可以作为RNA结合蛋白发挥作用。后续进一步研究中作者发现，TOP1结合的RNA并不是单纯的"运输载体"，RNA能够抑制TOP1对DNA超螺旋的松弛作用。
案例3
RBM25通过抑制Rab22a蛋白表达以限制病毒进入（Ding Y et al., 2025）
**题目：**RNA-Binding Protein RBM25 Targets the mRNA Stability of GTPase Rab22a to Restrict Viral Entry and Infection
**期刊：**Advanced Science
**影响因子：**14.1
研究以病毒感染相关细胞模型为基础，对RBM25进行RIP-seq，从全转录组范围寻找RBM25-associated RNAs。RIP-seq发现RBM25结合的RNA与内吞作用、溶酶体、吞噬体、病毒感染等过程密切相关，进一步分析发现RBM25结合RNA中存在相对保守的RNA motif。作者筛选发现RBM25能够结合Rab22a mRNA并影响其稳定性，Rab22a可以参与细胞膜运输和内吞相关过程，而这些过程与病毒进入细胞密切相关。
案例4
pS417-AGO2促进高丰度致癌miRNA在NSCLC中与AGO2结合（Zhao X et al., 2024）
**题目：**Phosphorylation of AGO2 by TBK1 Promotes the Formation of Oncogenic miRISC in NSCLC
**期刊：**Advanced Science
**影响因子：**14.1
研究发现，TBK1作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，可直接磷酸化AGO2蛋白第417位丝氨酸（S417），作者利用AGO2抗体进行RIP-seq，比较野生型（WT）与突变型（S417A）所结合的miRNA差异。RIP-seq结果显示，AGO2 S417磷酸化能够显著增强AGO2与多种高丰度致癌性miRNA（如miR-21等）的结合能力，促进功能性miRISC形成。结合miRNA-seq分析，研究进一步解析了pS417-AGO2调控的miRNA网络及其下游靶基因变化，证明TBK1-AGO2磷酸化轴通过增强致癌miRNA介导的基因沉默促进NSCLC进展。
参考文献
Trotman J, Li S, Eberhard Q et al. Protocol for evaluating RNA-protein associations in mammalian cells with RIP-seq and RIP-qPCR. STAR Protocols, 2026; 7
Zhou, Y., Li, M., Jin, K. et al. The RNA-binding protein RRP1 brakes macrophage one-carbon metabolism to suppress autoinflammation. Nat Commun 16, 6880 (2025).
Bhola M, Abe K, Orozco P et al. RNA interacts with topoisomerase I to adjust DNA topology. Molecular Cell, 2024; 84, 3192-3208.e11.
Ding Y, Chen H, Jiang Y, Zhao C, Bai J, Xiang Y, Wang Z, Wang X, Rui B, Tang W, Ding Y, Zhan Z, Zhang Y, Liu X. RNA-Binding Protein RBM25 Targets the mRNA Stability of GTPase Rab22a to Restrict Viral Entry and Infection. Adv Sci (Weinh). 2026 Jun 16:e76160.
Zhao X, Cao Y, Lu R, Zhou Z, Huang C, Li L, Huang J, Chen R, Wang Y, Huang J, Cheng J, Zheng J, Fu Y, Yu J. Phosphorylation of AGO2 by TBK1 Promotes the Formation of Oncogenic miRISC in NSCLC. Adv Sci (Weinh). 2024 Apr;11(15):e2305541.