Amber 分子动力学模拟17: MMGBSA与MMPBSA及注意事项

**摘要：**本文系统梳理 MMGBSA/MMPBSA 端点法结合自由能计算的完整实操流程。内容涵盖热力学循环原理、GB 模型（igb）选择、MD 模拟时长与收敛性判断，并以雷洛昔芬-雌激素受体为例给出单配体计算全流程（tleap、MD、cpptraj、MMPBSA.py），同时介绍多配体体系的两种计算策略与协同效应评估方法，最后逐项解读输出能量项并提供关键参数速查表。

关键字

MMGBSA、MMPBSA、结合自由能、MMPBSA.py、Amber、igb、独立模拟、Hou 课题组、能量分解、收敛性验证

你在跑完蛋白-配体 MD 之后需要评估结合强弱，却不确定 MMGBSA/MMPBSA 该选哪个 igb、模拟至少跑多少 ns、结果怎么判断收敛------本文给你一套从热力学循环原理、GB 模型（igb）选择、时长与收敛性判断，到单配体（雷洛昔芬-雌激素受体）与多配体体系的完整实操流程，包含 tleap、MD、cpptraj、MMPBSA.py 的逐条命令和 mmpbsa.in 输入文件模板；并整理了浙江大学 Hou（侯廷军）课题组十年系列 benchmark 的实战精华（εin 选择、采样时长、熵处理的一页决策卡），你可以直接拿这些结论去组织自己的计算，按输出能量项逐项解读 ΔG_bind，并用整体/逐配体两种策略评估多配体协同效应。

教程	链接	与本文关系
AMBER 官方教程总目录	Amber Tutorials	本文流程的背景出处，可按体系类型检索对应入门/高级教程
AMBER Tutorial 3（MM-PBSA）	MM-PBSA	本文单配体案例（Raloxifene-雌激素受体）所参照的官方教程体系

文献	DOI	为什么值得先读
Wang, E. et al. End-Point Binding Free Energy Calculation with MM/PBSA and MM/GBSA. Chem. Rev. 2019（Hou 组）	10.1021/acs.chemrev.9b00055	十年系列 benchmark 的集大成综述，本文"〇之二"精华节的完整出处
Hou, T. et al. Assessing ... I. The accuracy of binding free energy calculations. JCIM 2011	10.1021/ci100275a	εin 敏感性 + MD 时长 + 熵波动的开山篇
Miller III, B. R. et al. MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations. JCTC 2012	10.1021/ct300418h	本文主力工具 MMPBSA.py 的方法论文，理解输入参数背后的实现
Genheden, S. & Ryde, U. The MM/PBSA and MM/GBSA methods to estimate ligand-binding affinities. Expert Opin. Drug Discov. 2015	10.1517/17460441.2015.1032936	系统综述方法精度与局限，本文"模拟时长与收敛性"一节的文献依据
Tian, C. et al. ff19SB: Amino-Acid-Specific Protein Backbone Parameters. JCTC 2019	10.1021/acs.jctc.9b00591	本文推荐蛋白力场 ff19SB 的原始出处，参数选择的理论基础

一、MMGBSA / MMPBSA 原理

1. 基本思想与热力学循环

MM-PBSA 和 MM-GBSA 都基于同一个热力学循环，用于估算受体-配体结合自由能：

结合自由能的基本公式：

ΔG_bind = G_complex − (G_receptor + G_ligand)

每个状态的吉布斯自由能近似表示为：

即 G = E_MM + G_solvation − TS，其中：

能量项	说明	计算方法
E_MM	分子力学能量（气相）	键能、角能、二面角能 + 静电能 + 范德华能
G_solvation	溶剂化自由能	极性贡献 + 非极性贡献
−TS	构象熵（可选）	简正模式分析（nmode）

溶剂化自由能进一步分解：G_solvation = G_polar + G_non-polar

极性贡献 G_polar：PB 方法数值求解 Poisson-Boltzmann 方程；GB 方法用 Generalized Born 解析近似（更快）
非极性贡献 G_non-polar = γ × SASA + b：SASA 为溶剂可及表面积，γ 和 b 为经验常数

实践中熵项（TΔS）计算昂贵且噪声大，很多研究仅报告无熵项的结合自由能（enthalpic component），用于相对排序。

2. MM-PBSA vs MM-GBSA 对比

特性	MM-PBSA	MM-GBSA
极性溶剂化能	数值求解 PB 方程	GB 模型解析近似
非极性溶剂化能	γ·SASA + b	同上
计算速度	较慢	快 10-100 倍
精度	通常更高	略低但可接受
推荐用途	绝对结合自由能	相对结合自由能排序

推荐的 GB 模型参数（最新研究）：

igb = 8（GBn2 模型）
mbondi3 原子半径集
γ = 0.0072 kcal·Å⁻²·mol⁻¹，b = 0

3. GB 模型选择：igb 参数详解

igb 参数用于选择广义玻恩（GB）溶剂化模型，不同取值对应不同模型实现和参数集：

igb	模型	说明
`igb = 1`	GB-HCT（Hawkins, Cramer, Truhlar）	较早的模型，基于 Bondi 原子半径
`igb = 2`	GB-OBC I（Onufriev, Bashford, Case）	对 GB-HCT 的改进，不同原子半径和内部介电常数
`igb = 5`	GB-OBC II（OBC 第二组 α/β/γ = 1.0/0.8/4.85）	与 OBC I 同族的第二组参数，与 PB 一致性更好
`igb = 7`	GBn（颈区修正模型，Mongan et al.）	与分子表面 PB 及显式溶剂结果一致性明显更好；按蛋白参数化，不推荐用于核酸
`igb = 8`	GBn2（GBn 改进版）	进一步提升与 PB/显式溶剂的一致性，当前推荐

推荐选择：

igb = 7（GBn） 和 igb = 8（GBn2） 是较新一代模型，通常比 igb=1/2 更准确
半径集必须与 igb 配对（tleap 里 set default PBRadii 设置）：mbondi→igb=1、mbondi2→igb=2/5、bondi→igb=7、mbondi3→igb=8
对蛋白-配体体系 GBn/GBn2 通常都表现良好；选择取决于与哪个研究/协议保持一致
追求最新标准时用 igb = 8 + mbondi3

4. 精度预期

MM-GBSA：相关系数 R² ≈ 0.5--0.7（相对排序），误差 ±2--4 kcal/mol
MM-PBSA：精度略高，但计算成本增加 10--100 倍

对于绝对结合自由能，建议结合实验数据校准；MM-PB(GB)SA 最适合同类配体的相对排序，而非绝对值预测。

二、Hou 课题组十年系列 benchmark：MMGBSA 实战精华

浙江大学侯廷军课题组 2010--2019 年发表了十篇系列 benchmark（Assessing the performance of the MM/PBSA and MM/GBSA methods I--X ），加上 2019 年 Chemical Reviews 总结篇，是 MMGBSA/MMPBSA 实战参数选择的最系统证据库。以下精华全部来自各篇 abstract 和开放全文。

1. 系列全景

篇	年份	期刊	主题	关键 benchmark 规模
I	2010	JCIM	MD 时长 + 溶质介电常数 + 熵	6 蛋白 × 59 配体，MD 400--4800 ps
II	2010	JCC	对接 pose 重打分	98 复合物 × 101 decoys
III	2013	JPCB	力场与配体电荷模型影响	多力场对比
IV	2014	PCCP	基于 PDBbind 的大规模评测	>1800 晶体结构
V	2014	PCCP	高介电常数重打分虚拟筛选	3 个酪氨酸激酶（ABL/ALK/BRAF）
VI	2016	PCCP	蛋白-蛋白结合能预测	46 个蛋白-蛋白复合物
VII	2018	PCCP	熵效应（nmode vs 相互作用熵）	>1500 体系 × 6 力场
VIII	2018	RNA	蛋白-RNA 体系	蛋白-RNA 对接重打分
IX	2019	PCCP	蛋白-肽体系	蛋白-肽对接评估
X	2019	PCCP	增强采样 + 变介电模型（PPI）	蛋白-蛋白识别
综述	2019	Chem Rev	方法学总结	---
VAD	2021	JCIM	变原子介电常数 MM/GBSA（机器学习优化）	多体系

2. 内介电常数 εin：最被低估的参数

I（2010） ：预测对溶质介电常数高度敏感 （测了 εin = 1/2/4），必须按结合界面特征选择------高电荷口袋（如神经氨酸酶，9 个带电残基）用 εin = 4 最好
II（2010） ：最佳模型是 GB-OBC I（igb=2）+ εin = 2 ，单构象打分即达 62.2% 姿势识别成功率；考虑 top-3/top-5 时升到 84.7%/88.8%
V（2014） ：对接 pose 重打分时，较高介电（ε = 2 或 4）下 MM/PBSA 与 MM/GBSA 准确度相当，且能显著提升 AutoDock 的筛选力和排序力；基于最佳 pose + top-N pose 的策略都值得用

实战含义：默认 εin=1 对带电口袋系统性偏差；对电荷密集型结合界面（蛋白酶/激酶 ATP 口袋）优先试 εin=2 或 4。注意 MMPBSA.py 中 εin 由 &pb indi= 控制（默认 1.0），GB 无直接对应项。

3. MD 采样：不是越长越好

MD 采样对精度的影响排序靠后 ------>4 ns 无增益（Genheden & Ryde 明确引用 Hou I）；更有效的策略是多条短独立模拟；快照间隔 1--10 ps 已统计独立；MM/GBSA 甚至可从最小化结构起步（IV：r=0.579 vs 1ns 0.564）
I（2010）核心结论 ：MD 时长对预测有明显影响，但更长模拟不一定更好 ；构象熵在轨迹中波动很大，需要大量快照才能稳定
II（2010） ：短 MD 模拟即可帮助 MM/GBSA 识别实验结合构象；仅用单一能量最小化结构打分不足以正确预测结合 pose------MD 采样通过构象平均提升准确率
IV（2014） ：>1800 结构的大规模评测给出 MM/GBSA 总体 Pearson r ≈ 0.579 （优于 MM/PBSA 的 0.491）；但蛋白家族分布不均会虚高总体精度------同族采样有偏时（one-family/one-ligand），εin=4 下 MM/GBSA 与 MM/PBSA 准确度相当（r ≈ 0.40--0.41）；所以报告精度时必须做 family balance

4. 熵：什么时候值得算

VII（2018） ：>1500 体系系统评测------基于最小化结构 时，加入截断 nmode 熵（enthalpynmode_min_9Å）反而降低 整体准确度；但基于 MD 轨迹时加入熵可以改进结合自由能预测；相互作用熵（interaction entropy）是高效替代方案
实战含义：单点/短模拟的 SAR 排序直接用焓（ΔH，即不含熵的 ΔG）即可；只有长轨迹 + 仔细收敛检查后才值得加熵项；quasi-harmonic/nmode 的帧数要给足

5. 体系类型适配

VI（2016）+ X（2019）：蛋白-蛋白界面大而平，普通 MM/GBSA 打分能力有限；增强采样 + 变介电模型能改善 PPI 预测
VIII（2018）：蛋白-RNA 体系需专门评估，默认设置不可直接外推
IX（2019）：蛋白-肽体系，MM/GBSA 重打分可识别近天然 pose，介电常数与溶剂模型选择同样关键
VAD（2021） ：机器学习给每个蛋白/配体原子分配可变介电常数（VAD-MM/GBSA），精度显著提升，超过 Schrödinger Prime MM-GBSA，且几乎零额外计算成本------代表端点方法 + ML 的融合方向

6. 一页决策卡（从系列提炼）

你的场景	推荐做法	依据
对接 pose 重打分	igb=2 + εin=2，短 MD + top-3 pose 一起看	II
激酶等带电口袋 SAR	试 εin=2/4，报告 family-balanced 精度	I / IV / V
单点快速排序	直接用焓（不算熵），最小化结构即可起步	VII
精细 ΔG 预测	多条独立短轨迹 + 收敛验证 + 熵（interaction entropy 优先）	VII / Genheden 2010
蛋白-蛋白 / 蛋白-肽	需增强采样或变介电；默认 MM/GBSA 慎用	VI / IX / X
追求最高精度端点法	关注 VAD-MM/GBSA（ML 变介电）	VAD

三、模拟时长：多少 ns 才够？

关于 MMGBSA/MMPBSA 需要多长的 MD，网上流传"越长越好、50 ns 起步"的说法。但把 Hou 课题组系列和 Genheden & Ryde 的系统评测原文摆出来，结论几乎是反的：端点方法对轨迹长度远没有想象中敏感，误差大头在 εin、力场和熵这些系统项。

1. 五条硬证据

证据	结论	出处
Hou I：6 蛋白 × 59 配体，MD 0.2--6.0 ns 共 10 档对比	更长不一定更好------α-凝血酶、亲和素、神经氨酸酶、青霉蛋白酶 4 个体系 4.8 ns 的预测明显差于 400 ps；同轨迹 100 帧与 600 帧结果相当	Hou 2011（本篇"二"的 I）
Hou IV：PDBbind >1800 结构	MM/GBSA 最小化结构 r=0.579 甚至略优于 1 ns 轨迹（r=0.564）；MM/PBSA 则相反，需要 MD（0.412 → 0.491）	Sun 2014（IV）
Hou IX：53 个蛋白-肽复合物	中等肽（20--25 残基）基于 1 ns MD 最优（r=0.735）；短肽（5--12 残基）最小化结构即最优（r=0.748）	Weng 2019（IX）
Genheden & Ryde 2015 综述	明确引用 Hou："超过 4 ns 的模拟没有增益 "；"多条短独立模拟优于一条长模拟 "（单条长轨迹会低估不确定度）；"快照间隔 1--10 ps 即统计独立"	Genheden & Ryde 2015
Genheden & Ryde 2010 方法学专文	要达到可控统计精度，靠的是大量独立模拟，而不是把一条轨迹拉长	J. Comput. Chem. 2010, 31, 837--846

⚠️ 引用纠偏 ：本博合并初稿曾写"Genheden & Ryde (2015) 指出 <50 ns 相关性差（R²<0.3）、>100 ns 可达 R²>0.6"------该说法在原文中不存在，实际结论恰好相反（无增益 >4 ns；最小化结构常常与 MD 相当）。凡引用必回原文核对，这是本节保留这条更正的原因。

2. 实操建议（按证据重排）

场景	建议
蛋白-小分子 SAR 排序	1--5 ns 单轨迹 + 100--200 帧（间隔 1--10 ps）通常足够；MM/GBSA 甚至可用最小化结构快速起步
MM/PBSA	需要 MD 采样（IV：最小化 0.412 → 1 ns 0.491）
蛋白-肽（20+ 残基）	~1 ns 起步（IX 实测最优）
柔性口袋 / 变构位点 / PPI	单纯拉长轨迹帮助有限------优先增强采样（GaMD/REMD，见本系列 18 篇）或变介电模型（Hou VI/X）
不确定度估计	用多条独立短模拟（做法见下节）之间的散布，而非单条长轨迹的块平均

2bis、"独立模拟"到底是什么、怎么跑

"多条独立短模拟"（many short independent simulations）不是把一条长轨迹切段（切出的段共享驰豫历史，不独立），也不仅是"prod 用不同种子重跑几遍"。独立的核心是初始条件不同，让每条轨迹从相空间的不同区域出发。三个层次：

层次	做法	独立性	成本
① 换种子	同一 equil.rst 起点，跑 N 次 prod，每次 `ig=-1`	弱------起始构象相同，Langevin 随机力几 ps 后让轨迹分叉，但仍困在同一个盆地、同一段驰豫历史	最省
② 换起点（推荐）	先跑一条 1--2 ns 预轨迹，每隔 ≥1 ns 抽一个快照当新起点，各自短平衡（50--100 ps）后跑 0.5--1 ns prod	中------初始构象也分散开	中
③ 完全重建	从 solvate/min/heat 开始独立建 N 套（不同溶剂排列）	强------连水的初始排布都不同	最高

日常 SAR 用 ① 或 ② 即可；论文里报误差，② 是 Genheden 风格的标准做法。

Amber 实操（层次 ②）：

复制代码

# 1. 预轨迹（可直接用已有的 prod.nc 代替）
# 2. cpptraj 抽 3 个相距远的快照
cpptraj complex.prmtop << EOF
trajin prod.nc 100 100        # 帧 100
trajout start1.rst restart
EOF
# 同样抽帧 600、1100 → start2.rst / start3.rst
3. 每个起点短平衡 + 短 prod
pmemd.cuda -O -i equil_short.in -o e1.out -c start1.rst -r e1.rst ...
pmemd.cuda -O -i prod.in -o p1.out -c e1.rst -r p1.rst -x p1.nc ...
start2/start3 同理 → p2.nc, p3.nc

四个要点：

从快照重启用 irest=0, ntx=1（快照 rst 只含坐标）；从上一模拟的 rst 续跑才是 irest=1, ntx=5
prod.in 里 ig=-1 必须保留------这是每条轨迹随机力不同的来源
每条 prod 不必长：0.5--1 ns、抽帧间隔 ≥10 ps 即可（快照 1--10 ps 已统计独立）
层次 ① 的隐性坑：若起点刚从强约束平衡出来（restraint 未放干净），N 条轨迹前 100--200 ps 几乎一样，等于伪复制------起点前先过一段无约束平衡，或直接用层次 ② 的间隔抽帧

误差怎么算 ：每条轨迹单独过一遍 MMPBSA.py，得到 N 个 ΔG（各带自己的 SEM）------不确定度 = N 个轨迹平均值的 SD（轨迹间散布），并与合并所有帧的结果一起报告。轨迹间散布反映"换个起点结论会不会变"，比单轨迹块平均（只反映盆地内部涨落）诚实得多。

两个"独立"别混淆 ：本节的 independent runs 是轨迹之间不交换、不通信 （各自随机历史）；REMD 的 replica 恰恰相反------副本间定期交换温度，是有意打破独立来加速遍历。两者是不同的采样策略。

3. 为什么"越长越好"是错觉

单轨迹拉长只是反复采样同一个能量盆地，帧间高度自相关------Genheden & Ryde 实测 1--10 ps 之后快照已统计独立，再多帧只加噪声不加信息
若配体结合模式不稳，更长的轨迹反而给它更多时间漂离晶体 pose（Hou I 中 4 个体系 4.8 ns 差于 400 ps 的机制）
端点方法的主要误差来源排序：内介电常数 εin > 力场/电荷模型 > 熵处理 > 轨迹长度（I、III、IV、VII 的共同结论）

4. 收敛性验证（保留，但判据更严格）

滑动窗口 ：按轨迹长度的 1/4--1/2 为窗口滚动计算累积平均 ΔG，进入平台（波动 <0.5 kcal/mol）算"这条轨迹内部稳定"------但它不能证明采样充分
更强证据是独立轨迹间一致性：2--4 条独立短轨迹（做法见上节 2bis）算出的 ΔG_bind 相互接近，比一条长轨迹的平台更可信
配体 RMSD：持续上升 = 采样不足或 pose 不稳；稳定在 1--2 Å 属正常
关键相互作用持久性：cpptraj 分析重要氢键占有率 >70%

四、单配体结合自由能计算完整案例

案例体系 ：Raloxifene（雷洛昔芬）结合雌激素受体。目标：计算单配体的绝对结合自由能。

4.1 拓扑文件准备（tleap）

必须生成三个独立的干燥拓扑文件 （complex / receptor / ligand），且所有拓扑使用相同的 PBRadii 设置：

复制代码

#!/bin/bash
# 使用 tleap 生成拓扑文件
cat > leap.in << EOF
# 加载力场
source leaprc.protein.ff19SB      # 最新蛋白力场
source leaprc.gaff2               # 小分子力场
source leaprc.water.opc           # OPC 水模型
设置 PB 半径（关键！所有拓扑必须使用相同设置）
set default PBRadii mbondi3
加载复合物
complex = loadpdb complex.pdb       # 包含蛋白+配体的 PDB
检查并保存干燥复合物
check complex
saveamberparm complex complex.prmtop complex.rst7
分离受体（蛋白）
receptor = loadpdb receptor.pdb
saveamberparm receptor receptor.prmtop receptor.rst7
分离配体
ligand = loadpdb ligand.pdb
saveamberparm ligand ligand.prmtop ligand.rst7
溶剂化并保存水合复合物（用于 MD）
solvateoct complex OPCBOX 12.0
addionsrand complex Na+ 55 Cl- 55   # 100 mM 离子强度
saveamberparm complex complex_wat.prmtop complex_wat.rst7
savepdb complex complex_wat.pdb
quit
EOF
tleap -f leap.in

关键注意事项：

配体需要 GAFF2 力场参数和 AM1-BCC（或 RESP）电荷（antechamber 预先生成）
所有拓扑文件必须使用相同的 set default PBRadii
如果只做隐式溶剂 MM/PBSA（不跑显式溶剂 MD），可跳过 solvate 和 addIons 步骤，直接保存气相复合物

4.2 分子动力学模拟

若尚未进行 MD，需先对复合物充分平衡和生产模拟，获得代表性构象集合（如 1000 帧）：

复制代码

# 能量最小化
pmemd.cuda -O -i min.in -o min.out -p complex_wat.prmtop -c complex_wat.rst7 -r min.rst7 -ref complex_wat.rst7
升温（NVT）
pmemd.cuda -O -i heat.in -o heat.out -p complex_wat.prmtop -c min.rst7 -r heat.rst7 -x heat.nc -ref min.rst7
平衡（NPT）
pmemd.cuda -O -i equil.in -o equil.out -p complex_wat.prmtop -c heat.rst7 -r equil.rst7 -x equil.nc
生产运行（1--5 ns 足够，见"三、模拟时长"；此处以 2 ns 为例）
pmemd.cuda -O -i prod.in -o prod.out -p complex_wat.prmtop -c equil.rst7 -r prod.rst7 -x prod.nc

生产运行参数文件 prod.in 示例：

复制代码

Production MD
 &cntrl
   imin=0, irest=1, ntx=5,          ! 重启运行
   nstlim=1000000, dt=0.002,         ! 2 ns（100万步 × 2fs）
   ntf=2, ntc=2,                     ! SHAKE 约束氢键
   temp0=300.0, ntt=3, gamma_ln=2.0, ! Langevin 温控
   ntp=1, barostat=2, pres0=1.0,     ! Monte Carlo 巴控
   iwrap=1,                          ! 包裹坐标
   ioutfm=1, ntwx=5000, ntpr=5000,   ! 每 10 ps 保存一帧
   ntwv=-1,                          ! 不保存速度
   cut=12.0, fswitch=10.0,           ! 非键截断 12 Å
   ig=-1,                            ! 随机种子
 /

4.3 轨迹处理（去除溶剂）

复制代码

# 使用 cpptraj 去除水分子和离子，提取干燥轨迹
cat > strip.in << EOF
parm complex_wat.prmtop
trajin prod.nc 1 last 50          # 每 50 帧取一个（共 1000 帧用于分析）
strip :WAT,Na+,Cl- outprefix dry  # 去除水、钠、氯
trajout dry_complex.nc netcdf
run
EOF
cpptraj -i strip.in

4.4 MMPBSA.py 计算结合自由能

创建输入文件 mmpbsa.in：

复制代码

# MM-GBSA 计算输入文件
&general
  startframe=1, endframe=1000, interval=10,  # 使用 100 帧（每 10 帧取一个）
  verbose=2, keep_files=0,
  strip_mask=:WAT:Na+:Cl-,                   # 去除溶剂
  entropy=1,                                  # quasi-harmonic 熵近似（ptraj）
/
&gb
igb=8,                                      # GBn2 模型（推荐）
saltcon=0.100,                              # 100 mM 盐浓度
surften=0.0072,                             # γ 值
molsurf=0,                                  # 使用 LCPO 计算 SASA
surfoff=0.0,                                # b = 0
/
如需使用 MM-PBSA，取消以下注释
#&pb
istrng=0.100, indi=2.0, exdi=80.0,
fillratio=4.0, scale=2.0, linit=1000,
prbrad=1.4, ipb=2, inp=2,
#/

若只做 MMGBSA 可省略 &pb；做 MMPBSA 则保留 &pb。

运行 MMPBSA.py（单轨迹协议 STP，最常用）：

复制代码

MMPBSA.py -O \
  -i mmpbsa.in \
  -cp complex.prmtop \
  -rp receptor.prmtop \
  -lp ligand.prmtop \
  -y dry_complex.nc \
  -o final_results.dat \
  -eo energies.csv \
  -do decomp.csv

参数说明：

-sp：溶剂化计算用的拓扑（通常与 -cp 相同）
-cp / -rp / -lp：复合物、受体、配体的（干燥）拓扑
-y：轨迹文件（netCDF 或 mdcrd）
-O：覆盖已有输出；-eo：每帧能量 CSV；-do：残基分解 CSV

4.5 结果解读

输出文件结构：

文件	内容
final_results.dat	平均结合自由能及组分
energies.csv	每帧的能量值
decomp.csv	残基能量分解（如启用）

结果示例：

复制代码

===============================================================================
RESULTS
===============================================================================
Differences (Complex - Receptor - Ligand):
Energy Component            Average              Std. Dev.   Std. Err. of Mean
ΔG gas                    -25.13 ± 3.21          3.21         0.32
ΔG sol (polar)            +18.45 ± 2.85          2.85         0.29
ΔG sol (nonpolar)          -3.82 ± 0.15          0.15         0.01
ΔG solvation              +14.63 ± 2.88          2.88         0.29
ΔG binding (no entropy)    -10.50 ± 2.15          2.15         0.22
-TΔS entropy               +15.20 ± 4.50          4.50         0.45
ΔG binding TOTAL          -25.70 ± 4.85          4.85         0.49

另一种常见的逐项输出格式（来自早期 MMGBSA 流程）：

复制代码

DELTA G binding = ...
  ΔE_VDW       = -XX.XX kcal/mol
  ΔE_ELE       = -YY.YY
  ΔG_GB        =  ZZ.ZZ   （极性溶剂化能）
  ΔG_SA        =  AA.AA   （非极性溶剂化能）
  ΔG_gas       = ΔE_VDW + ΔE_ELE
  ΔG_solv      = ΔG_GB + ΔG_SA
  ΔG_bind      = ΔG_gas + ΔG_solv

能量组分分析：

ΔG_gas：气相分子力学能（范德华 + 静电）
ΔG_sol,polar：极性溶剂化能（去溶剂化惩罚，通常为正值）
ΔG_sol,nonpolar：疏水效应（通常为负值）
−TΔS：构象熵损失（正值表示不利贡献）
ΔG_bind = ΔE_VDW + ΔE_ELE + ΔG_GB + ΔG_SA，负值表示有利结合

4.6 熵贡献估算（可选）

熵有两种算法，都在 mmpbsa.in 里控制（不是命令行 flag）：

（1）简正模式分析（nmode） ------在输入文件加 &nmode 段：

复制代码

&nmode
  nmstartframe=1, nmendframe=50, nminterval=1,
  maxcyc=10000, drms=0.001,
/

（2）quasi-harmonic 近似 ------&general 段设 entropy=1（由 ptraj 计算）。

nmode 计算极耗时，通常仅对少量帧（如前 50 帧）进行；nmstartframe/nmendframe/nminterval 会从 &general 已选帧中再取子集。

4.7 高级技巧与常见问题

（1）显式水分子处理（MnM-W-MMGBSA）：对蛋白-蛋白相互作用，保留结合界面附近的显式水分子可提高精度：

复制代码

# 使用 cpptraj 保留最近的 30 个水分子
closestwaters 30 :1-100 closestout waters.dat name WAT_CL prefix WAT

（2）能量分解分析 ：在 mmpbsa.in 中添加：

复制代码

&decomp
  idecomp=2, dec_verbose=3,
  print_res="within 4"  # 打印配体 4 Å 内的残基贡献
/

（3）多轨迹协议（MTP）vs 单轨迹协议（STP）：

协议	描述	适用场景
STP	仅从复合物轨迹提取 R 和 L	快速计算，配体结合紧密
MTP	分别模拟 Complex、Receptor、Ligand	高柔性配体或显著构象变化

（4）常见错误与解决方案：

错误	原因	解决方案
原子数不匹配	拓扑与轨迹原子数不一致	检查 `strip_mask` 设置
配体参数错误	键连关系或电荷问题	使用 `antechamber` 重新生成
半径不一致	不同拓扑使用不同 PBRadii	确保所有 leap 输入设置相同 `set default PBRadii`

五、多配体体系 MMGBSA/MMPBSA 计算

多配体体系（蛋白-多个小分子复合物）的计算流程与单配体类似，但 tleap 建体系、轨迹分组提取和计算策略有特殊处理。

5.1 配体参数化（每个配体单独处理）

复制代码

# 配体1参数化
antechamber -i ligand1.sdf -fi sdf -o ligand1.mol2 -fo mol2 -c bcc -s 2 -nc 0
parmchk2 -i ligand1.mol2 -f mol2 -o ligand1.frcmod -s gaff2
配体2参数化
antechamber -i ligand2.sdf -fi sdf -o ligand2.mol2 -fo mol2 -c bcc -s 2 -nc 0
parmchk2 -i ligand2.mol2 -f mol2 -o ligand2.frcmod -s gaff2

也可用 prep 格式（两种格式选其一即可）：

复制代码

antechamber -i ligand1.mol2 -fi mol2 -o ligand1.prep -fo prepi -c bcc -s 2
parmchk2 -i ligand1.prep -f prepi -o ligand1.frcmod

关键注意事项：

每个配体必须有唯一的残基名（如 L1, L2, L3...而非统一的 LIG）
检查配体间距离，避免 tleap 中初始结构冲突
对于共晶结构，确保配体位置合理
所有配体使用相同 GAFF 版本（推荐 GAFF2 + AM1-BCC 电荷）

5.2 多配体 tleap 建体系

方式 A：mol2 格式（与 §4.1 配套）

复制代码

#!/bin/bash
# multi_ligand_tleap.sh
cat > tleap.in << EOF
# 加载力场
source leaprc.protein.ff19SB
source leaprc.gaff2
source leaprc.water.tip3p
加载配体参数文件
loadAmberParams ligand1.frcmod
loadAmberParams ligand2.frcmod
加载配体结构
lig1 = loadMol2 ligand1.mol2
lig2 = loadMol2 ligand2.mol2
加载蛋白
protein = loadPDB protein.pdb
创建复合物（将所有配体与蛋白结合）
complex = combine {protein lig1 lig2}  # 多配体组合，顺序重要（确保原子编号连续）
添加溶剂盒
solvateBox complex TIP3PBOX 12.0
添加抗衡离子
addIonsRand complex Na+ 0  # 或指定具体数量中和电荷
保存拓扑文件
saveAmberParm complex complex.prmtop complex.inpcrd
savePdb complex complex.pdb
保存各组分（用于后续 MMPBSA 计算）
saveAmberParm protein protein.prmtop protein.inpcrd
saveAmberParm lig1 lig1.prmtop lig1.inpcrd
saveAmberParm lig2 lig2.prmtop lig2.inpcrd
quit
EOF
tleap -f tleap.in

方式 B：prep 格式

复制代码

source leaprc.protein.ff14SB    # 蛋白力场
source leaprc.gaff2             # 配体力场（GAFF2）
加载配体
LIG1 = loadPrep ligand1.prep
loadAmberParams ligand1.frcmod
LIG2 = loadPrep ligand2.prep
loadAmberParams ligand2.frcmod
加载蛋白
PROT = loadPdb protein.pdb
构建复合物（顺序很重要，确保原子编号连续）
COMPLEX = combine {PROT LIG1 LIG2}
溶剂化（可选，若做显式溶剂 MD）
solvateBox COMPLEX TIP3PBOX 12.0
添加离子（中和电荷）
addIons COMPLEX Na+ 0
addIons COMPLEX Cl- 0
保存
saveAmberParm COMPLEX complex.prmtop complex.inpcrd
quit

注意：只做隐式溶剂 MM/PBSA（不跑显式溶剂 MD）时可跳过 solvateBox 和 addIons，直接保存气相复合物。

5.3 分子动力学模拟

（1）能量最小化与平衡：

复制代码

#!/bin/bash
# run_md.sh
1. 初始能量最小化（溶剂+离子）
cat > min1.in << EOF
Minimization with restraints on solute
&cntrl
imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
ntb=1, ntr=1, cut=10.0,
restraint_wt=2.0,
restraintmask=':1-XXX',  ! 蛋白+配体残基范围
/
EOF
pmemd -O -i min1.in -o min1.out -p complex.prmtop -c complex.inpcrd -r min1.rst -ref complex.inpcrd
2. 无限制能量最小化
cat > min2.in << EOF
Unrestrained minimization
&cntrl
imin=1, maxcyc=5000, ncyc=2500,
ntb=1, cut=10.0,
/
EOF
pmemd -O -i min2.in -o min2.out -p complex.prmtop -c min1.rst -r min2.rst
3. 升温（NVT）
cat > heat.in << EOF
Heating phase
&cntrl
imin=0, nstlim=50000, dt=0.002,
ntb=1, ntf=2, ntc=2,
tempi=0.0, temp0=300.0, ntt=3, gamma_ln=2.0,
ntr=1, restraint_wt=2.0,
restraintmask=':1-XXX',
ntpr=500, ntwx=500, ntwr=500,
ioutfm=1, ntxo=2,
/
EOF
pmemd.cuda -O -i heat.in -o heat.out -p complex.prmtop -c min2.rst -r heat.rst -x heat.nc -ref min2.rst
4. 密度平衡（NPT）
cat > density.in << EOF
Density equilibration
&cntrl
imin=0, nstlim=50000, dt=0.002,
ntb=2, ntp=1, pres0=1.0, taup=2.0,
ntf=2, ntc=2,
temp0=300.0, ntt=3, gamma_ln=2.0,
ntr=1, restraint_wt=1.0,
restraintmask=':1-XXX',
ntpr=500, ntwx=500, ntwr=500,
ioutfm=1, ntxo=2,
/
EOF
pmemd.cuda -O -i density.in -o density.out -p complex.prmtop -c heat.rst -r density.rst -x density.nc -ref heat.rst
5. 预平衡（逐步减小限制）
cat > equil.in << EOF
Equilibration with weak restraints
&cntrl
imin=0, nstlim=100000, dt=0.002,
ntb=2, ntp=1, pres0=1.0, taup=2.0,
ntf=2, ntc=2,
temp0=300.0, ntt=3, gamma_ln=2.0,
ntr=1, restraint_wt=0.1,
restraintmask=':1-XXX & !@H=',  ! 仅重原子
ntpr=1000, ntwx=1000, ntwr=1000,
ioutfm=1, ntxo=2,
/
EOF
pmemd.cuda -O -i equil.in -o equil.out -p complex.prmtop -c density.rst -r equil.rst -x equil.nc -ref density.rst

（2）生产模拟（无限制）：

复制代码

Production MD
 &cntrl
   imin=0, nstlim=1000000, dt=0.002,   ! 2 ns（时长依据见"三、模拟时长"）
   ntb=2, ntp=1, pres0=1.0, taup=2.0,
   ntf=2, ntc=2,
   temp0=300.0, ntt=3, gamma_ln=2.0,
   ntpr=5000, ntwx=5000, ntwr=5000,
   ioutfm=1, ntxo=2,
   ig=-1,  ! 随机种子
 /

pmemd.cuda -O -i prod.in -o prod.out -p complex.prmtop -c equil.rst -r prod.rst -x prod.nc -O

多配体 MD 关键考虑：

确保模拟时间足够采样配体构象变化
若配体结合模式不稳定，考虑增强采样方法（REST, aMD）
监控配体 RMSD 和蛋白-配体相互作用

5.4 轨迹处理（多组分提取）

（1）去溶剂 + 各组分轨迹提取：

复制代码

#!/bin/bash
# process_trajectory.sh
1. 去除溶剂和离子（保留蛋白+所有配体）
cpptraj complex.prmtop << EOF
trajin prod.nc 1 last 10  ! 每隔10帧读取，可根据需要调整
autoimage origin center   ! 图像化并居中
rms first :1-XXX & !@H=   ! 对齐蛋白骨架（XXX为蛋白残基数）
strip :WAT,Na+,Cl-        ! 去除水分子和离子
trajout complex_dry.nc netcdf
trajout complex_dry.pdb pdb onlyframes 1  ! 保存第一帧作为参考
EOF
2. 提取蛋白轨迹（去除水和所有配体）
cpptraj complex.prmtop << EOF
trajin prod.nc 1 last 10
autoimage origin center
rms first :1-XXX & !@H=
strip :WAT,Na+,Cl-,L1,L2
trajout protein.nc netcdf
EOF
3. 提取配体1轨迹
cpptraj complex.prmtop << EOF
trajin prod.nc 1 last 10
autoimage origin center
rms first :1-XXX & !@H=
strip :WAT,Na+,Cl-,!:L1   ! 仅保留配体1
trajout lig1.nc netcdf
EOF
4. 提取配体2轨迹
cpptraj complex.prmtop << EOF
trajin prod.nc 1 last 10
autoimage origin center
rms first :1-XXX & !@H=
strip :WAT,Na+,Cl-,!:L2   ! 仅保留配体2
trajout lig2.nc netcdf
EOF

（2）轨迹质量检查：

复制代码

cpptraj complex.prmtop << EOF
trajin complex_dry.nc
rms first :1-XXX & !@H= out rmsd_protein.dat
rms first :L1 nofit out rmsd_lig1.dat
rms first :L2 nofit out rmsd_lig2.dat
distance :L1 :XXX out dist_lig1_protein.dat  ! 配体-蛋白距离
distance :L2 :XXX out dist_lig2_protein.dat
EOF

5.5 MMPBSA 计算：两种策略

主控制文件 mmpbsa.in：

复制代码

# 多配体MMPBSA计算
&general
  startframe=1, endframe=1000, interval=5,  ! 每隔5帧计算
  verbose=2, keep_files=2,
  receptor_mask=":1-XXX",  ! 蛋白mask
  ligand_mask=":L1,L2",    ! 多配体mask（逗号分隔）
  strip_mask=:WAT:Na+:Cl-,
  use_sander=1,
  netcdf=1,
/
&gb
  igb=5, saltcon=0.150,  ! GB-OBC II模型
  surften=0.0072,
/
&pb
  istrng=0.150, fillratio=4.0,
  radiopt=1,             ! 从拓扑读取半径（默认）
  npbverb=1,
  sprob=1.4, vprob=1.4,
  maxarcdot=1500,
/
&decomp
  idecomp=2, dec_verbose=3,  ! 残基分解（1-4 项并入 EEL/VDW）
  print_res="1-XXX",         ! 打印指定残基贡献（如 1,3-10,15）
/

策略一：整体计算（所有配体作为单一配体）

计算 ΔG(bind) = G(complex) − $G(protein) + G(ligand1+ligand2)$ ：

复制代码

MMPBSA.py -O -i mmpbsa.in \
          -o FINAL_RESULTS_MMPBSA.dat \
          -sp complex.prmtop \
          -cp complex_dry.prmtop \
          -rp protein.prmtop \
          -lp ligands.prmtop \
          -y complex_dry.nc

也可以在输入文件里指定 mask（假设蛋白残基 1--300，Lig1 残基 301，Lig2 残基 302）。注意 ligand_mask/receptor_mask 是 &general 的输入文件变量，不是命令行 flag：

复制代码

# mmpbsa.in 中的 &general 段
&general
  startframe=1, endframe=1000, interval=10,
  receptor_mask=":1-300",   ! 蛋白残基
  ligand_mask=":301,302",   ! 多配体 mask（逗号分隔）
/

MMPBSA.py -O \
  -i mmpbsa.in \
  -o FINAL_RESULTS_MMPBSA.dat \
  -sp complex.prmtop \
  -cp complex.prmtop \
  -rp complex.prmtop \
  -lp complex.prmtop \
  -y md_stripped.nc

ligand_mask 可包含多个残基（即多个配体）；Amber 自动将 ligand_mask 中所有残基视为"配体"，计算 ΔG_bind = G_complex − (G_receptor + G_ligand_total)。

策略二：逐个配体计算（推荐，获得个体贡献）

复制代码

#!/bin/bash
# calculate_per_ligand.sh
为配体1创建单独的气相拓扑
cat > tleap_lig1.in << EOF
source leaprc.protein.ff19SB
source leaprc.gaff2
loadAmberParams ligand1.frcmod
lig1 = loadMol2 ligand1.mol2
saveAmberParm lig1 lig1_gas.prmtop lig1_gas.rst
quit
EOF
配体1的 MMPBSA 输入
cat > mmpbsa_lig1.in << EOF
&general
startframe=1, endframe=1000, interval=5,
receptor_mask=":1-XXX",
ligand_mask=":L1",
/
&gb
igb=5, saltcon=0.150,
/
&pb
istrng=0.150, fillratio=4.0,
/
EOF
运行 MMPBSA 计算配体1
MMPBSA.py -O -i mmpbsa_lig1.in 

-o lig1_results.dat 

-sp complex.prmtop 

-cp complex_dry.prmtop 

-rp protein.prmtop 

-lp lig1_gas.prmtop 

-y complex_dry.nc 

-yr protein.nc 

-yl lig1.nc
重复上述步骤为配体2...

-y 复合物轨迹、-yr 受体轨迹、-yl 配体轨迹可分别指定（§4.4 已提取）。

如需从 complex.prmtop 中提取受体/配体拓扑，可用 ParmEd：

复制代码

from parmed import load_file
sys = load_file('complex.prmtop', 'complex.inpcrd')
rec = sys[':1-300']
lig1 = sys[':301']
rec.save('rec.prmtop', overwrite=True)
lig1.save('lig1.prmtop', overwrite=True)

5.6 熵计算（简正模式分析）

复制代码

# 包含熵计算（计算量大）
&general
  startframe=500, endframe=600, interval=1,  ! 减少帧数用于熵计算
  receptor_mask=":1-XXX",
  ligand_mask=":L1,L2",
  verbose=2,
/
&gb
  igb=5, saltcon=0.150,
/
&pb
  istrng=0.150,
/
&nmode
  nmstartframe=500, nmendframe=600, nminterval=10,
  maxcyc=10000, drms=0.001,
/

5.7 配体-配体相互作用与协同效应

配体间相互作用分析（cpptraj）：

复制代码

cpptraj complex_dry.prmtop << EOF
trajin complex_dry.nc
# 配体间相互作用：用 nativecontacts 统计接触对（energy action 只收单一 mask）
nativecontacts :L1 :L2 out ligand_contacts.dat distance 3.5
distance L1-L2-dist :L1 :L2 out ligand_distance.dat mass
EOF

多配体协同效应计算：

ΔG_coop = ΔG_bind(L1+L2) − (ΔG_bind(L1) + ΔG_bind(L2))

负值 → 正协同效应（合作结合）
正值 → 负协同效应（竞争结合）

若两个配体同时结合有协同作用，整体 ΔG ≠ ΔG1 + ΔG2，此时可先算整体再分别算单体以评估协同性。

5.8 多配体关键注意事项

力场一致性：复合物、受体、各配体必须使用相同力场（如 ff19SB + GAFF2）
轨迹收敛：确保 MD 轨迹已充分平衡再采样
原子顺序一致性：计算前务必检查各组分拓扑文件的原子顺序一致性
加速：大型多配体体系建议 GPU 加速（pmemd.cuda）和并行计算（MMPBSA.py.MPI）
结果清理 ：process_minout.perl prod.out 检查 MD 稳定性；MMPBSA.py --clean 清理中间文件

六、MM-GB/SA 输出能量项逐项解读

MMGBSA 输出大体包括两类：分子力学项（E_MM） 和 溶剂化能项（G_sol）。逐项解释如下：

能量项	英文全称 / 描述	计算模型 / 原理	在 MM/GBSA 中的角色
BOND	键能 (Bond Energy)	谐振子势：K_b·(r − r_eq)²	构成 E_MM 的一部分
ANGLE	键角能 (Angle Energy)	谐振子势：K_a·(θ − θ_eq)²	构成 E_MM 的一部分
DIHED	二面角能 (Dihedral Energy)	傅里叶级数：Σ $V_n/2\cdot(1 + cos(nφ - γ_n))$	构成 E_MM 的一部分
VDWAALS	范德华能 (van der Waals)	Lennard-Jones 势（A/r¹² − B/r⁶），描述原子间吸引和排斥	E_MM 中非键能的主要部分
EEL	静电能 (Electrostatic Energy)	库仑定律：q_i·q_j/(ε·r_ij)	E_MM 中非键能的主要部分
1-4 VDW	1-4 范德华能	二面角第 1、4 原子的 VDW 相互作用，乘以缩放因子 1/scnb	E_MM 非键能的一部分
1-4 EEL	1-4 静电能	二面角第 1、4 原子的 EEL 相互作用，乘以缩放因子 1/scee	E_MM 非键能的一部分
EGB	极性溶剂化能 (Polar Solvation)	广义玻恩（GB）模型，估算静电效应引起的溶剂化能	构成 G_solv 的一部分
ESURF	非极性溶剂化能 (Non-polar Solvation)	表面积相关模型（SASA），估算疏水效应	构成 G_solv 的一部分
ΔG_bind	结合自由能	近似：ΔE_MM + ΔG_solv	MM/GBSA 的最终目标结果

DELTA TOTAL 是上述结合能各项的加和，例如 −60 kcal/mol。

七、最佳实践流程图与关键参数速查

7.1 单配体推荐流程

复制代码

结构准备 (PDB)
    ↓
质子化状态确定 (H++ server)
    ↓
拓扑生成 (tleap) → 干燥拓扑 (complex/receptor/ligand)
    ↓
溶剂化 + 离子平衡
    ↓
能量最小化 → 升温 → 平衡 → 生产 MD (1--5 ns)
    ↓
轨迹处理 (cpptraj 去溶剂)
    ↓
MMPBSA.py 计算 (100-200 帧)
    ↓
结果分析 + 能量分解

7.2 多配体推荐流程

复制代码

tleap准备拓扑
    ↓
能量最小化 → 升温 → 密度平衡 → 预平衡 → 生产模拟
    ↓
轨迹处理（去溶剂、对齐、提取组分）
    ↓
MMPBSA计算（整体/逐个配体）
    ↓
能量分解分析（残基贡献）
    ↓
结果分析（结合自由能、协同效应）

7.3 关键参数推荐

参数	推荐值	说明
力场	ff19SB + GAFF2	蛋白 + 配体
水模型	OPC	---
GB 模型	igb=8（GBn2）	igb=5（GB-OBC II）也可
半径集	mbondi3	---
盐浓度	0.100--0.150 M	生理盐浓度
surften	0.0072	表面张力系数 γ
fillratio	4.0	PB 网格填充比
采样帧数	100--200 帧	平衡后 10--50 ns
interval	10--50	采样间隔（平衡效率与精度）

7.4 通用注意事项

轨迹采样质量：MMGBSA/MMPBSA 对构象依赖性强，需确保 MD 充分采样
力场一致性：复合物、受体、配体必须使用相同力场（如 ff19SB + GAFF2）
离子与水处理 ：轨迹中应去除水和离子（或使用 -strip_mask 选项）
配体电荷：建议 AM1-BCC 或 RESP 电荷，避免力场不匹配
相对 vs 绝对自由能 ：MMGBSA 更适合系列配体的相对结合自由能排序，而非绝对值预测
熵贡献：标准 MMPBSA.py 不包含熵（需额外 NMODE 或 quasi-harmonic，计算昂贵）

参考文献

Kollman, P. A. et al. Calculating Structures and Free Energies of Complex Molecules: Combining Mechanical and Continuum Solvent Models. Acc. Chem. Res. 2000, 33, 889--897. DOI: 10.1021/ar000033j
Miller III, B. R. et al. MMPBSA.py: An Efficient Program for End-State Free Energy Calculations. JCTC 2012, 8, 3314--3321. DOI: 10.1021/ct300418h
Genheden, S. & Ryde, U. The MM/PBSA and MM/GBSA methods to estimate ligand-binding affinities. Expert Opin. Drug Discov. 2015, 10, 449--461. DOI: 10.1517/17460441.2015.1032936
Hou, T. et al. Assessing the Performance of the MM/PBSA and MM/GBSA Methods. 1. The Accuracy of Binding Free Energy Calculations Based on Molecular Dynamics Simulations. J. Chem. Inf. Model. 2011, 51, 69--82. DOI: 10.1021/ci100275a
Hou, T., Wang, J., Li, Y., Wang, W. Assessing the performance of the MM/PBSA and MM/GBSA methods: II. The accuracy of ranking poses generated from docking. J. Comput. Chem. 2011, 32, 866--877. DOI: 10.1002/jcc.21666
Sun, H. et al. Assessing the performance of MM/PBSA and MM/GBSA methods. 4. Accuracies of MM/PBSA and MM/GBSA methodologies evaluated by extensive sampling and benchmark of 1900 PDBbind complexes. Phys. Chem. Chem. Phys. 2014, 16, 16719--16729. DOI: 10.1039/c4cp01388c
Sun, H. et al. Assessing the performance of MM/PBSA and MM/GBSA methods. 7. Entropy effects on the performance of end-point binding free energy approaches. Phys. Chem. Chem. Phys. 2018, 20, 14450--14460. DOI: 10.1039/c7cp07623a
Genheden, S. & Ryde, U. How to obtain statistically converged MM/GBSA results. J. Comput. Chem. 2010, 31, 837--846. DOI: 10.1002/jcc.21366
Wang, E. et al. End-Point Binding Free Energy Calculation with MM/PBSA and MM/GBSA: Strategies and Applications in Drug Design. Chem. Rev. 2019, 119, 9478--9508. DOI: 10.1021/acs.chemrev.9b00055
Wang, E. et al. VAD-MM/GBSA: A Variable Atomic Dielectric MM/GBSA Model for Improved Accuracy in Protein--Ligand Binding Free Energy Prediction. J. Chem. Inf. Model. 2021, 61, 2844--2856. DOI: 10.1021/acs.jcim.1c00091
AMBER Manual: https://ambermd.org/doc12/Amber24.pdf（Chapter 38: MMPBSA.py）

特殊体系（突变体、金属离子活性中心、膜蛋白、共价配体）的扩展流程，可参考本系列后续篇目与 AMBER 官方教程对应专题。

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