在使用 Amber（特别是 AMBER force field + sander/pmemd/ambertools）进行分子动力学（MD）模拟前，蛋白结构的准备 是关键的第一步。Amber 本身不直接提供图形化建模工具，但通过其配套软件包 AmberTools （尤其是 tleap、pdb4amber、antechamber 等）可系统化完成蛋白结构的清洗、补全、质子化、拓扑与坐标文件生成。
本文主要展示和讨论：
- 进行分子动力学模拟前蛋白结构准备的一般流程
- 蛋白结构的准备时加氢原子操作时，使用pdb4amber的reduce还是tleap？
- 蛋白结构中可质子化残基的合理处理
以下是以Amber24操作为例，介绍蛋白（apo，无配体）体系的标准输入文件准备流程。
✅ 一、初始结构准备要求（PDB 文件）
- 来源：实验结构（X-ray，NMR，冷冻电镜Cryo-EM）、同源建模结果或者蛋白结构预测模型（Alphafold,ESMFold等）的结果。
对于来自不同实验类型的结构，参数意义不同。以下是对比：
| 特性 | X-ray晶体学 | Cryo-EM | NMR |
|---|---|---|---|
| 样品环境 | 晶体堆积（非生理） | 玻璃态冰（近生理） | 溶液（生理） |
| 结构数量 | 单一模型 | 单一模型 | 系综（20-100个） |
| 典型分辨率 | 1.0-3.0 Å（<2.0Å为优） | 2.5-4.5 Å（<3.5Å为优） | ~2-5Å（精度指标不同） |
| 动态信息 | 无（B因子间接反映） | 无（局部分辨率反映） | 直接包含在系综中 |
| 大小限制 | 无限制 | <100-200 kDa（传统） | <50-100 kDa |
| 时间尺度 | 静态 | 静态 | ps-ms平均 |
| 温度 | 通常100K | 液氮温度（~100K） | 室温/生理温度 |
- 基本质量要求：
- 完整主链（无缺失残基/原子，尤其 N/Cα/C/O），即研究对象的主链，去处不相关链；
- 残基命名符合标准 IUPAC/Amber 命名（如
ALA,LYS,ASP；非HIS,HID,HIE,HIP需后续正确质子化）； - 无重复/冲突的原子序号或链标识；
- 删除不需要或者不关注的链或分子，主要是蛋白结晶附带的与3D结构不相关的配体；
- 建议去除结晶水、配体、辅因子（除非需保留）；若需保留，须额外处理。
PDB结构的解读请参考博文：PDB: 结构生物学的"宪法级"格式，但90%使用者从未真正读懂它
蛋白结构预测模型结构的评价指标可参考博文：蛋白结构预测模型评价指标
- ⚠️ 注意事项
- 来自实验结果的PDB结构检查，结构的分辨率 ≤ 2.0 Å（X-ray）、R-factor < 0.20（越低越好）；Cryo-EM全局分辨率 ≤ 3.5 Å且活性位点/配体区域局部分辨率高；如果达不到要求，需要注意研究的活性位点或者结合位点相关的残基是否可靠；
- 若为 NMR 结构，选择第一个模型或平均结构；
- 蛋白结构预测模型的PDB结构，可选择置信度高（pLDDT>70，越高越好）的一个或者多个结构。
本文以布鲁顿酪氨酸激酶的激酶结构域3D结构为例，PDB ID: 7SI1。
HET MES A1101 12
HET SO4 A1102 5
HET SO4 A1103 5
HETNAM MES 2-(N-MORPHOLINO)-ETHANESULFONIC ACID
HETNAM SO4 SULFATE ION
FORMUL 2 MES C6 H13 N O4 S
FORMUL 3 SO4 2(O4 S 2-)
FORMUL 5 HOH *267(H2 O)该结构中除了蛋白A链331个氨基酸以外，另外有2个硫酸分子，1个MES分子，267个水分子。
A链是我们关注的研究目标，所以去除A链以外的部分。
✅ 二、结构预处理
预处理必不可少。预处理目的：
- 提取关注的结构部分，删除A链以外的分子，只保留蛋白部分的结构；
- 补全实验获得结构中的缺失残基，比如loop等结构，可以使用多个其它程序，比如MOE(structure preparation)，Schrodinger（protein preparation），OpenMM中的pdbfixer（基于模板或简单建模的简单修复），
SWISS-MODEL或者Modeller（同源建模）等等； 重命名残基符合Amber读取要求，使用Amber自带的pdb4amber；处理质子化状态：确定可电离残基（His、Asp、Glu、Lys）的质子化状态（pH 7.4为标准）；处理 组氨酸（HIS）命名，HID（δ位质子化）、HIE（ε位质子化）、HIP（双质子化）- 对整个蛋白结构的加氢原子的灵魂拷问：使用pdb4amber还是tleap？（讨论见下文）
处理存在的非标准残基，后续将单独介绍，本例不涉及；- 处理二硫键，确认并定义CYS-CYS连接，后续将单独介绍，本例不涉及；
- 处理金属离子，后续将单独介绍，本例不涉及。
本例操作：（不含二硫键，非标准残基和活性位点金属离子或金属离子辅因子）
Step 1： 删除A链以外的分子，只保留蛋白A链结构；使用第三方工具补全缺失的残基，保持蛋白链的完整；删除氢原子，让Amber自动添加。处理过程中去掉了未解析的4个末尾的残基，目前残基总数327；保存结果为7SI1_prep.pdb
Srep 2： 使用pdb4amber，-y 选项即 --nohyd，不保留氢原子，可以留给tleap处理；也可以使用 --reduce选项加氢原子
pdb4amber -i 7SI1_prep.pdb -o 7SI1_clean.pdb --nohydpdb4amber的输出一般包括：
|-----------------|-------------------------|
| pdb4amber输出文件名 | 解释 |
| *.pdb | 残基重新编号的蛋白结构 |
| *_nonprot.pdb | 所有非蛋白组分（配体、离子、结晶水等） |
| *_sslink | 检测到的二硫键信息 |
| *_renum.txt | 残基编号映射记录 |
本例运行后生成4个文件，其中7SI1_clean.pdb，对残基重新编号，从1开始重新编号到327，将作为tleap的输入文件。
没有二硫键和其他非蛋白组分，所以二硫键和非蛋白组分文件为空。
✅ 三、使用 tleap 构建系统（核心步骤）
tleap 是 Amber 的拓扑构建器，负责：
- 加载力场；
- 加载蛋白结构并分配电荷/键级/二面角参数；
- 溶剂化（TIP3P/TIP4P/EW 水模型）；
- 中和电荷（添加 Na⁺/Cl⁻ 离子）；
- 输出最终输入文件：
prmtop（拓扑）+inpcrd（坐标）。
创建名称为leap.in 脚本，内容如下（#号后面是注释，非必须）：
# 加载力场，原子半径参数
source leaprc.protein.ff19SB # 推荐蛋白力场（替代旧 ff14SB）
source leaprc.water.tip3p # 水模型
set default PBradii mbondi2 # 显式设置默认 PBradii 为 mbondi2（推荐）
# 加载蛋白（自动识别残基、加氢、分配质子化态）
mol = loadpdb 7SI1_clean.pdb
# 溶剂化：立方盒，边界距离 10 Å
solvateBox mol TIP3PBOX 10.0
# 中和体系电荷
addions mol Na+ 0
addions mol Cl- 0
# 保存
saveamberparm mol 7SI1_solv.prmtop 7SI1_solv.inpcrd
savepdb mol 7SI1_solv.pdb
# 计算体系电荷
charge mol
quit运行：
tleap -f leap.in运行后输出：
7SI1_solv.prmtop：Amber 拓扑文件（含质量、电荷、键合关系、二面角等）；7SI1_solv.inpcrd：初始坐标（含水、离子）；7SI1_solv.pdb：可用于可视化验证。
⚠️ 重要注意事项
| 项目 | 说明 |
|---|---|
| 质子化态 | tleap 默认按 pH 7.4 判断（如 ASP→ASH？否，仍为 ASP 去质子化；LYS→LYS 质子化）。His 残基需特别关注------tleap 会尝试智能判断，但建议用 check mol 或 list mol 查看，并结合 pKa 计算（如 propka）人工校验。 |
| 力场选择 | 蛋白首选 ff19SB（增强 backbone χ₁/χ₂ 和 sidechain 构象采样），避免使用过时的 ff99SB。 |
| 水模型匹配 | ff19SB 与 TIP3P 经联合验证，作为优选；若用 TIP4P-EW，需加载 leaprc.water.tip4pew 并确认兼容性。 |
| 周期性边界 | solvateBox 生成正交盒子；如需截角八面体（octahedral），用 solvateOct（节省粒子数）。 |
✅ 四、残基质子化状态与特殊处理
- 在某些情况下，残基质子化状态对MD有重要影响。
- 在 pH 7.4（生理 pH） 条件下，蛋白质中可离子化氨基酸残基的质子化状态主要由其 pKa 值 与环境 pH 的相对关系决定。
- 💡 注意 ：AMBER 不会自动判断微环境 pKa ！你需要手动指定非标准质子化状态（如将 ASP 改为 ASH 表示质子化）。
- 以下是具有多种质子化状态的氨基酸在AMBER 力场中的默认处理（pH 7.4）：
| 残基 | AMBER 默认命名 | 质子化状态 | 说明 |
| Asp | ASP | 去质子化（--COO⁻） | 带 --1 电荷 |
| Glu | GLU | 去质子化（--COO⁻） | 带 --1 电荷 |
| His | HID | Nδ1 质子化 | 最常见默认；也可用 HIE（Nε2 质子化）或 HIP（双质子化） |
| Cys | CYS | 质子化（--SH） | 中性；若形成二硫键 → CYX |
| Tyr | TYR | 质子化（--OH） | 中性 |
| Lys | LYS | 质子化（--NH₃⁺） | 帶 +1 电荷 |
| Arg | ARG | 质子化 | 帶 +1 电荷 |
|---|
- 以下是标准 20 种氨基酸中可离子化残基在 pH 7.4 时的典型质子化状态:
| 残基 | 侧链pKa | pH 7.4时的状态 | Amber残基名 | 电荷 |
|---|---|---|---|---|
| Asp (D) | ~3.9 | 去质子化 (-) | ASP |
-1 |
| Glu (E) | ~4.3 | 去质子化 (-) | GLU |
-1 |
| Lys (K) | ~10.5 | 质子化 (+) | LYS |
+1 |
| Arg (R) | ~12.5 | 质子化 (+) | ARG |
+1 |
| His (H) | ~6.0 | 部分质子化 | HID/HIE/HIP |
0/+1 |
| Cys (C) | ~8.3 | 主要为中性 | CYS |
0 |
| Tyr (Y) | ~10.1 | 质子化 (中性) | TYR |
0 |
| N-terminus | ~8.0 | 质子化 (+) | - | +1 |
| C-terminus | ~3.8 | 去质子化 (-) | - | -1 |
- 但在真实蛋白结构中，局部环境可使 pKa 偏移 ±3 个单位以上:
| 微环境影响 | pKa 变化 | 示例 |
|---|---|---|
| 疏水口袋 | ↑ pKa（更难去质子化） | ASP 在疏水区可能保持质子化（--COOH） |
| 正电荷附近 | ↑ pKa（稳定去质子化形式） | GLU 靠近 ARG → 更易去质子化 |
| 负电荷附近 | ↓ pKa（更难去质子化） | ASP 靠近另一个 ASP → pKa 升高，可能质子化 |
| 金属离子配位 | ↓ pKa（促进去质子化） | CYS-Zn²⁺ → CYS 去质子化（--S⁻） |
| 氢键网络 | 可升可降 | HIS 在氢键供体/受体间，pKa 可调至 7--8 |
- 组氨酸（His）- 特殊情况：
在Amber中，组氨酸由于pKa接近生理状态的pH（7.4），因此有3中不同的质子化状态，单质子化的HIE（为主）和HID，双质子化的HIP：
pKa ≈ 6.0，接近生理pH，存在三种状态：
HID（δ位质子化） HIE（ε位质子化） HIP（双质子化）
| | |
ND1-H NE2-H ND1-H + NE2-H
（中性） （中性） （+1电荷）
pH 7.4时的分布：
- ~80-90% 为 HID 或 HIE（单质子化，中性），ε位N碱性强，HIE为主
- ~10-20% 为 HIP（双质子化，带电）
- 具体比例取决于微环境- 半胱氨酸（Cys）- 特殊情况
| 环境 | pH 7.4状态 | Amber处理 |
|---|---|---|
| 游离Cys | 主要为 CYS（-SH，中性） |
标准模板 |
| 二硫键Cys | CYX（氧化态，中性） |
需手动指定或自动检测 |
| 金属配位Cys | 可能去质子化（CYS⁻） | 需自定义参数 |
| 活性位点Cys（如半胱氨酸蛋白酶） | 去质子化（硫醇盐） | 需特殊处理 |
二硫键定义示例：
如果含有二硫键，可以在tleap中使用bond关键字指定，pdb4amber有时不能正确处理。
# tleap中指定二硫键
bond mol.32.SG mol.35.SG # Cys32-Cys35
# 或自动检测（pdb4amber生成sslink文件）-
酪氨酸（Tyr）- 特殊酶活性位点
标准状态：质子化（中性，-OH）
特殊案例：- 酪氨酸激酶活性位点：可能去质子化参与磷酸转移
- 光合作用中心：特殊氢键环境降低pKa
- 需用PROPKA等工具预测异常pKa
-
如何确定你的体系中残基的真实质子化状态？
方法 1：使用 pKa 预测工具（推荐）
PROPKA（集成在 PDB2PQR、ChimeraX 中）
propka3 7SI1_clean.pdb输出名称为7SI1_clean.pka的文件，里面有每个残基的预测 pKa 和建议质子化状态。
方法 2：手动分析（适用于已知机制）
查文献：该蛋白活性位点残基的质子化状态是否已知？
看结构：ASP/GLU 是否在疏水区？HIS 是否与 ASP/Glu 形成氢键？
方法 3：在 AMBER 中测试
分别用不同质子化状态运行短 MD，看哪个更稳定。
- 是否需手动干预？
| 残基 | 溶液中（标准） | 蛋白中（可能） | AMBER 默认 | 是否需手动干预？ |
|---|---|---|---|---|
| ASP | 去质子化 (--) | 可能质子化（若疏水） | ASP (--) | ✅ 若在活性位点/疏水区 |
| GLU | 去质子化 (--) | 可能质子化 | GLU (--) | ✅ 同上 |
| HIS | 部分质子化 | HID / HIE / HIP | HID | ✅ 强烈建议检查 |
| CYS | 质子化 (0) | 可能去质子化（若配位金属） | CYS (0) | ✅ 若结合 Zn²⁺/Fe²⁺ |
| LYS | 质子化 (+) | 几乎总是质子化 | LYS (+) | ❌ 通常不用改 |
| ARG | 质子化 (+) | 几乎总是质子化 | ARG (+) | ❌ 通常不用改 |
总之，需要根据研究目的，确定蛋白质必要的质子化状态。重点关注组氨酸、半胱氨酸和酸性氨基酸的质子化状态，是否与研究目标一致。
✅ 五、蛋白结构加氢处理讨论
在 AMBER 工作流中，可以使用pdb4amber的reduce选项调用reduce模块加氢，也可以留给 tleap使用Amber力场参数加氢，是一个常见但关键的选择。两者在加氢策略、质子化状态、适用场景上有本质区别。
| 场景 | 推荐方式 |
|---|---|
| 常规蛋白模拟（无特殊 pH/催化残基） | ✅ 留给 tleap 加氢（更简单、标准） |
| 需要精确控制组氨酸/酸碱残基质子化状态（如酶活性位点） | ✅ 用外部工具（如 reduce / MCPB.py / H++）预加氢，pdb4amber 仅清洗 |
pdb4amber 自身不推荐用于加氢！ |
❌ 它没有智能质子化能力 |
两者的本质区别：
| 特性 | pdb4amber --reduce |
tleap 自动加氢 |
|---|---|---|
| 加氢时机 | 预处理阶段（PDB→PDB） | 拓扑生成阶段（PDB→拓扑） |
| 质子化判断 | 基于Reduce算法（环境感知） | 基于残基模板（标准pH 7.0） |
| His处理方式 | 自动判断HID/HIE/HIP | 默认全为HIS（需手动指定） |
| 灵活性 | 高，可人工干预 | 低，依赖模板 |
| 可重复性 | 中等（依赖Reduce版本） | 高（固定模板） |
| 可视化验证 | ✅ 加氢后可检查 | ❌ 直接进模拟 |
两种加氢的详细描述：
1. pdb4amber 预处理加氢
pdb4amber 是AmberTools中专门用于准备PDB文件的工具，它可以在进入tleap前对结构进行"清理"和预处理。pdb4amber 的设计初衷是"清洗 PDB 格式"，不是"加氢工具" 。它的 --reduce 选项只是调用外部 reduce 程序，并非内置功能。
特点：
- 修复结构问题：自动修复残基命名、原子命名、缺失重原子等（例如将HIS转换为HID/HIE/HIP）。
- 选择性加氢 ：可根据pH值（通过
--reduce选项）添加氢原子，并优化氢原子的取向（尤其是His、Asn、Gln的翻转问题）。 - 去除非标准内容：删除水分子、异质原子（如配体、结晶剂），生成"干净"的蛋白结构。
- 输出标准化PDB：生成符合Amber命名规范的PDB文件（如原子名称、残基顺序）。
典型命令：
pdb4amber -i input.pdb -o cleaned.pdb --reduce # 加氢并优化氢键网络优点：
- 更可控：可先检查修复后的结构，再进入tleap。
- 处理复杂情况：适合晶体结构中存在命名错误、质子化状态不确定的情况。
- 减少tleap报错：避免tleap因原子命名问题而失败。
2. tleap 自动加氢
tleap 是Amber的建模工具，在加载力场和生成拓扑文件时，可以自动添加缺失的氢原子。
特点：
- 力场依赖：加氢基于所选力场（如ff19SB）的模板，氢原子类型与力场匹配。
- 简单直接：一条命令自动完成加氢、添加溶剂、离子等步骤。
- 默认质子化状态 ：默认添加标准质子化状态（如Lys带正电、Glu带负电），但不自动优化His/Asn/Gln的取向。
典型命令（在tleap内）：
source leaprc.protein.ff14SB # 加载力场
mol = loadpdb input.pdb # 加载PDB，自动加氢优点：
- 流程简单：适合结构规范、无需特殊处理的体系。
- 集成化：加氢与后续步骤（溶剂化、中和）一气呵成。
关键区别对比
| 方面 | pdb4amber + reduce | tleap 自动加氢 |
|---|---|---|
| 氢原子取向优化 | ✅ 通过Reduce算法优化（如His翻转、羟基取向） | ❌ 仅按模板添加，不优化 |
| 修复结构错误 | ✅ 自动修复残基/原子命名、缺失重原子 | ❌ 遇到错误可能直接报错 |
| 质子化状态控制 | ✅ 可通过pH值预测，并手动调整 | ⚠️ 仅默认状态，需手动修改残基名称（如HIE/HID） |
| 流程复杂度 | 多一步预处理，但更稳健 | 一步到位，但可能隐藏结构问题 |
| 适用场景 | 晶体结构分辨率低、有命名问题、需精确质子化状态 | 结构规范、无需特殊处理的体系 |
3. 推荐工作流程
结合两者优势的最佳实践：
-
初始检查：
pdb4amber -i 7SI1_prep.pdb -o 7SI1_clean_noH.pdb --nohyd # 检查问题但不加氢 -
修复并加氢（如需优化氢键）：
pdb4amber -i 7SI1_clean_noH.pdb -o 7SI1_clean.pdb --reduce # 加氢并优化 -
手动调整（如有必要）：
- 检查
clean_H.pdb中His、Asn、Gln的取向，用Chimera/VMD确认。 - 修改残基名称（如HIP/HID/HIE）以匹配质子化状态。
- 检查
-
进入tleap：
source leaprc.protein.ff19SB mol = loadpdb 7SI1_clean_H.pdb # 此时tleap不会重复加氢（因PDB中已含氢） solvateBox mol TIP3PBOX 10.0 addions mol Na+ 0 saveamberparm mol 7SI1_solv.prmtop 7SI1_solv.inpcrd
⚠️ 注意事项
- 氢原子重复问题 ：若PDB已含氢，tleap默认不再添加，但会检查是否与力场匹配。
- His质子化 ：晶体结构中的His通常为中性（HID/HIE），但需根据pH决定是否质子化（HIP）。pdb4amber的
--reduce可根据pH预测，而tleap需手动指定残基名。 - 氢原子命名：Amber力场对氢原子名称有严格规定（如HG1、HH22），pdb4amber可转换至正确命名。
小结建议
- 优先使用pdb4amber --reduce：尤其对晶体结构，可避免后续因氢原子问题导致的能量异常。
- 直接使用tleap：仅当PDB文件来源可靠（如经MD预处理）、无需优化氢键时。
- 始终可视化检查：无论用哪种方法，用VMD/Chimera检查加氢后的结构是否合理（特别是带电残基和氢键网络）。
✅ 六、验证与质检
-
使用parmed检查：parmed 7SI1_solv.prmtop << EOF
printDetails :HIE
EOF -
使用PyMol等查看溶液体系：
pymol 7SI1_solv.pdb
可以看到，溶液边界将蛋白部分完美包裹。需要确保蛋白不跨越周期性边界，通过solvateBox边界调节，一般10-12Å足够，太高会导致体系太大，运行效率降低。
✅ 七、体系准备与MD
后续工作按照蛋白溶液体系模拟即可。
可以参考系列博文：
大体流程如下分阶段准备体系：
-
仅约束溶质，优化溶剂（500-1000步）
-
全系统最小化（无约束）
-
逐步升温（NVT系综，100K → 300K）
-
密度平衡（NPT系综，调整盒子尺寸）
-
生产模拟（NPT或NVE）
本文介绍Amber用于分子动力学模拟输入文件的准备：蛋白结构准备，一般流程和关键注意事项。