1.农杆菌是什么？
农杆菌（Agrobacterium tumefaciens，根癌农杆菌），是土壤细菌。
- 天然特性：Ti 质粒上有一段TDNA（转移 DNA），可以把 TDNA 片段切割下来，插入到植物细胞的染色体 DNA 上。
- 改造：把 Ti 质粒上面致癌基因删掉，保留 TDNA 左右边界；把我们的目的基因/ CRISPRCas9 载体放到 TDNA两个边界之间。
- 实验逻辑：把重组质粒转入农杆菌，用农杆菌侵染植物材料；农杆菌就充当"搬运工"，把 TDNA 内的目的基因送入植物细胞，整合进植物基因组，得到转基因植物。
注意：TDNA 只转移左右边界内部的序列；载体骨架（抗性基因、复制子等）一般不会进入植物。
2.T0、T1、T2、T3 代苗定义
T = Transformant，转基因世代；世代从农杆菌侵染后再生出来的第一代植株算起。
通俗记忆：
- T0：组培直接长出来的小苗（初代再生苗）
- T1：T0 结的种子种出来
- T2：T1 结的种子种出来
- T3：T2 结的种子种出来，稳定材料做实验
3.什么是愈伤组织（愈伤 callus）
植物细胞受伤后，脱分化，分裂形成一团无规则、薄壁、未分化的细胞团，叫愈伤组织。
- 农杆菌侵染幼胚后，幼胚细胞被侵染，在培养基激素诱导下脱分化长出愈伤。
- 抗性筛选培养基筛选：只有成功转入 TDNA（带抗性基因）的细胞才能存活增殖长出愈伤；没有转化的细胞会死去褐化。
- 之后更换分化培养基，调整激素比例：愈伤再分化→长出芽、根，变成完整小苗（T0 苗）
两个概念区分：
脱分化：成熟细胞变回分裂旺盛的未分化细胞，长出愈伤。
再分化：愈伤细胞重新分化，长出芽、根，形成完整植株。
4.遗传转化整套培养基含义（玉米幼胚转化为例）
不同培养基，核心差别：基础盐 + 植物激素（2,4D、NAA、6BA） + 筛选抗生素。
PS：筛选标记基因（放在 TDNA 内部）
5.什么情况代表转基因/基因编辑成功？
- TDNA 是否转入（转基因阳性）；
- CRISPR 是否把靶基因 DNA 序列敲除（即编辑突变阳性）。
（1）判断 TDNA（载体）成功转入植物
- 表型初筛：再生愈伤、小苗可以在含筛选抗生素培养基上存活；阴性未转化材料全部褐化死亡。（仅初步鉴定！）
- 分子 PCR 鉴定：提取T0/T1 代叶片 DNA，PCR 扩增 TDNA 内部特异片段（比如Cas9、潮霉素、bar），能扩增出预期大小条带，说明载体 TDNA 整合进基因组。
- 注意：抗性存活≠一定转基因成功，会出现抗性逃逸细胞，必须 PCR 验证。
（2）CRISPRCas9 敲除突变成功
就算 TDNA 转入，Cas9 不一定成功切割目标基因，要做：
- PCR 扩增靶基因位点，送 Sanger 测序；
- 测序结果峰图出现插入/缺失、移码突变，造成提前终止密码子，蛋白功能失活，才算编辑成功突变株。
总结：
- 只长抗性愈伤、小苗，没有 PCR 阳性→逃逸，不算转基因成功。
- PCR 检测 TDNA 条带阳性：代表转基因植株。
- CRISPR：PCR + 测序看到靶位点插入缺失，才是突变株。