叶绿体既是光合作用和能量生产的中心，也是植物应对环境胁迫的重要调控节点。低温会限制植物的代谢和能量利用，但光能吸收仍可能持续，造成能量供需失衡，增加光抑制和氧化损伤风险。过去的研究已经发现，植物可以通过非光化学淬灭、循环电子流、活性氧清除等方式保护叶绿体，也知道叶绿体能够向细胞核发送"逆行信号"，调整核基因表达。但仍有一个关键问题：叶绿体外部的低温信息，如何进入叶绿体，并进一步协调光合装置调整和核内抗冷反应？
近日，广州中医药大学中药学院药用植物生理生态研究所王宏斌/靳红磊团队在在国际知名期刊《Cell》（IF=45.1）发表了题为"Chloroplasts balance energy production and stress resilience via a cold-induced signaling pathway"的研究论文。该研究揭示了低温环境中植物叶绿体平衡能量生产与胁迫防御的分子机制。爱基百客为该研究提供RNA-seq的技术支持。
研究结果
1.突变体筛选锁定关键基因，确定RAF3/6在冷胁迫条件下调控光合作用活性
研究用叶绿素荧光成像系统建了一套高通量筛选，从ABRC的约5万份拟南芥T-DNA插入突变体里找调控低温光合表现的因子RAF3和RAF6，它们都属于B3型RAF激酶家族。它们的Fv/Fm在低温条件下比野生型更高，而在22°C正常生长条件下与野生型没有差别。
为了排除背景效应，研究做了回补。在raf3-1、raf3-2里表达RAF3-GFP，在raf6-1、raf6-2里表达RAF6-GFP，Fv/Fm都恢复到野生型水平。这些结果表明在冷胁迫下，RAF3和RAF6对叶绿体光合作用活性起负向调控作用。
研究进一步拓展检测了叶绿素荧光相关参数，结果表明突变体在冷胁迫下光合受抑更轻；与循环电子流相关参数的检测表明，在两种条件下raf3-1或raf6-1突变不会显著改变循环电子流。分子层面，用BN-PAGE分离类囊体膜复合物，发现冷胁迫下突变体中PSII的各种形式（超复合体、二聚体、单体、缺CP43的PSII）以及PSI单体都比野生型多。免疫印迹进一步显示，D1、CP43、LHCB1、PsaA、PsaB在突变体中积累，而ATPB、PETC、Cytf不变。与此同时，相关光合基因的转录水平和蛋白水平并未显著改变，提示RAF3/6主要通过转录后机制调节光合蛋白及复合体的积累。RAF家族有很多成员，研究还利用RNA-seq排除了家族冗余。
图1：raf3与raf6突变会影响叶绿体功能
2.低温触发RAF3从细胞质、RAF6从质膜转位进叶绿体
瞬时表达实验显示，正常生长条件下RAF3定位在细胞质，RAF6主要与质膜标记共定位。低温处理后，两者都转位到了叶绿体。生物信息学预测RAF3的N端有叶绿体转运肽cTP，而RAF6缺乏cTP，但有一段预测的跨膜结构域TMD。把RAF3的cTP删掉，叶绿体定位就消失了。
从RAF3-GFP和RAF6-GFP转基因植株分离叶绿体、细胞质和质膜组分做免疫印迹。对照条件下叶绿体组分里的RAF3和RAF6几乎检测不到；低温处理后，细胞质里的RAF3-GFP和质膜上的RAF6-GFP减少，叶绿体中的含量则增加。这些结果表明低温胁迫可引发RAF3从细胞质重新定位至叶绿体，以及RAF6从质膜重新定位至叶绿体。
BiFC显示，共表达RAF3-YFPC与RAF6-YFPN时，只有在低温条件下叶绿体内才出现明显的荧光信号，正常生长条件下检测不到。Co IP和pull-down进一步确认了这个低温诱导的相互作用。这些结果表明冷胁迫可触发RAF3和RAF6在叶绿体中的互相作用。
图2：低温胁迫可诱导RAF3与RAF6定位于叶绿体。
3.在冷胁迫条件下，RAF3/6靶向叶绿体中的类囊体蛋白D1与LHCB1
研究对RAF3-GFP和RAF6-GFP回补株系做CoIP联合质谱，在对照和低温条件下分别鉴定互作蛋白。鉴定得到1,009个RAF3相关蛋白和942个RAF6相关蛋白在低温下特异富集，其中714个是低温下共有的互作蛋白。
GO富集分析显示这714个蛋白主要与细胞组分（质体、叶绿体和质体基质）相关，超过一半（51.9%）富集在叶绿体组分，功能上涉及光合作用，包括PSI、PSII和LHCII复合物的多个组分。这些结果表明，在冷胁迫条件下，RAF3与RAF6主要参与调控叶绿体光系统蛋白的表达。拟南芥原生质体的BiFC实验和CoIP+pull down结果表明在冷胁迫条件下，RAF3与RAF6特异性地与D1及LHCB1（类囊体蛋白）互相作用。
图3：RAF3与RAF6靶向D1及LHCB1，并与之发生相互作用。
4.RAF3/6在冷胁迫条件下磷酸化D1与LHCB1
磷酸化组学与IP-MS结果取交集，得到114个RAF3/6共同的磷酸化靶标，其中36个蛋白的磷酸化水平在raf3-1和raf6-1突变体中低温下同时下降。D1和LHCB1既在互作蛋白里，也在共同靶标名单里，据此研究团队把它们作为叶绿体中RAF3/RAF6激酶的底物。为验证这个结论，研究用抗磷酸化（Ser/Thr）抗体检测，低温条件下突变体中D1和LHCB1的磷酸化显著低于野生型，正常生长条件下没有差别。这些研究结果表明，RAF3与RAF6是D1及LHCB1在冷胁迫条件下特异性发生磷酸化所必需的。
采用D1和LHCB1的特异性抗体进行Phos-tag实验，两种条件下都能看到迁移慢的上条带（高磷酸化形式）和迁移快的下条带（低磷酸化或非磷酸化形式）。正常条件下raf突变体和野生型的上下条带比例相当；低温下野生型D1和LHCB1的上条带明显增加，突变体里D1这个增加显著减弱，LHCB1的上条带增加在突变体中则完全消失。这些结果表明冷胁迫条件下D1和LHCB1磷酸化在raf突变体中受损，意味着RAF3与RAF6是冷胁迫下D1和LHCB1在体内正常磷酸化所有必需的。
体外磷酸化实验把全长RAF蛋白与从raf3-1、raf6-1突变体分离的类囊体共孵育，两个激酶都能磷酸化类囊体制备物中的D1和LHCB1。在ATP存在条件下，检测重组激酶结构域蛋白对D1和LHCB1的磷酸化作用；λ蛋白磷酸酶可有效抑制由RAF3/6诱导的D1与LHCB1的磷酸化。
raf3-1 raf6-1双突变体的Fv/Fm和D1、LHCB1丰度只比单突变体略高一点，并没有显著加重。但交互回补实验里，可以将D1和LHCB1恢复到接近野生型水平。两个激酶有重叠的生化活性，但内源表达量各自不足以单独维持完整的光合保护，这意味着最大程度的冷响应需要两个激酶的共同作用。
图4：RAF3与RAF6对D1及LHCB1磷酸化的分析。
5.RAF3/6在类囊体膜内重新分布D1与LHCB1，并在冷胁迫条件下影响类囊体结构
低温胁迫下，raf突变体中D1和LHCB1在类囊体核心区的量增加，在类囊体边缘和基质片层则减少。这些结果表明RAF蛋白促进D1和LHCB1从类囊体堆叠核心区向未堆叠的类囊体边缘区及基质片层区域的横向移动。BN-PAGE电泳加D1抗体显示，低温处理后突变体中单位叶绿素的PSII水平更高。这表明冷胁迫下，D1在基粒核心、基粒边缘及基质片层中的分布变化影响了raf突变体中的PSII复合体的组织结构。
同时，叶绿体的超微结构也发生了变化。电镜形态计量显示，低温让野生型的平均基粒高度显著增加，而raf3-1和raf6-1突变体在对照和低温条件下都没有这个变化。反过来，低温让两个突变体的基粒直径显著增加，野生型则没有。这表明RAF3/6在低温胁下参与光合膜的功能组织。
综上所述，RAF3/6在冷胁迫条件下调控D1与LHCB1从基粒堆向基粒边缘及基质片层的迁移，从而重新分布类囊体膜中的PSII蛋白。
图5：RAF3与RAF6对类囊体膜中D1及LHCB1的调控作用。
6.在冷胁迫条件下，RAF3/6通过WHY1激活核冷应答通路
评估光合作用抑制对核基因表达的影响，对野生型和raf3-1/raf6-1突变体进行冷处理后的RNA-seq分析，鉴定到大量差异表达基因。k-means聚类将基因分为16个簇，其中多个簇与已知冷响应基因重叠。热图显示在低温条件下突变体中冷响应基因的下调幅度减弱。RT-qPCR确认关键冷响应因子CBF1和CAMTA的表达在突变体中显著降低。这些结果表明raf突变体对冷胁迫的核响应能力减弱，这凸显了RAF3和RAF6在介导冷胁迫信号传导中的作用。
WHY1是一个已知的双定位蛋白（叶绿体↔细胞核），被认为可能充当逆行信号传递者。RNA-seq显示WHY1在冷处理后表达上调，但在突变体中上调幅度减弱。蛋白水平分析进一步显示，冷处理后野生型中WHY1蛋白水平较raf突变体显著升高，且主要发生在细胞核中，叶绿体中WHY1水平在野生型与raf突变体无显著差异，而突变体中这种核积累未出现，提示RAF3和RAF6参与该调控过程。
在raf3-1和raf6-1突变体中表达WHY1，可以恢复冷响应基因的表达至野生型水平。ChIP-qPCR显示，冷胁迫下WHY1对CBF2、CBF3和CAMTA3启动子的结合在突变体中显著降低。
磷酸化组学显示WHY1在冷胁迫下被磷酸化。BiFC和CoIP确认RAF3/6与WHY1物理互作。Phos-tag实验显示冷胁迫下，野生型中WH1Y的磷酸化被显著诱导，而在突变体中无此现象。体外激酶实验证明RAF3/6可以直接磷酸化WHY1，且λPP可以去除磷酸化信号，证明其反应的特异性。综上，在冷胁迫下RAF激酶可直接磷酸化WHY1。
对野生型和突变体进行4、8、15天的持续冷处理。随着时间延长，raf3-1和raf6-1突变体的莲座叶直径逐渐小于野生型。综上结果表明：在低温条件下，RAF可抑制光合作用活性，同时上调冷响应基因的表达，最终增强植物对长期低温胁迫的驯化能力。
图6：由RAF3与RAF6诱导的冷反应通路。
7.纬度相关的RAF6 SNP变异影响低温诱导的叶绿体转运
基于AraGWAS数据库中分析了拟南芥地方品种的全长RAF3和RAF6基因序列，发现RAF6中有14个SNP，RAF3中有10个SNP。其中RAF6的SNP6（第一外显子的G/A多态性）导致412份材料为D132、89份材料为N132。SNP6与纬度呈现显著关联：A等位在低纬度更常见，G等位在高纬度更常见。其他SNP无此地理模式。已知冷敏感拟南芥种质Can和Co在SNP6处为A，中等耐冷种质Ler则携带G等位。这些结果表明，RAF6基因的SNP6位点其分布呈现纬度梯度特征，并可能参与调控植物对低温适应性的自然变异。
用500个拟南芥种质资源构建携带RAF6 SNP6的系统发育树，发现携带G等位的材料在进化树上聚为一支。功能分析显示，携带D132N突变的RAF6在低温条件无法进入叶绿体，而是滞留在质膜，这意味着D132N替换破坏了RAF6从质膜向叶绿体的低温诱导性转运过程。
IP-MS分析发现分子伴侣HSP70-1与RAF3和RAF6互作。BiFC、coIP和pull-down确认了这些互作。在hsp70-1突变体或用HSP70抑制剂处理后，RAF3和RAF6在冷下都无法转运至叶绿体。BiFC等实验还显示，RAF3和RAF6在进入叶绿体后才形成复合物，而在hsp70-1突变体中这种互作消失。RAF6的D132N变异体不与HSP70-1互作。在raf6-1突变体中表达RAF6D132N-GFP无法像野生型RAF6-GFP那样恢复Fv/Fm至野生型水平。这意味着该残基对RAF6的功能至关重要。
综上所述，这些结果表明RAF6基因SNP6位点的自然变异可通过HSP70-1依赖性叶绿体转运途径调控低温诱导的亚细胞定位，进而促进高纬度种群对低温环境的适应性进化。研究揭示了叶绿体环境感知与整株植物低温驯化之间的分子机制，并为植物如何在能量合成与胁迫耐受性之间取得平衡提供了新的见解。
图7: 与纬度相关的RAF SNP分析及RAF在叶绿体冷响应中功能的拟议工作模型
总 结
该研究鉴定了一个RAF类双激酶模块RAF3/6，作为叶绿体冷胁迫响应的关键介导因子。在正常生长条件下，RAF3/6分别定位于细胞质和质膜。冷胁迫下，RAF3/6在分子伴侣HSP70-1的介导下转位进入叶绿体，磷酸化光系统II组分D1和LHCB1，促进它们在类囊体膜上的重新分布及随后的降解，从而抑制光合活性。同时，RAF3/6磷酸化叶绿体-细胞核穿梭蛋白WHY1，促进其向细胞核积累并激活冷防御基因。值得注意的是，RAF6的天然变异含有一个与纬度相关的SNP，该SNP影响其叶绿体输入，提示其具有进化上的冷适应意义。综上所述，这些发现揭示了一条冷诱导的由外向内信号通路，将细胞质冷感知与叶绿体重塑及细胞核防御联系起来，建立了一个平衡能量生产与胁迫耐受性的概念框架。