做转录组研究时，经常会遇到两类棘手问题：RNA 测序结果和实验预期不一致；或者转录水平变化显著，但蛋白检测结果没有对应趋势。
很多科研人员遇到该问题会盲目重复实验，浪费样本与时间。本文从样本取材、测序深度、比对注释、转录本、实验体系、扰动响应六个层面，系统性梳理排查思路，遇到 RNA 与蛋白表达不匹配的同学可以对照自查。
1 样本和取材------最容易被跳过的一层
先说最重要的：先看样本，再看测序。 很多"不符预期"，最后追回来是取材本身的问题。
- ●组织不均一：一整块组织磨出来的 RNA，是里面所有细胞的平均值。比如肿瘤组织，肿瘤细胞占 30% 还是 50%，测出来的"差异"可能只是细胞比例变了，不是细胞真的变了。做组织样本的，最好配一张组织切片评估；
- ●细胞弄错了：细胞系身份要对一遍。买错、污染、传代太多次导致性状漂移，都会让结论整个跑偏------这是花五分钟能排除、却能省掉一个月的事；
- ●样本降解了：RNA 放久了会断。断得厉害的样本，测出来会偏 3' 端，本来表达正常的基因，看着就像"表达下降"。
怎么判断 ：先做 PCA。如果同一组的样本之间差别，比两组之间的差别还大，别往下做差异分析了，回去查样本。
2 测序深度------测得不深，差异是"抽"出来的
低表达基因，本来就时灵时不灵。 测序量不够的时候，同一个基因可能这批样本测到了、那批没测到，到了差异分析里，就成了假阳性或者假阴性。
怎么判断 ：挑几个你在意的基因，看看它们的检出情况在重复样本里是不是一致。不一致，就补测序量或者换更深的方案------别急着解读数据。
3 比对和注释版本------"这个基因测不到"的技术原因
有些基因测不到，跟生物学一点关系都没有，纯粹是技术问题。
最常见的是参考版本不统一：比如两批数据用了不同版本的注释文件，新发现的转录本在老版本里根本不存在，测到的读数就被丢到一个"空坐标"上，看起来就是没表达。比对率异常低，还要考虑污染或者参考序列选错了。
怎么判断：看一眼比对率是否正常，再确认所有数据的参考版本和注释版本是不是同一套。特别是不同时间点、不同人做的数据，最容易混版本。
4 转录本------总量没问题，功能解释不通
前三层都干净了，数据还是不对劲，就轮到这一层。这一层最容易被漏掉。
同一个基因，可以做出好几种转录本。 常规测序只算这个基因的总账，不区分是哪几种。
一个真实案例（Communications Biology，IF 5.8）：同一批阿尔茨海默病脑组织，研究者分了两路------一路用常规短读长测序，算"基因总量"；一路用长读长测序，数"每种转录本各占多少"。
结果很有意思：SEPTIN4 这个基因，在常规测序的差异基因列表里完全找不到。 换成能分转录本的方法一看才明白------它的一种转录本在病人里明显减少，另一种转录本却明显增多，一个减一个加，加起来正好抵消。所以从"总量"上看，它毫无变化。研究者又用 RT-PCR 一个个样本验证过，两种转录本确实都真实存在。
SEPTIN4 一减一加互相抵消
什么时候该往这一层查：① 差异分析结果和你的表型方向相反，或者该出现的基因没出现；② 配对样本里，总量变化解释不了功能变化；③ 你研究的正好是 HER2、EGFR、MET、ALK 这类容易做出多种转录本的基因。
要查这一层，可以按需要选 ：想看一个基因到底有几种转录本 ，用全长转录组测序（ONT-lrRNA-seq）；想同时看poly(A) 尾长和 APA 位点 （APA 指同一个基因在不同位置截断，做出长短不一的结尾），用含 poly(A) 尾全长转录组测序（ONT-PAIrRNA-seq）------这条路测的是尾巴，看不到 RNA 修饰 ；想看 RNA 修饰 （m6A/m5C 这类），用直接 RNA 测序（ONT-DRS）；想看每个细胞分别用了哪种转录本，用单细胞三代全长转录组测序。
5 实验体系------体系不对，照样出反结论
RNA 测对了，体系不对，结论还是错的。
- ●细胞系差异：同一条通路，在两个细胞系里方向相反，是很常见的事（遗传背景不同）。只做一个细胞系就下结论，要小心；
- ●抗体对不上 ：抗体不专一，或者它识别的那一段正好在不同转录本之间有差别，WB 和 IHC 的条带就会和预期不符。所以"这个抗体认的是哪种转录本"，本身就值得先确认一下------有些转录本缺了抗体识别的位点，条带自然出不来，这不是实验做坏了；
- ●批次效应：不同批试剂、不同人操作，会把技术差别混进生物学差别里。
怎么判断：换一套独立体系、或者换一个识别位点不同的抗体，再复现一遍。两套都做不出来，这个结论先存疑。
6 扰动响应------敲低没反应，不一定是没敲掉
这层最容易误判。 敲低或给药之后表型没变化，第一反应往往是"没敲掉"或者"药没用"，但也可能是下面几种：
- ●代偿：这个基因被压下去了，通路里别的成员顶上来，表型被兜住了；
- ●功能相似可替代：同一家族里有几个基因干相似的活，敲掉一个看不出变化；
- ●靶点根本没表达：你以为它在，其实它不在------这是最该先确认的一件事。
怎么判断 ：先用 qPCR 确认敲低效率，再补一层蛋白证据（WB，或者单细胞蛋白组 AbSeq）。RNA、蛋白、表型三层都对上了，结论才站得住。
总结：就按这个顺序查
样本 → 深度 → 注释 → 转录本 → 体系 → 扰动。
顺序别乱：前面的层出问题，后面的层怎么查都查不出来。 大多数"不符预期"，在第 1、2 层就能找到原因。前三层干净、总量也对，才轮到转录本。
你手头有没有"RNA 和蛋白对不上"的经历？留言说说现象。