一、CRISPAR-CAS9原理
CRISPAR-cas9系统敲降原理分为三步：
**1-**识别：向导RNA (gRNA)与目标DNA序列互补配对
(如P53****的编码序列) ，gRNA引导Cas9蛋白找到特定的切割位点。gRNA由CRISPR RNA (crRNA)和反式激活crRNA（tracrRNA）组成，就像一个"导航系统"，带着Cas9蛋白在三碱基对PAM区域周围准确找到目标。
**2-**切割：
Cas9蛋白在找到目标后，像剪刀一样切断DNA双链，造成DNA双链断裂(DSB)。
**3-**修复：
DSBs刺激细胞修复系统启动，主要是非同源末端连接 (NHEJ，精确修复)或同源导向修复(HDR)。在修复过程中，可能发生插入或缺失，实现基因功能性沉默，或通过提供特定的DNA模板，实现对基因的精确编辑。
CRISPR/Cas9 application in cancer therapy: a pioneering genome editing tool.
Cell Mol Biol Lett 27, 35 (2022).
二、如何确认一个质粒敲掉的是基因的哪个外显子呢？
以PX330-P53质粒为例
1. 确认sgRNA序列，一般在gRNA scaffold前边，一般20bp左右。
2. 将靶向序列复制粘贴进BLAST网站，输出结果如下，Download All下载文件后，得到匹配序列的具体信息位置
3. 将Chr11: 69477751-69477771输入UCSC网站，得到该sgRNA靶向的是小鼠的P53第二外显子。
三、如何验证该基因是否敲掉了？
敲降某个基因设计sgRNA时，一个质粒中可以设计一个或两个sgRNA。
单sgRNA在基因组产生一个双链断裂(DSB)，导致小片段插入或缺失，一般导致移码突变Ⅹ基因功能丧失；双sgRNAs在基因组产生两个DSBs，删除两个靶点间序列导致大片段缺失。
（一）基因层面：PCR
提取目标样本DNA，进行PCR后，①凝胶电泳，敲除条带更浅(这种方法不一定可行)②sanger测序看峰图，突变样本可能出现混合峰图，阴性对照样本应该是单个峰图（推荐sanger测序）。
（二）蛋白层面：WB/IHC
直接提蛋白跑电泳或做IHC，文献显示，小鼠样本中，crispar-cas敲除效率只有大概3%。